農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法1農(nóng)桿菌感染柳樹產(chǎn)生冠癭瘤農(nóng)桿菌2原理：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。原理：3因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的4農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件5農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件6Story冠癭瘤病：雙子葉植物經(jīng)常發(fā)生，因腫瘤著生地面在近地面的根莖交界處，形似帽狀而得名。1907年，Smith&Townsent

農(nóng)桿菌誘發(fā)冠癭瘤病。1947年，Braunetal.

證實倆者的關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)有的菌株不致病。提出了假說：tumour-inducingprinciple,TIP.腫瘤誘導(dǎo)因子。60’s,腫瘤組織中含高濃度的氨基酸（octopine,nopaline）總稱冠癭堿（opine)。Petitetal.證實腫瘤組織合成的冠癭堿取決于菌株，而且菌株能專一地利用冠癭堿作為菌株生存的唯一的碳源和氮源。(證實了TIP)Story71974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.從致瘤農(nóng)桿菌中分離出一類巨大的質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)，稱為Ti質(zhì)粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子雜交技術(shù)證實腫瘤細胞中存在外源的DNA,與Ti質(zhì)粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA片段，

T-DNA

(transferredDNA),其內(nèi)有致瘤和冠癭堿合成酶等基因。1981年，Oomsetal.發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒上有致瘤區(qū)(virulenceregion)，Vir區(qū)。1974年，Zaenenetal,Schell,Va8Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌細胞核外存在的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，長度約200kb，平均周長54.1－75.4um，分子質(zhì)量為（90－150）×106Da。在溫度低與30℃的條件下，Ti質(zhì)粒可穩(wěn)定地存在于根癌農(nóng)桿菌細胞內(nèi)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件9農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件10Ti質(zhì)粒除上述上述誘導(dǎo)受侵染的植物組織產(chǎn)生冠癭瘤外，還具有以下幾種重要功能：1、賦予根癌農(nóng)桿菌附著于植物細胞的能力；2、賦予根癌農(nóng)桿菌分解代謝冠癭堿的能力；3、根癌農(nóng)桿菌的寄主植物范圍；4、決定所誘導(dǎo)的冠癭形態(tài)和冠癭堿的成分；5、參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸和一些細胞分裂素的代謝活。

Ti質(zhì)粒除上述上述誘導(dǎo)受侵染的植物組織產(chǎn)生冠癭瘤外，還具有以111)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)來自于不同野生型根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?？筛鶕?jù)其產(chǎn)生的冠癭堿類型分為三類：章魚堿(octopine)類胭脂堿(nopaline)類農(nóng)桿堿（agropine）類。Ti質(zhì)粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應(yīng)基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達，它們只有進入植物細胞后才能表達，Ti質(zhì)粒上的冠癭堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿，為宿主細胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)12農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件13長度：160-250kb6大功能區(qū)：1)致瘤區(qū)，這個區(qū)主要合成植物生長素和細胞分裂素；2)冠癭堿合成區(qū)；3)冠癭堿分解區(qū)；4)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)；5)毒性區(qū)（Vir）；6)DNA復(fù)制區(qū)（Rep）。長度：160-250kb14在致瘤區(qū)、冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個24bp直接重復(fù)序列，由這三部分所構(gòu)成的DNA區(qū)域叫做T-DNA。致瘤區(qū)+冠癭堿+左右邊界=T-DNA插入植物染色體中的Ti質(zhì)粒片段只有T-DNA。T-DNA區(qū)域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達.T-DNA在致瘤區(qū)、冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個24bp直接重復(fù)序列15T-DNA：Tms1、Tms2、Tmr這3個基因表達植物生長素和細胞分裂素,可調(diào)節(jié)植物細胞的生長和發(fā)育,它們的過量表達刺激植物細胞大量快速增長而形成冠癭。冠癭堿合成基因在宿主植物體內(nèi)合并分泌出來,被Ti質(zhì)粒上的冠癭堿代謝基因分解成碳源和氮源，供根癌農(nóng)桿菌生長所須。T-DNA：16脂堿型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右兩側(cè)是一段24bp的重復(fù)序列,構(gòu)成T-DNA的左邊界和右邊界。在某些章魚堿型根癌農(nóng)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA是以兩個分開的獨立片段形式存在，即T-DNA左邊區(qū)段和T-DNA右邊區(qū)段。插入在T-DNA邊界序列之間的任何DNA都可被轉(zhuǎn)到植物染色體中。因此Ti質(zhì)粒可用做外源目的基因的載體。脂堿型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右兩側(cè)是一段24bp17

Vir區(qū)（Vir-region）：即毒性區(qū)。其長度約為35kb?？刂聘┺r(nóng)桿菌附著于植物細胞和Ti質(zhì)粒進入細胞有關(guān)部位，與感染后冠癭形成有關(guān)。Vir區(qū)位于T-DNA區(qū)左側(cè)，包含義個毒性遺傳點（virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG）。vir基因控制著Ｔ－ＤＮＡ的轉(zhuǎn)移。virＥvirＤvirC

virG

virＢvirAVir區(qū)（Vir-region）：即毒性區(qū)。其長度約18農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件19農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件20農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件21植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農(nóng)桿菌對這一類物質(zhì)具有趨化性，在植物細胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達。植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子22目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種信號因子，均為水溶性酚類化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羥基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用較強，兒茶酚、原兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚和對羥基苯酚處理農(nóng)桿菌時也對Vir區(qū)的基因表達起促進作用。雙子葉植物在在農(nóng)桿菌侵染時可以形成大量的信號因子，而使T-DNA可以成功的轉(zhuǎn)入；而單子葉植物需要加入外源酚類物質(zhì)，才能激活Vir區(qū)的基因，達到轉(zhuǎn)基因的目的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種信號因子，均為水溶性酚類化合物。其中乙酰丁香23最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區(qū)，可接受環(huán)境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達，virG蛋白經(jīng)磷酸化由非活性態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進而激活vir區(qū)其他基因表達。virA基因——virG基因最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜24virD基因產(chǎn)物：virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谛蜖顟B(tài)；virD2蛋白則能切割已呈松弛態(tài)的T-DNA，2個邊界產(chǎn)生缺口，使單鏈T-DNA得以釋放。VirE基因所表達的virE2蛋白是單鏈T-DNA結(jié)合蛋白?？墒筎-DNA形成1個細長的核酸蛋白復(fù)合物（T-復(fù)合體），以此保護T-DNA不被包內(nèi)外的核酸酶降解。virD基因產(chǎn)物：25農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件26小結(jié):植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農(nóng)桿菌對這一類物質(zhì)具有趨化性，在植物細胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達。小結(jié):27最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區(qū)，可接受環(huán)境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達，virG蛋白經(jīng)磷酸化由非活性態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進而激活vir區(qū)其他基因表達。其中virD基因產(chǎn)物virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谛蜖顟B(tài)；而virD2蛋白則能切割已呈松弛態(tài)的T-DNA，2個邊界產(chǎn)生缺口，使單鏈T-DNA得以釋放。VirE基因所表達的virE2蛋白是單鏈T-DNA結(jié)合蛋白?？墒筎-DNA形成1個細長的核酸蛋白復(fù)合物（T-復(fù)合體），以此保護T-DNA不被包內(nèi)外的核酸酶降解。T-復(fù)合體依次穿過根癌農(nóng)桿菌和植物細胞膜及細胞壁。并進入植物細胞核，最終整合進入植物核基因組。T-DNA的轉(zhuǎn)移機理比較復(fù)雜，依賴于T-DNA區(qū)和vir區(qū)共同參與，涉及多個基因表達及一系列蛋白質(zhì)和核酸的相互作用。最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜28Table1SummaryofvirGeneProducts

Locus

Size(kb)

ORFsaProteinsSize(kDa)Locationb

FunctionvirA2.0190Mplantsignalsensor,proteinkinaseVirG1.0130CtranscriptionalactivatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNAborderendonuclease(VirD1andVirD2);pilotprotein?nuclearlocalization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processingofT-DNA(VirC1)VirE2.027,60.5C/M?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)

virB9.51126,12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNAtransferapparatus?Table1SummaryofvirG29③T-DNA加工和轉(zhuǎn)移

Vir基因表達調(diào)控的問題，知道VirA和VirG基因誘導(dǎo)其它Vir基因的表達，當(dāng)VirD操縱元的被誘導(dǎo)表達后，其中的VirD1和VirD2蛋白質(zhì)具有核酸內(nèi)切酶的活性(Yanofsky

M．F.

1986)，能夠在T-DN

A邊界重復(fù)序列的特異位點切開T-DNA單鏈，因此T-DNA往往以單鏈形式進入植物細胞。但是在植物細胞中也發(fā)現(xiàn)雙鏈T-DNA分子。③T-DNA加工和轉(zhuǎn)移30切刻位點(nick

site)可作為DNA從5’向3'合成的起始位點，新的DNA鏈合成后，T-DNA單鏈即被替換(displacement)釋放出來(圖2)。當(dāng)然這種缺刻也可通過重組系統(tǒng)把T-DNA雙鏈從Ti質(zhì)粒上解離下來。切刻位點(nick

site)可作為DNA從5’向3'合成的31缺失研究也表明：右邊界重復(fù)序列缺失后，T-DNA不能轉(zhuǎn)移，而左邊界重復(fù)序列的缺失會稍稍降低T-DNA轉(zhuǎn)移頻率(Timmerman

B．1988)，這進一步說明T-DNA單鏈是在從右邊界到左邊界5’向3‘替換合成中釋放出來的。缺失研究也表明：右邊界重復(fù)序列缺失后，T-DNA不能轉(zhuǎn)移，而32右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放，所以T-DNA不能轉(zhuǎn)移到植物細胞。而左邊界的缺失，僅會影響DNA合成過程的終止，可能會降低導(dǎo)致T-DNA單鏈釋放，而不會明顯影響T-DNA單鏈的形成。右邊界的缺失，使得DNA合成不能起始，因而T-DNA不能釋放33可見T-DNA左邊界序列作為合成DNA的起始位點的效率比右邊界序列低。這種不同不是由于左右邊界的24bp重復(fù)序列核苷酸不同，而是由于靠近右邊界位置有一個轉(zhuǎn)移增強子(transfer

enhancer；overdriver．Peralta

EG．1986)存在。這個T-DNA轉(zhuǎn)移增強序列能極其明顯的增加農(nóng)桿菌中T-DNA鏈形成，并且這種作用與它的位置、方向及距離均無關(guān)系。增強子的缺失能夠使農(nóng)桿菌對宿主植物的毒性降低。Toro等人發(fā)現(xiàn)VirC1蛋白能特異性的結(jié)合這個增強子，VirC操縱元的突變也能導(dǎo)致農(nóng)桿菌的毒性減弱。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件34當(dāng)T-DNA單鏈進入植物細胞后，植物細胞如何處理這些單鏈DNA？Paul等

人利用電轉(zhuǎn)移法把單鏈DNA轉(zhuǎn)化到煙草原生質(zhì)體中，結(jié)果表明，在植物細胞中，

單鏈DNA迅速轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA分子。此外單鏈DNA比雙鏈DNA的轉(zhuǎn)化效率更

高。然而T-DNA分子并非以裸露的單鏈DNA形式進入植物細胞的。T-DNA單鏈

的5’端共價的結(jié)合著VirD2蛋白質(zhì)，從而保護T-DNA分子免受外切核酸酶的降

解，此外VirD2蛋白質(zhì)上含有核定位的序列，所以結(jié)合在T-DNA

5'端的VirD2

蛋白質(zhì)象一個“導(dǎo)向儀”(pilot)指引并保護T-DNA進入植物細胞核中。VirE2蛋白

質(zhì)是一種單鏈結(jié)合蛋白質(zhì)，能夠包裹T-DNA單鏈，和其它T-DNA結(jié)合蛋白質(zhì)共

同構(gòu)成了T-復(fù)合體。當(dāng)T-DNA單鏈進入植物細胞后，植物細胞如何處理這些單鏈DN35冠癭堿分解區(qū)冠癭堿分解區(qū)36冠癭也是在冠癭堿胞內(nèi)合并成分泌出來的,被冠癭堿分解基因分解成根癌農(nóng)桿菌生長所須的碳源和氮源。冠癭也是在冠癭堿胞內(nèi)合并成分泌出來的,被冠癭堿分解基因分解成37農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法38農(nóng)桿菌感染柳樹產(chǎn)生冠癭瘤農(nóng)桿菌39原理：根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進入細胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。原理：40因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實現(xiàn)外源基因向植物細胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，近年來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的41農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件42農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件43Story冠癭瘤?。弘p子葉植物經(jīng)常發(fā)生，因腫瘤著生地面在近地面的根莖交界處，形似帽狀而得名。1907年，Smith&Townsent

農(nóng)桿菌誘發(fā)冠癭瘤病。1947年，Braunetal.

證實倆者的關(guān)系，但發(fā)現(xiàn)有的菌株不致病。提出了假說：tumour-inducingprinciple,TIP.腫瘤誘導(dǎo)因子。60’s,腫瘤組織中含高濃度的氨基酸（octopine,nopaline）總稱冠癭堿（opine)。Petitetal.證實腫瘤組織合成的冠癭堿取決于菌株，而且菌株能專一地利用冠癭堿作為菌株生存的唯一的碳源和氮源。(證實了TIP)Story441974年，Zaenenetal,Schell,VanLarebekeetal.從致瘤農(nóng)桿菌中分離出一類巨大的質(zhì)粒(tumorinducingplasmid)，稱為Ti質(zhì)粒。

Ti=TIP1977年，Chiltonetal.分子雜交技術(shù)證實腫瘤細胞中存在外源的DNA,與Ti質(zhì)粒的DNA有同源性，是整合到了植物染色體的農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA片段，

T-DNA

(transferredDNA),其內(nèi)有致瘤和冠癭堿合成酶等基因。1981年，Oomsetal.發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒上有致瘤區(qū)(virulenceregion)，Vir區(qū)。1974年，Zaenenetal,Schell,Va45Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌細胞核外存在的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，長度約200kb，平均周長54.1－75.4um，分子質(zhì)量為（90－150）×106Da。在溫度低與30℃的條件下，Ti質(zhì)粒可穩(wěn)定地存在于根癌農(nóng)桿菌細胞內(nèi)。農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件46農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件47Ti質(zhì)粒除上述上述誘導(dǎo)受侵染的植物組織產(chǎn)生冠癭瘤外，還具有以下幾種重要功能：1、賦予根癌農(nóng)桿菌附著于植物細胞的能力；2、賦予根癌農(nóng)桿菌分解代謝冠癭堿的能力；3、根癌農(nóng)桿菌的寄主植物范圍；4、決定所誘導(dǎo)的冠癭形態(tài)和冠癭堿的成分；5、參與寄主細胞合成植物激素吲哚乙酸和一些細胞分裂素的代謝活。

Ti質(zhì)粒除上述上述誘導(dǎo)受侵染的植物組織產(chǎn)生冠癭瘤外，還具有以481)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)來自于不同野生型根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)?？筛鶕?jù)其產(chǎn)生的冠癭堿類型分為三類：章魚堿(octopine)類胭脂堿(nopaline)類農(nóng)桿堿（agropine）類。Ti質(zhì)粒攜帶著既能分解又能合成這些化合物的酶類和相應(yīng)基因，然而冠癭堿合成基因卻不能在根癌農(nóng)桿菌中表達，它們只有進入植物細胞后才能表達，Ti質(zhì)粒上的冠癭堿分解基因產(chǎn)物卻能分解冠癭堿，為宿主細胞提供能源、氮源和碳源。1)Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)49農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件50長度：160-250kb6大功能區(qū)：1)致瘤區(qū)，這個區(qū)主要合成植物生長素和細胞分裂素；2)冠癭堿合成區(qū)；3)冠癭堿分解區(qū)；4)Ti質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移區(qū)(tra)；5)毒性區(qū)（Vir）；6)DNA復(fù)制區(qū)（Rep）。長度：160-250kb51在致瘤區(qū)、冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個24bp直接重復(fù)序列，由這三部分所構(gòu)成的DNA區(qū)域叫做T-DNA。致瘤區(qū)+冠癭堿+左右邊界=T-DNA插入植物染色體中的Ti質(zhì)粒片段只有T-DNA。T-DNA區(qū)域中的這些基因只有在T-DNA插入到植物基因組后才能激活表達.T-DNA在致瘤區(qū)、冠癭堿合成區(qū)的兩側(cè)存在著一個24bp直接重復(fù)序列52T-DNA：Tms1、Tms2、Tmr這3個基因表達植物生長素和細胞分裂素,可調(diào)節(jié)植物細胞的生長和發(fā)育,它們的過量表達刺激植物細胞大量快速增長而形成冠癭。冠癭堿合成基因在宿主植物體內(nèi)合并分泌出來,被Ti質(zhì)粒上的冠癭堿代謝基因分解成碳源和氮源，供根癌農(nóng)桿菌生長所須。T-DNA：53脂堿型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右兩側(cè)是一段24bp的重復(fù)序列,構(gòu)成T-DNA的左邊界和右邊界。在某些章魚堿型根癌農(nóng)根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA是以兩個分開的獨立片段形式存在，即T-DNA左邊區(qū)段和T-DNA右邊區(qū)段。插入在T-DNA邊界序列之間的任何DNA都可被轉(zhuǎn)到植物染色體中。因此Ti質(zhì)?？捎米鐾庠茨康幕虻妮d體。脂堿型根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒中T-DNA的左右兩側(cè)是一段24bp54

Vir區(qū)（Vir-region）：即毒性區(qū)。其長度約為35kb。控制根癌農(nóng)桿菌附著于植物細胞和Ti質(zhì)粒進入細胞有關(guān)部位，與感染后冠癭形成有關(guān)。Vir區(qū)位于T-DNA區(qū)左側(cè)，包含義個毒性遺傳點（virA、virＢ、virC、virＤ、virＥ和virG）。vir基因控制著Ｔ－ＤＮＡ的轉(zhuǎn)移。virＥvirＤvirC

virG

virＢvirAVir區(qū)（Vir-region）：即毒性區(qū)。其長度約55農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件56農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件57農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件58植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農(nóng)桿菌對這一類物質(zhì)具有趨化性，在植物細胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達。植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子59目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種信號因子，均為水溶性酚類化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羥基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用較強，兒茶酚、原兒茶酚、沒食子酸、焦性沒食子酸、二羥基苯甲酸、香草酚和對羥基苯酚處理農(nóng)桿菌時也對Vir區(qū)的基因表達起促進作用。雙子葉植物在在農(nóng)桿菌侵染時可以形成大量的信號因子，而使T-DNA可以成功的轉(zhuǎn)入；而單子葉植物需要加入外源酚類物質(zhì)，才能激活Vir區(qū)的基因，達到轉(zhuǎn)基因的目的。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9種信號因子，均為水溶性酚類化合物。其中乙酰丁香60最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區(qū)，可接受環(huán)境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達，virG蛋白經(jīng)磷酸化由非活性態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進而激活vir區(qū)其他基因表達。virA基因——virG基因最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜61virD基因產(chǎn)物：virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谛蜖顟B(tài)；virD2蛋白則能切割已呈松弛態(tài)的T-DNA，2個邊界產(chǎn)生缺口，使單鏈T-DNA得以釋放。VirE基因所表達的virE2蛋白是單鏈T-DNA結(jié)合蛋白?？墒筎-DNA形成1個細長的核酸蛋白復(fù)合物（T-復(fù)合體），以此保護T-DNA不被包內(nèi)外的核酸酶降解。virD基因產(chǎn)物：62農(nóng)桿菌介導(dǎo)法課件63小結(jié):植物細胞受傷后，細胞壁破裂，分泌物中含有高濃度的創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子。它們是一些酚類化合物，如乙酰丁酮（acetosyringone，AS）和α-羥基酰丁香酮（α-hydroxacetosyringone，OH-AS）。根癌農(nóng)桿菌對這一類物質(zhì)具有趨化性，在植物細胞表面附著后，受這些創(chuàng)傷誘導(dǎo)分子的刺激，Ti質(zhì)粒vir區(qū)毒性基因被激活和表達。小結(jié):64最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜的疏水區(qū)，可接受環(huán)境中的信號分子。在virA蛋白的激活下，virG基因表達，virG蛋白經(jīng)磷酸化由非活性態(tài)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，進而激活vir區(qū)其他基因表達。其中virD基因產(chǎn)物virD1蛋白是一種DNA松弛酶，它可使DNA從超螺旋型轉(zhuǎn)變?yōu)樗沙谛蜖顟B(tài)；而virD2蛋白則能切割已呈松弛態(tài)的T-DNA，2個邊界產(chǎn)生缺口，使單鏈T-DNA得以釋放。VirE基因所表達的virE2蛋白是單鏈T-DNA結(jié)合蛋白?？墒筎-DNA形成1個細長的核酸蛋白復(fù)合物（T-復(fù)合體），以此保護T-DNA不被包內(nèi)外的核酸酶降解。T-復(fù)合體依次穿過根癌農(nóng)桿菌和植物細胞膜及細胞壁。并進入植物細胞核，最終整合進入植物核基因組。T-DNA的轉(zhuǎn)移機理比較復(fù)雜，依賴于T-DNA區(qū)和vir區(qū)共同參與，涉及多個基因表達及一系列蛋白質(zhì)和核酸的相互作用。最先激活表達的是virA基因，它編碼感受蛋白，位于細菌細胞膜65Table1SummaryofvirGeneProducts

Locus

Size(kb)

ORFsaProteinsSize(kDa)Locationb

FunctionvirA2.0190Mplantsignalsensor,proteinkinaseVirG1.0130CtranscriptionalactivatorVirD4.5416,47,21,75C/M?T-DNAborderendonuclease(VirD1andVirD2);pilotprotein?nuclearlocalization?(VirD2)VirC2.0226,23C?processingofT-DNA(VirC1)VirE2.027,60.5C/M?single-strandDNA-bindingprotein(VirE2)

virB9.51126,12,11,87,23,32,5.5,25,32,48,38MT-DNAtransferapparatus?Table1SummaryofvirG66③T-DNA加工和轉(zhuǎn)移

Vir基因表達調(diào)控的問題，知道VirA和VirG基因誘導(dǎo)其它Vir基因的表達，當(dāng)VirD操縱元的被誘導(dǎo)表達后，其中的VirD1和VirD2蛋白質(zhì)具有核酸內(nèi)切酶的活性(Yanofsky

M．F.

1986)，能夠在T-DN

A邊界重復(fù)序列的特異位點切