第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法演示文稿第一頁(yè)，共八十九頁(yè)。優(yōu)選第三章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第二頁(yè)，共八十九頁(yè)。第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）

電子顯微鏡技術(shù)

(Electromicroscopy)

掃描探針顯微鏡（ScanningProbeMicroscope）

掃描遂道顯微鏡

(scanningtunnelingmicroscope)第三頁(yè)，共八十九頁(yè)。一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy)最早的光學(xué)顯微鏡是1590年Janssen和他的侄子共同研制的。其后，RobertHooke和Leeuwenhoek對(duì)光學(xué)顯微鏡的分辨本領(lǐng)進(jìn)行了極大的改進(jìn)，由此發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞。20世紀(jì)30年代發(fā)展起來的電子顯微鏡導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能研究發(fā)生了一次革命，使生物學(xué)家得以從亞顯微水平上重新認(rèn)識(shí)細(xì)胞。第四頁(yè)，共八十九頁(yè)。第五頁(yè)，共八十九頁(yè)。光學(xué)和電子顯微鏡成像原理不管是何種顯微鏡，鏡像的形成都需要三個(gè)基本要素:①照明系統(tǒng)，②被觀察的樣品，③聚焦和成像的透鏡系統(tǒng)。第六頁(yè)，共八十九頁(yè)。透射第七頁(yè)，共八十九頁(yè)。●焦距與角孔徑焦距(focallength)是透鏡的中心平面到焦點(diǎn)的距離，而角孔徑(angularaperture)是光從樣品進(jìn)入顯微鏡的物鏡半角α，因此角孔徑實(shí)際表示有多少光離開樣品通過透鏡。第八頁(yè)，共八十九頁(yè)。角孔徑越大，透過透鏡的信息越多第九頁(yè)，共八十九頁(yè)。分辨率:透鏡最重要的性質(zhì)就是它的分辨率，分辨率(R)可用以下公式計(jì)算:R=0.61λ/nSinα其中:n=聚光鏡和物鏡之間介質(zhì)的折射率.空氣為1.油為1.5;α=樣品對(duì)物鏡角孔徑的半角，sinα的最大值為1;λ=照明光源的波長(zhǎng)。0.61是一個(gè)恒定的參數(shù)，表示成像的點(diǎn)雖被重疊但仍能被區(qū)別的程度。從上式可知，角孔徑越大，進(jìn)入物鏡的光越多；介質(zhì)的折射率越大，則數(shù)值孔徑越大，這些都可以使分辨率提高。由于分辨率表示的是能夠區(qū)別兩個(gè)點(diǎn)間最近距離的能力，所以R值越小，分辨率越高。從分辨率的表達(dá)式來看，或者波長(zhǎng)越短，分辨率越高。

第十頁(yè)，共八十九頁(yè)。分辨極限(limitresolution)與放大率(magnification)對(duì)可見光來說，能清楚地分辨出相鄰兩點(diǎn)之間的最小間隔是0.2μm，稱之為分辨極限。最終成像的大小與原物體大小的比值稱為放大率。總放大率

=物鏡放大率×目鏡放大率，放大率同樣受分辨極限的限制。一般來說，光學(xué)顯微鏡的最大放大率只能是透鏡的數(shù)值孔徑的1000倍。由于透鏡的數(shù)值孔徑的范圍是，所以光學(xué)顯微鏡在用空氣作介質(zhì)時(shí)最大放大倍數(shù)為1000倍，用油鏡則為1400倍。第十一頁(yè)，共八十九頁(yè)。增大角孔徑或縮短波長(zhǎng)可提高光學(xué)顯微鏡的分辨率。如果用波長(zhǎng)比普通波長(zhǎng)短得多的電子波代替光波，分辨率可大大提高，電子顯微鏡就是在這種需求下被發(fā)明的。表電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡的基本區(qū)別

分辨本領(lǐng)光源透鏡真空光學(xué)顯微鏡300nm可見光玻璃透鏡不需真空200nm(油鏡)可見光玻璃透鏡不需真空100nm紫外光玻璃透鏡不需真空電子顯微鏡0.1nm電子束電磁透鏡真空第十二頁(yè)，共八十九頁(yè)。1、

常用的光學(xué)顯微鏡光學(xué)顯微鏡(lightmicroscope)是光學(xué)顯微技術(shù)的主要工具，自問世以來已有400多年歷史。光學(xué)顯微鏡是利用光線照明，使微小物體形成放大影像的儀器?，F(xiàn)今使用的光學(xué)顯微鏡都是由幾個(gè)透鏡組合而成，所以又稱為復(fù)合顯微鏡。第十三頁(yè)，共八十九頁(yè)。普通雙筒顯微鏡比較高級(jí)的顯微鏡上都設(shè)有傾斜式的雙目鏡筒。在物鏡轉(zhuǎn)換器上方裝有四個(gè)棱鏡，使經(jīng)過物鏡的光線平分為兩路到達(dá)目鏡，故雙筒顯微鏡的亮度要比單筒者為暗。雙筒顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)為同時(shí)用兩眼觀察，有較強(qiáng)的立體感。第十四頁(yè)，共八十九頁(yè)?；緲?gòu)造：光學(xué)放大系統(tǒng)、照明系統(tǒng)、機(jī)械和支架系統(tǒng)第十五頁(yè)，共八十九頁(yè)。石蠟切片技術(shù)第十六頁(yè)，共八十九頁(yè)。熒光顯微鏡技術(shù)（FluorescenceMicroscopy）熒光顯微鏡的工作原理是利用紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等)發(fā)出強(qiáng)烈的紫外線光源，通過照明設(shè)備把顯微固定的切片或活染的細(xì)胞透視出來。第十七頁(yè)，共八十九頁(yè)。第十八頁(yè)，共八十九頁(yè)。熒光顯微鏡原理第十九頁(yè)，共八十九頁(yè)。第二十頁(yè)，共八十九頁(yè)。

相差顯微鏡(phasecontrastmicroscope)相差顯微鏡在結(jié)構(gòu)上進(jìn)行了特別設(shè)計(jì)，尤其是光學(xué)系統(tǒng)有很大的不同，可用于觀察未染色的活細(xì)胞。相差顯微鏡是能將物體本身的相位差轉(zhuǎn)換為振幅差的顯微鏡。在普通光鏡下觀察標(biāo)本時(shí)，是靠顏色（波長(zhǎng)）和亮度（振幅）的差別而看到被檢物體的結(jié)構(gòu)，而活細(xì)胞近于無色透明，光波通過不吸收光，振幅變化不大，故人眼感覺不到，為解決這一難題，30年代（1934—1935）荷蘭物理學(xué)家Zernike設(shè)計(jì)制造出相差顯微鏡，并用此而獲1953年諾貝爾獎(jiǎng)。

第二十一頁(yè)，共八十九頁(yè)。相差顯微鏡的光學(xué)部件及光線通路第二十二頁(yè)，共八十九頁(yè)。相差顯微鏡觀察的活細(xì)胞第二十三頁(yè)，共八十九頁(yè)?！霭狄曇帮@微鏡(darkfieldmicroscope)暗視野顯微鏡是利用特殊的聚光器使照明光線不能進(jìn)入物鏡被放大，在黑暗的背景下呈現(xiàn)明亮的像。這種特殊的照明方式，使反差增大，分辨率提高，用以觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子。暗視野顯微鏡主要觀察的是物體的輪廓，分辨不清內(nèi)部的微細(xì)構(gòu)造，適合于觀察活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核、線粒體、液體介質(zhì)中的細(xì)菌和霉菌等。第二十四頁(yè)，共八十九頁(yè)。暗視野顯微鏡的光學(xué)第二十五頁(yè)，共八十九頁(yè)。倒置顯微鏡倒置顯微鏡的結(jié)構(gòu)組成與普通顯微鏡一樣，所不同的只是它的物鏡與照明系統(tǒng)的位置顛倒過來。前者置于載物臺(tái)之下，而后者在載物臺(tái)的上方。集光器與載物臺(tái)之間的工作距離提高。可以放置培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等容器，直接對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行照明和觀察。第二十六頁(yè)，共八十九頁(yè)。第二十七頁(yè)，共八十九頁(yè)。光學(xué)顯微鏡的樣品制備與觀察由于大多數(shù)細(xì)胞的成分不影響光線的穿透，無法形成反差，所以在一般光學(xué)顯微鏡下，幾乎看不清未經(jīng)處理的細(xì)胞。為了看清細(xì)胞內(nèi)含物，就必須對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行一些特殊的處理，為此建立和發(fā)展了樣品的各種制備技術(shù)。

樣品的固定(fixation)目的:

生物組織在染色前先進(jìn)行固定的目的是殺死細(xì)胞，穩(wěn)定細(xì)胞的化學(xué)成份，并且使樣品硬化以便在進(jìn)一步的處理和切片時(shí)不會(huì)受到破壞第二十八頁(yè)，共八十九頁(yè)。做法:

樣品固定的最簡(jiǎn)單做法是將樣品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯(lián)而保持在一定的位置上，不致于在以后的染色等處理過程中移位或丟失而產(chǎn)生人工假象。一般用具有緩沖作用的醛類固定液，用甲醛或戊二醛作固定劑，能夠與蛋白質(zhì)的游離氨基形成共價(jià)鍵，從而將鄰近的蛋白質(zhì)分子牢固地交聯(lián)在一起。第二十九頁(yè)，共八十九頁(yè)。包埋和切片樣品制備的第二步是將固定的組織制備成切片。樣品首先要被包埋在介質(zhì)中，通常用液態(tài)的石蠟或樹脂做包埋劑，使之滲入整塊組織，然后將之硬化成固體的包埋塊；用專門的切片機(jī)切割包埋塊，制備成薄切片。適用于光學(xué)顯微鏡觀察的切片厚度為

l-10μm。第三十頁(yè)，共八十九頁(yè)。第三十一頁(yè)，共八十九頁(yè)。染色(staining)大多數(shù)細(xì)胞總重量的70%是水，對(duì)可見光幾乎是透明的，只有很少的內(nèi)含物不透光。染色的目的就是給細(xì)胞的不同組分帶上可區(qū)別的顏色特征。19世紀(jì)初，發(fā)現(xiàn)某些有機(jī)染料可染生物組織，并對(duì)細(xì)胞特殊部位的著色具有選擇性。如蘇木精對(duì)負(fù)電荷分子有親和性，能顯示出細(xì)胞內(nèi)核酸的分布；酸性染料如伊紅可使細(xì)胞質(zhì)染色；蘇丹染料在脂肪中的溶解度比在乙醇中大，所以蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪著色。但對(duì)許多染料的特異性染色機(jī)理尚不清楚。

第三十二頁(yè)，共八十九頁(yè)。激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)

（LaserScanningConfocalMicroscopy）原理應(yīng)用： 排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng) 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7)，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)。第三十三頁(yè)，共八十九頁(yè)。第三十四頁(yè)，共八十九頁(yè)。2、電子顯微鏡技術(shù)

自從第一臺(tái)電子顯微鏡在德國(guó)誕生以來，取得飛躍發(fā)展并在生物學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛的應(yīng)用。利用電鏡可以觀察到各種病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞器的微細(xì)結(jié)構(gòu)，還能觀察到許多生物大分子。目前的電鏡已由單純的形態(tài)描述進(jìn)入了成分分析、定性和定量分析。此外，將電鏡與計(jì)算機(jī)連用，對(duì)圖象進(jìn)行信息處理也取得了很大進(jìn)展。

總之，電鏡已成為研究生物學(xué)的有力工具，必將發(fā)揮越來越大的作用。第三十五頁(yè)，共八十九頁(yè)。1932年德國(guó)學(xué)者M(jìn)axKnolls和ErnstRuska發(fā)明了第一臺(tái)電子顯微鏡，開拓了超微世界，發(fā)現(xiàn)了許多光鏡下看不到的結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞膜、線粒體、細(xì)胞核、高爾基體、中心粒等細(xì)胞器的細(xì)微結(jié)構(gòu)。將在光學(xué)顯微鏡中觀察不到而只能在電子顯微鏡下觀察的結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)(submicroscopestructure)，或超微結(jié)構(gòu)(ultrastructure)。在種類上，電鏡可分為兩大類:透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡。第三十六頁(yè)，共八十九頁(yè)。電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領(lǐng)光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對(duì)光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對(duì)電子的散射和透射形成明暗反差光鏡與電鏡的主要區(qū)別：（1）光源不同：光鏡為可見光或紫外線；電鏡為電子束（2）透鏡不同：光鏡為玻璃；電鏡為電磁透鏡（3）真空（4）顯示記錄系統(tǒng)第三十七頁(yè)，共八十九頁(yè)。透射電子顯微鏡(TEM)透射電子顯微鏡主要是讓電子束穿透樣片而成像。電子顯微鏡基本結(jié)構(gòu)由三大部分組成∶電子光學(xué)系統(tǒng)(鏡筒)、真空系統(tǒng)、電子學(xué)系統(tǒng)(供電系統(tǒng))。電子光學(xué)系統(tǒng)由照明系統(tǒng)、樣品室、成像系統(tǒng)、觀察窗和記錄用的照相機(jī)等組成。由于電子顯微鏡必需在高度真空條件下進(jìn)行工作，陰極與陽(yáng)極之間會(huì)放電，燈絲也會(huì)因受到氧化或被陽(yáng)離子轟擊而縮短壽命，所以設(shè)計(jì)了真空系統(tǒng)。電子學(xué)系統(tǒng)即供電系統(tǒng)，需要高壓穩(wěn)壓。第三十八頁(yè)，共八十九頁(yè)。電鏡(透射電鏡)與光鏡光路圖比較第三十九頁(yè)，共八十九頁(yè)。電子顯微鏡的基本構(gòu)造第四十頁(yè)，共八十九頁(yè)。

掃描式電子顯微鏡

1940年，英國(guó)劍橋大學(xué)首先試制成功掃描電子顯微鏡。直到1965年，才有英國(guó)劍橋科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)出實(shí)用性強(qiáng)的商品掃描電鏡。由于掃描電鏡具有顯著的優(yōu)點(diǎn)，因此，幾十年來，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、古生物學(xué)、地質(zhì)學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、電子學(xué)以及勘察、冶金，機(jī)械與輕工業(yè)等領(lǐng)域，成為十分有用的研究工具。第四十一頁(yè)，共八十九頁(yè)。電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。CO2臨界點(diǎn)干燥法防止引起樣品變形的表面張力問題。第四十二頁(yè)，共八十九頁(yè)。第四十三頁(yè)，共八十九頁(yè)。主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片負(fù)染色技術(shù)冰凍蝕刻技術(shù)電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

第四十四頁(yè)，共八十九頁(yè)。超薄切片技術(shù)取材—前固定(4%戊二醛)-PBS洗殘余的戊二醛后固定(4°C,鋨酸)--脫水(乙醇或丙酮包埋(環(huán)氧樹脂)修片切片(600埃，銀色)染色(醋酸鈾與鉛鹽)觀察

第四十五頁(yè)，共八十九頁(yè)。●負(fù)染色(negativestainning)一些生物大分子組成的結(jié)構(gòu)，如病毒、線粒體基粒、核糖體和蛋白質(zhì)組成的纖維等可以通過負(fù)染色電鏡技術(shù)觀察其精細(xì)結(jié)構(gòu)，還可以從不同角度觀察三維結(jié)構(gòu)。

負(fù)染原理：又稱陰性反差染色，借助染色劑的襯托，增加背景對(duì)電子的散射，使樣品相對(duì)地透過較多的電子，最后在熒光屏上形成暗背景下的“亮像”。第四十六頁(yè)，共八十九頁(yè)?！癖鶅鰯嗔褟?fù)型和冰凍蝕刻是專門觀察樣品外表面的投影復(fù)型術(shù)第四十七頁(yè)，共八十九頁(yè)。一、顯微鏡的種類及原理5.透射電子顯微鏡；6.掃描電子顯微鏡能否用掃描電鏡來觀察樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，而用透射電鏡來觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)？冰凍蝕刻技術(shù)第四十八頁(yè)，共八十九頁(yè)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)第四十九頁(yè)，共八十九頁(yè)。3、掃描遂道顯微鏡掃描隧道顯微鏡由IBM公司瑞士蘇黎世研究所的兩位學(xué)者BinningG.和RohrerH.等在1981年發(fā)明的具有原子顯像力的顯微鏡，是根據(jù)量子力學(xué)中的隧道效應(yīng)原理而制成的。這種顯微鏡對(duì)生物、物理、化學(xué)等學(xué)科均有推動(dòng)作用，可用于研究表面的原子結(jié)構(gòu)和電子結(jié)構(gòu)，故于1986年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。第五十頁(yè)，共八十九頁(yè)。特點(diǎn)：（1）可對(duì)晶體或非晶體成像，無需復(fù)雜計(jì)算，且分辨本領(lǐng)高。（側(cè)分辨率為，縱分辨率可達(dá)0.01nm）；（2）可實(shí)時(shí)得到樣品表面三維圖象，可測(cè)量厚度信息；（3）可在真空、大氣、液體等多種條件下工作；非破壞性測(cè)量。（4）可連續(xù)成像，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察用途：納米生物學(xué)研究領(lǐng)域中的重要工具,在原子水平上揭示樣本表面的結(jié)構(gòu)。第五十一頁(yè)，共八十九頁(yè)。第五十二頁(yè)，共八十九頁(yè)。掃描隧道顯微鏡DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的建立是根據(jù)X射線衍射結(jié)果推導(dǎo)出來的，至今還沒有直接觀察DNA結(jié)構(gòu)的方法，所以對(duì)其中的微細(xì)結(jié)構(gòu)還不夠了解。用STM觀察了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)，見到

DNA分子上的大溝和小溝，并且了解DNA的結(jié)構(gòu)隨染色體長(zhǎng)度而異。第五十三頁(yè)，共八十九頁(yè)。第二節(jié)細(xì)胞組分的分析方法離心分離技術(shù)細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、酶、糖與脂類等的顯示方法特異蛋白抗原的定位與定性細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性放射自顯影技術(shù)定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)核酸分子雜交技術(shù)第五十四頁(yè)，共八十九頁(yè)。一、離心分離技術(shù)離心分離細(xì)胞組分是最常用的分離方法，因?yàn)椴煌募?xì)胞器和分子有不同的體積和密度，可在不同離心力的作用下沉降分離。用途：于分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物。差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分。密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離。第五十五頁(yè)，共八十九頁(yè)?！癫钏匐x心(differentialcentrifugation)主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細(xì)胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達(dá)到分離不同大小顆粒的目的。第五十六頁(yè)，共八十九頁(yè)。差速離心第五十七頁(yè)，共八十九頁(yè)。密度梯度離心第五十八頁(yè)，共八十九頁(yè)。二、細(xì)胞內(nèi)核酸、蛋白質(zhì)、

酶、糖與脂類等的顯示方法原理：利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。第五十九頁(yè)，共八十九頁(yè)。DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：利用酸水解去除細(xì)胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑反應(yīng)呈紫紅色。第六十頁(yè)，共八十九頁(yè)。第六十一頁(yè)，共八十九頁(yè)。多糖的顯示方法PAS（過碘酸希夫氏）反應(yīng)利用過碘酸的強(qiáng)氧化作用破壞糖分子的C-C鍵，使糖分子氧化產(chǎn)生雙醛基，自由的醛基與希夫試劑作用形成紫紅色產(chǎn)物。第六十二頁(yè)，共八十九頁(yè)。脂類物質(zhì)的顯示方法對(duì)脂類物質(zhì)的染色應(yīng)用的是物理的擴(kuò)散原理。蘇丹類染料是脂溶性染劑，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當(dāng)含有脂肪的標(biāo)本與蘇丹染料接觸時(shí)，它會(huì)脫離酒精而溶于脂類結(jié)構(gòu)中從而顯色。第六十三頁(yè)，共八十九頁(yè)。細(xì)胞中各種酶的顯示方法由于酶易受外界條件影響而變性失活。對(duì)酶的顯示一般采取間接的方法進(jìn)行，對(duì)可以與酶發(fā)生特異性結(jié)合的底物進(jìn)行染色從而達(dá)到顯示酶的目的。在實(shí)驗(yàn)的過程中需在盡量保持酶的活性。第六十四頁(yè)，共八十九頁(yè)。三、特異蛋白抗原的定位與定性免疫熒光技術(shù)： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限免疫電鏡技術(shù)：免疫膠體金技術(shù)

應(yīng)用：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。第六十五頁(yè)，共八十九頁(yè)。

細(xì)胞內(nèi)對(duì)于蛋白質(zhì)分子的定位技術(shù)包括免疫熒光、免疫印跡以及免疫電鏡等，這些技術(shù)都是基于免疫學(xué)中抗原抗體特異性反應(yīng)的原理而設(shè)計(jì)的。將抗體分子上加上不同的可供識(shí)別的標(biāo)記，從而顯示出某種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布和定位?？乖乖贵w特異性結(jié)合免疫熒光標(biāo)記免疫酶標(biāo)記第六十六頁(yè)，共八十九頁(yè)。免疫熒光技術(shù)第六十七頁(yè)，共八十九頁(yè)。第六十八頁(yè)，共八十九頁(yè)。免疫電鏡技術(shù)第六十九頁(yè)，共八十九頁(yè)。四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性

光鏡水平的原位雜交技術(shù)

（同位素標(biāo)記或熒光素標(biāo)記的探針）

電鏡水平的原位雜交技術(shù)

（生物素標(biāo)記的探針與抗生物素抗體相連的膠體金標(biāo)記結(jié)合）

PCR技術(shù)

第七十頁(yè)，共八十九頁(yè)。五、放射自顯影技術(shù)原理及應(yīng)用：利用同位素的放射自顯影，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行定性、定位與半定量研究；實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子進(jìn)行動(dòng)態(tài)和追蹤研究。步驟：前體物摻入細(xì)胞（標(biāo)記：持續(xù)標(biāo)記和脈沖標(biāo)記）

———放射自顯影第七十一頁(yè)，共八十九頁(yè)。放射自顯影第七十二頁(yè)，共八十九頁(yè)。六、定量細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)細(xì)胞顯微分光光度測(cè)定術(shù)

利用細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)對(duì)特異光譜的吸收，測(cè)定這些物質(zhì)（如核酸與蛋白質(zhì)等）在細(xì)胞內(nèi)的含量。

包括：紫外光顯微分光光度測(cè)定法；可見光顯微分光光度測(cè)定法流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體。第七十三頁(yè)，共八十九頁(yè)。流式細(xì)胞儀第七十四頁(yè)，共八十九頁(yè)。第三節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞工程與顯微操作技術(shù)一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)乃