、貼壁細(xì)胞總RNA提取:1、吸掉培養(yǎng)液，用PBS洗一遍？2、往培養(yǎng)皿中加入1ml,TRIzol,吹打幾次(每10cm2面積抑3.5cm直徑的培養(yǎng)板加1ml)3、移至1.5mlEP管，靜置5分鐘4、加入200ul三氯甲烷，震蕩混勻，室溫靜置5分鐘5、4度120001加達(dá)，離心15分鐘，取上清，約600ul6、加入500ul異丙醇，混勻后，靜置30分鐘？7、4度120001加達(dá)，離心15分鐘，棄上清8、加入1ml70%預(yù)冷酒精洗滌沉淀物9、4度7500r/min,離心5分鐘10、棄上清，自然晾干11、加入50U1DEPC水溶解，測(cè)OD值*鼠尾基因組DNA粗提?。?、100ullysisbufferforeachtail,and2ul10mg/mlPK,55℃,overnight.2、Then,100℃for10mintodenaturethePK,use0.5~1ullysateastemplatetodoPCR.Lysisbuffer:(storeat4℃)KCl0.5MTris0.1MNP-401%Tween-201%二、RT-PCR1、預(yù)變性體系12ul：TOC\o"1-5"\h\zTotalRNA2ulOligo(dT18)primer1ulDHwater9ul65℃5min速置冰上2、RT體系：20ul：預(yù)變性體系12ul5xbuffer4ulRNAaseinhibiter1ul10mdNTP2ulMMLV1ul42℃60min70℃5min12℃forever

3、3、PCR體系20ul：10xbuffer10mdNTPPrimer(F+R)稀釋后cDNA(50ul)Pfuddwater95℃3min、(95℃30s,0.5ul1ul(0.5ul+0.5ul)1ul0.2ul15.3ul55℃30s,72℃35s)x29cycle、72℃10min、12℃forever三、跑膠鑒定PCR產(chǎn)物：四、醇沉PCR產(chǎn)物：1、將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍體積預(yù)冷NaAC,3倍體積70%預(yù)冷乙醇，混勻3、一80℃靜置30min4、4度14000r/min,10min離心棄上清，加1ml70%預(yù)冷乙醇洗滌沉淀5、4度14000r/min,10min離心棄上清，自然晾干6、加入25-20ulddwater吹勻靜置10-20min待溶解五、原始質(zhì)粒/PCR醇沉產(chǎn)物雙酶切體系50ul：Enzyme11ulEnzyme21ul10xBuffer5ul（在體系中被稀釋成1x）10xBSA5ul（看需要）Template1ugADDddwaterto50ul酶切過夜？六、單獨(dú)鑒定質(zhì)粒酶切產(chǎn)物：1、采用20ul體系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）酶切2h2、跑膠鑒定七、電泳，切膠回收與純化：使用DNA回收試劑盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）PCR酶切產(chǎn)物純化：.將PCR產(chǎn)物于需要的電壓和電流下跑電泳.紫外燈下仔細(xì)切下含待回收DNA的凝膠，置1.5ml離心管中，稱重。.加入BufferQG（每100mg凝膠加）,置50℃水海10min,每隔3,min渦旋一次至完全溶解，若回收片段小于500bp或大于4kb,則需加入異丙醇（每100mg凝膠加異丙醇1001），混勻。.加10u1NaAc調(diào)pH值（至＜7.5.），混勻。若液體顏色同QG，則無需調(diào)pH值。.將小柱放在2ml收集管上，將上述溶液加于柱上,靜置3分鐘,可分次做，每次不超過800u1。.4℃離心12000rpmx1min，棄去收集管中液體。.加入500lBufferQG于柱上，4℃離心12000rpmx1min，棄去收集管中液體。.加入750lBufferP于柱上，靜置3min，4℃離心12000rpmx1min，棄去收集管中液體。.4℃離心12000rpmx1min。棄去收集管。空柱離心？靜置20-30min。.將柱放于一新1.5ml離心管上，加50lBufferB或水于柱上。放置1min，4℃離心17900rpmx1min。.測(cè)濃度，可取51回收DNA電泳檢測(cè)鑒定。注意事項(xiàng)：紫外燈下切下含待回收DNA的凝膠時(shí)，要襯以干凈的塑料薄膜，使用無DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。載體純化：1、膠回收載體酶切產(chǎn)物，方法同PCR酶切產(chǎn)物膠回收。2、CIAP體系60ul：Vector50ulBuffer6ul（占1/10體系）Cip1ulddwater3ul混勻，37℃90min3、進(jìn)一步純化：①加入3倍與cip體系體積的BufferII，置50℃水浴10min,每隔3,min渦旋一次。②將小柱放在2ml收集管上，將上述溶液加于柱上，靜置3分鐘。③4℃離心12000rpmx1min，棄去收集管中液體。④加入500ulwashsolution12000rpmx1min棄液體。⑤再加入500ulwashsolution12000rpmx1min棄液體。⑥空柱離心12000rpmx30s⑦將柱放于一新1.5ml離心管上，開蓋靜置20-30min，加50lBufferB，50℃水浴3分鐘。⑧4℃離心17900rpmx1min。⑨測(cè)濃度。八、連接：體系20ul：TOC\o"1-5"\h\z10XDNALigaseBuffer2ulDNALigase1ulVector0.03pmolInsert0.09?0.3pmolNuclease-freewaterto20ulX℃、Xhours①Ipmol的1000bp大小的DNA片段質(zhì)量約為0.66ug即：66ng②vector：insert=1:3~10九、感受態(tài)細(xì)胞涂板復(fù)蘇挑單克?。菏?、單克隆搖菌擴(kuò)增：十一、轉(zhuǎn)化、涂板（簡(jiǎn)略）：1、將5ul連接產(chǎn)物加入到50L？感受態(tài)細(xì)胞中，混勻，冰浴60分鐘。（一80℃儲(chǔ)感受態(tài)需先手捂解凍后冰上放置10min）。2、把轉(zhuǎn)化管轉(zhuǎn)移至42℃水浴鍋中，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)90s。3、把轉(zhuǎn)化管迅速轉(zhuǎn)移至冰上，2-3分鐘。4、向每個(gè)轉(zhuǎn)化管中加入800L?無抗LB培養(yǎng)基，37℃搖床170rpm溫育60min。5、吸取100L?涂布于含有相應(yīng)抗性的LB瓊脂平板上。6、倒置？平板培養(yǎng)37℃溫箱過夜，轉(zhuǎn)化克隆應(yīng)該于12-16小時(shí)區(qū)間出現(xiàn)。十二、挑單克隆搖菌、搖菌：1、加入3ml含抗LB培養(yǎng)基于一新的搖菌管中。2、標(biāo)記單克隆，槍頭挑菌后放入搖菌管。3、37℃、215rpm過夜。十三、手提質(zhì)粒：提質(zhì)粒前注意留種（850U1菌液+150甘油，取200ul分裝至EP管）1、從剩余菌液中取1.5ml左右至新的EP管中，8000rpm離心沉淀2?3min棄上清。2、每管加100ulSolutionI重懸震蕩渦旋混勻。3、每管加200ulSolutionll輕柔混勻。4、每管加150ulSolutionlll輕柔混勻（果凍狀），速置冰上5min。5、4℃13500rpm離心5~10min,回收上清液。6、轉(zhuǎn)移上清至新的EP管中，每管加300ul酚氯仿，4℃13500rpm離心3min,回收上清至新EP管。7、每管加0.7倍體積異丙醇，渦旋混勻，RT靜置10min或一20℃靜置3~5min（不宜久，防鹽沉）。8、4℃13500rpm離心10min棄上清。9、每管加800ul70%Ethanol洗滌一遍。10、4℃13500rpm離心10min棄上清，自然晾干。11、每管加30?50ulddH2O。12、測(cè)濃度。Solution配方:堿裂解溶液I（制備質(zhì)粒）50mnioi/L第蓿情25imnol/LTris-Cl（pHB.O）10minol/LEDTA（pH8.0）?-I.彼可配制1叩ml15n,l）5Wcm1）壓力下藻汽滅菌15min,保存于.L1堿裂解溶液U（制備黃越）0,2NMaOH（隊(duì)10N苫存液中說用現(xiàn)玷空）1%｛小八。SUS溶液口蹙以用現(xiàn)配船.室溫下使用.二破桂裂解港液迎（制備質(zhì)勉）TOC\o"1-5"\h\z5mrl/L乙酸鋅50ml部乙簧⑴11,5mlH2（）28.5ml所配成的善減中理的激度為J3/L.乙段根的港度為5國(guó)處：保存于用時(shí)世F冰附中.十三、酶切后跑膠鑒定：十四、測(cè)序：十五、制作細(xì)菌超級(jí)感受態(tài)細(xì)胞（分子克隆III）1.準(zhǔn)備描皿莪化級(jí)向液（月前冰上前冷"神配制黃化塘腐的水的就瞧，會(huì)即獻(xiàn)卷跚nM治理此，果用直推從破勒眈曲加靖過浦第跣（岫崛）取H的求格修徉疑滿漱的韜果.甄敏出現(xiàn)里里使用前用活性疑處理去寓于水M日.0.5niWL的PIPES（pH6J）］唳嚓不，一一雙（2.乙磺酸）］落液的配制；將15.lgPIPES溶于80ml水中（Mflli?Q氮或與之相當(dāng)小別的）,用5md/LKOH調(diào)pH值至67最后出納也定容至lOBml.月曲先處理的Nd睢配陵膜（機(jī)45曲＞孔徑）過株除菌。分成小份于-20匕保存。b.Inoue轉(zhuǎn)化纓沖液的配制：將下列組分潛于800nli純水中，然后鈿20ml0.5mol/L的PIPES（pH6.7）,加純水定容至IL試劑set/i建濃度MnCi3'4HiOL0.B8g55mmd/LCaClj-ZHiO2.20gt5mmoi/LKC11865f250hnnd/LPIPES(0*5md%pWU)20ml10nmjcl/LHiO補(bǔ)至IL.挑取一個(gè)經(jīng)371培養(yǎng)16roh平皿上的單南落（2?3nmi直徑）,接種至250H能彩瓶中的25mlLB培養(yǎng)液或SOB培養(yǎng)液中,37C搗床（2MH300r/min）培養(yǎng)6~8k存.晚上的6點(diǎn)鐘，符上述初始培養(yǎng)胸接種于三個(gè)盛有250mlSOB培養(yǎng)液的1L錐形瓶.第一個(gè)加10ml,第二個(gè)加4ml,第三個(gè)加2成于18-22V中速搖床過度°4,次日早L?1量三JK培養(yǎng)物的0D加值，每45mh期定一此.當(dāng)有TB的培養(yǎng)物即依-0.55時(shí)，招培養(yǎng)儺于冰上10min,棄去另兩瓶墻舞機(jī)由于大第敦實(shí)觸目時(shí)思差慎尤而且限建也MT四季4m員兼的變化而熨也因此垠趣11合超8俶的時(shí)就尤其是晚上。同時(shí)培弗三谷不同旅史植度的罷液，可以提離攻功的機(jī)良措養(yǎng)過疲的曾福至少有T是符合析機(jī).于4c以2500g（相當(dāng)于So同GSA轉(zhuǎn)頭,3900r/min）離心10面口收集商機(jī).倒去培養(yǎng)雙將離心管倒扣在吸水配上2mm以吸干剌余液體，用一個(gè)真空畋引器將貼附在管壁上的培養(yǎng)基吸干。.加80ml頊捺的返轉(zhuǎn)化緩沖液童意細(xì)菌沉淀°整轆何不妻的耨或煙瞰。0JrXMb「始當(dāng)于鼠同1UWA聯(lián)通加加〃疝7意心1。miwA年菌tL凍存感受態(tài)細(xì)胞11,用20ml值序的局陰轉(zhuǎn)化緩沖榭5輕量懸迎性。12,加L5mlDMSa輕輕混勻細(xì)菌懸漏放置冰上IQmiw13,迅速解懸湛分裝到荷和的無菌微量黑心管中，封縈管口，沒入液氯中快速冰凍感受態(tài)細(xì)I吼It存于70。備用?用賴這桐以黑富觸螂妁S瓶就大作置觸方醐用球覦皿從破擷胞就日停算守余。麻，卻皆累更大酬晴化髓體片》鄴A煙L福小份旅受患婚盅的費(fèi)可^京*to大叁勺14.帶要時(shí)「從-70C冰箱中康出一管感受態(tài)細(xì)胞把管握于手心，融化細(xì)胞心鋤胞|一國(guó)融化,即酰管轉(zhuǎn)移至批塔中，在冰上放置10mm15.用一冷的無窗吸頭把感受杰螂精到軸I的無點(diǎn)案嵇管（17X]70mm）申,放置在冰浴上。不月液亦皆是因?yàn)樗黫l會(huì)峰祗轉(zhuǎn)化救旱的10^轉(zhuǎn)化包括陽性利陰性時(shí)照（請(qǐng)見方案23中的專欄聊窗轉(zhuǎn)化〃）6招要轉(zhuǎn)機(jī)的DNA片段加入到裝有酬受布梁胞的管中（SO仙感受態(tài)酣胞需25ngDNA）（體積不應(yīng)犯過感受態(tài)88跑的5凱輕輕旋轉(zhuǎn)幾次泥勻內(nèi)容物。實(shí)驗(yàn)中至少設(shè)對(duì)照管：一個(gè)含有感受態(tài)細(xì)響和已知量的超螺旋質(zhì)粒DN&另一曾只有感受套細(xì)胞?；靹騼?nèi)容物，30min..將管放人預(yù)加溫至421的褥環(huán)水浴中，恰恰放置90m,不要搖動(dòng).熱盤踵一個(gè)關(guān)?（步乳殖府舟達(dá)到熱H程度非管■篆由里的極皮技吊毒的時(shí)冏都是使聞htal。粉管的贈(zèng)撇其檐疑的醐可能崎砌幽果口?.快速耨管晴移到冰浴中，便細(xì)胞冷卻1~2血肌.每管加800向SOC培養(yǎng)基,用水浴耨培養(yǎng)基加糧至37a恭后將管轉(zhuǎn)移到設(shè)置為20,符適當(dāng)體積｛每個(gè)90mm平板達(dá)200聞巳轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含2Gmmol/LMgSO4和相應(yīng)抗生露的SOB培養(yǎng)基上。如果用國(guó)壞素庫為選舞耕記.全部的轉(zhuǎn)化整作物可以鋪在一個(gè)單獨(dú)的平皿上（或收瓊脂中），可以先在救量隨州I上室整甯心肌以收黑髯化乳輕拍管壁的同時(shí)址人100/雙里最沉直重蚤我署輔窗器先第在乙靜中艮泡,糠后在建場(chǎng)上的標(biāo)，待它涼至室混品才可耨轉(zhuǎn)極富輕弩超盛在瓊翻表瓦加於宜靠卡青?素的抗租用能把菌情平板時(shí)密度應(yīng)收低（0個(gè)如皿平16不通過miM）,于37C宙岫好間襁過2m斛胃U雌幅化體可將陲間HI分?jǐn)眺?，申，肥滅血顓軀地附肓制電追甑依我尻過高或儲(chǔ)養(yǎng)時(shí)向過長(zhǎng)和會(huì)馬翼出現(xiàn)對(duì)鼠草膏毒素頓?的衛(wèi)星譚隊(duì)在遺知嬉養(yǎng)基中不用量節(jié)育■素而用覆節(jié)育毒總以及翳抗生聚觥度從60摳/㈤於膏到100必血可性情用串Jf過善,但稚嫄械除總抗奸膏善軸落艇嶼和上馳的細(xì)般瞬加并無線佳用瞅袤這可能蒯為蜥生素黜樵驪觸長(zhǎng)抑肘雌翱t.將平板置于室溫直至液體被吸收..倒置平皿,于37C培養(yǎng),1276b后可出現(xiàn)鹿落。aatwft!在鐸一個(gè)實(shí)賽禮應(yīng)使有花性胡吼匚估計(jì)轉(zhuǎn)化費(fèi)率；段之引性對(duì)囑,以梢除可能的雪染及直聯(lián)可能的失敗意因.膽囹w!在轉(zhuǎn)化霎瞅申,業(yè)立設(shè)立一份再lD5iA凡有感壹本細(xì)胞就計(jì)強(qiáng)管,而且獨(dú)立韁于一個(gè)含有適量抗：生黃的千瓶，王常情況下末應(yīng)演有克隆氏出，如果有下列情況，必須引起重AL我吳敦札，史由?論或