1、轉錄組的測序技術方法及當前進展 一、轉錄組測序技術背景 二、轉錄組測序流程 四、轉錄組測序技術應用實例 三、轉錄組測序應用領域 五、轉錄組測序發(fā)展前景 轉錄組？ 轉錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉錄出來的所有RNA 的集合轉錄組測序技術背景轉錄組測序技術又稱轉錄組高通量測序（transcriptome sequencing）或稱為全轉錄組鳥槍法測序（Whole Transcriptom Shotgun Sequencing WTSS）把高通量測序技術應用到有mRNA逆轉錄生成的cDNA上，從而獲得來自不同基因的mRNA片段在特定樣本中的含量，這就是mRNA片段或mRNA-Seq

2、，同原理，各種類型的轉錄本都可以用深度測序技術進行高通量檢測。原則上, 所有的高通量測序技術都能進行RNA測序。自2005年以來, 以Roche 公司的454 技術、Illumina 公司的Solexa 技術和ABI 公司的SOLiD 技術為標志的新一代測序技術相繼誕生, 之后HelicosBiosciences 公司又推出單分子測序(Single molecule sequencing, SMS)技術。新一代測序又稱作深度測序或高通量測序, 是相對于傳統(tǒng)的Sanger 測序而言,主要特點是測序通量高, 測序時間和成本顯著下降。各平臺測序原理及序列長度的差異決定了各種高通量測序儀具有不同的應用

3、側重 一、轉錄組測序技術背景 二、轉錄組測序流程 四、轉錄組測序技術應用實例 三、轉錄組測序應用領域 五、轉錄組測序發(fā)展前景 一、轉錄組測序技術背景 二、轉錄組測序流程 四、轉錄組測序技術應用實例 三、轉錄組測序應用領域 五、轉錄組測序發(fā)展前景轉錄組測序應用領域應用實例 2009年Surali Azim和 Lao Kaiqin領導的課題組通過對單個小鼠卵裂球細胞的RNA- Seq數據進行分析，分析發(fā)現至少5個測序所獲得的reads比微陣列技術多出75（5270）的表達基因，并鑒定了1753個嶄新的剪切位點。除此以外，單細胞的RNA-seq結果表明了在相同的卵裂球或卵母細胞中，至少有8-19的基

4、因存在兩個以上的轉錄異構體，該現象清楚表明了在胚胎發(fā)育過程中單細胞轉錄組的復雜性。最后，通過對單個Dicer1-/- 和 Ago2-/-卵母細胞的轉錄組測序，相對野生型來說，Dicer1-/- 和 Ago2-/-卵母細胞分別發(fā)現1696和1553個基因異常上調，1571和1121個基因異常下調，而619基因是相同的。這種單細胞RNA-Seq技術檢測將大大提高我們對單個細胞在哺乳動物發(fā)育中轉錄復雜性的理解。密歇根大學的研究人員結合Roche 454和Illumina Solexa測序平臺對病人細胞系和腫瘤樣品的轉錄組進行測序，發(fā)現了前列腺癌中新的基因融合事件。在新發(fā)現的融合中存在一個周期性的轉錄

5、本通讀，稱為SLC45A3-ELK4，以及幾個個別病人獨有的個體突變融合。而周期性的融合被認為是癌癥的主要誘因。該文章發(fā)表在2009年5月的Nature雜志上。2010年12月份美國加州大學圣克魯茲分?；羧A德休斯醫(yī)學研究院Sofie Salama教授所領導的課題組描述了一種通過轉錄組高通量測序方法測定RNA結構的方法(Fragmentation sequencing ，FragSeq)，該方法發(fā)表在自然方法學。該方法利用核酸酶P1只切割單鏈RNA的特性對小鼠RNA進行片段化，片段化RNA的大小在20100nt之間，然后在片段的5和3端分別加上測序接頭，再進行逆轉錄和PCR擴增，最后構建Frag

6、Seq文庫并對其進行高通量測序。同時作者通過生物信息學分析大量的高通量測序結果，并輔以實驗數據成功測定了小鼠的非編碼RNA的二級結構。轉錄組測序技術的發(fā)展前景轉錄組測序技術的優(yōu)勢1）數字化信號2）高靈敏度3）任意物種的全基因組分析4）更廣泛的解決范圍轉錄組測序技術的劣勢1）數據龐大2）轉錄組復雜使得很難追蹤所有基因中罕見RNA亞型和其表達變化3）單細胞或少量細胞進行轉錄組測序是一個亟待解決的問題1、雖然轉錄組技術還面臨著種種困難, 但作為剛剛起步的新技術轉錄組測序技術已經顯示出其他轉錄組學技術無可比擬的優(yōu)勢：既能提供單堿基分辨率的轉錄組注釋又能提供全基因組范圍的“數字化”的基因表達譜, 而且其

7、成本通常比芯片和大規(guī)模的Sanger EST 測序要低。3. 轉錄組測序的強項, 就在于它是個“開放系統(tǒng)”, 它的發(fā)現能力和尋找新的信息的能力從本質上高于芯片技術, 相信隨著相關學科的發(fā)展和測序成本的逐步降低,轉錄組測序必將在轉錄組學研究領域占主導地位。4. 轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構, 揭示特定生物學過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機理。RNA-Seq 作為 一種新的高效、快捷的轉錄組研究手段正在改變著人們對轉錄組的認識。RNA-Seq 利用高通量測序技術對組織 或細胞中所有RNA反轉錄而成的cDNA文庫進行測序, 通過統(tǒng)計相關讀段(reads)數計算出不同RNA的表達量,