1、過氧化物酶同工酶的提取、分離實 驗 四學(xué)時：911、掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和方法；2、掌握過氧化物酶(POD)活性測定的原理及方法。3、了解過氧化物酶(POD)的生物學(xué)功能。 一、實驗?zāi)康模? 1、過氧化物酶： 過氧化物酶廣泛存在于植物體中，是活性較高的一種酶。它與呼吸作用、光合作用及生長素的氧化等都有關(guān)系。在植物生長發(fā)育過程中它的活性不斷發(fā)生變化。一般老化組織中活性較高，幼嫩組織中活性較弱。這是因為過氧化物酶能使組織中所含的某些碳水化合物轉(zhuǎn)化成木質(zhì)素，增加木質(zhì)化程度，而且發(fā)現(xiàn)早衰減產(chǎn)的水稻根系中過氧化物酶的活性增加，所以過氧化物酶可作為組織老化的一種生理指標(biāo)。此外，過氧化物同工酶在遺傳

2、育種中的重要作用也正在受到重視。二、實驗原理:3 2、同工酶概念： 同工酶指催化同一種化學(xué)反應(yīng)，但其酶蛋白本身的分子結(jié)構(gòu)組成卻有所不同的一組酶。 同工酶與生物的遺傳，生長發(fā)育，代謝調(diào)節(jié)及抗性等都有一定的關(guān)系，如POD在細(xì)胞代謝過程中與呼吸作用，光合作用，及生長素的氧化等都有關(guān)系，測定POD活性或其同工酶，可以反映某一時期植物體內(nèi)代謝變化。二、實驗原理:4(1)定義：是指帶電粒子在電場中向與其自身所帶電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。(2)影響電泳效果的因素：帶電顆粒的大小和形狀： 顆粒越大，電泳速度越慢，反之越快；顆粒的電荷數(shù)： 電荷越少，電泳速度越慢，反之越快；溶液的粘度： 粘度越大，電泳速度越

3、慢，反之越快；3、電泳：5 溶液的pH值： 影響被分離物質(zhì)的解離度，離等電點越近，電泳速度越慢，反之越快； 電場強度： 電場強度越小，電泳速度越慢，反之越快；離子強度： 離子強度越大，電泳速度越慢，反之越快；電滲現(xiàn)象： 電場中，液體相對于固體支持物的相對移動；支持物篩孔大?。?孔徑小，電泳速度慢，反之則快。 續(xù)(2)影響電泳效果的因素：6 聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯胺凝膠作為載體的一種區(qū)帶電泳。4、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）7 聚丙烯胺凝膠由丙烯酰胺單體（Acr）和N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑作用下聚合而成。在具有自由基時，Acr和Bis就會聚合。 引發(fā)產(chǎn)生自由基的方法有兩種

4、： 化學(xué)法 光聚合法 (1)聚丙烯胺凝膠的生成：8化學(xué)聚合： 引發(fā)劑是過硫酸銨(AP)，催化劑N、N、N、N四甲基乙二胺（TEMED），它的堿基催化AP產(chǎn)生氧自由基，激活單體形成自由基，發(fā)生聚合?；瘜W(xué)聚合形成的凝膠孔徑較小，且重復(fù)性好，用來制備分離膠；光聚合： 催化劑是核黃素（VB2），在痕量氧存在下，核黃素光解形成無色基，無色基再被氧氧化成自由基，激活單體發(fā)生聚合。光聚合形成的凝膠孔徑較大，且不穩(wěn)定，適于制備大孔徑的濃縮膠。9 聚合反應(yīng)：架橋物造成分枝端點自由基 可再延續(xù)freeradicalBisBis聚合反應(yīng)交錯連結(jié)自由基形成10聚丙烯酰胺的基本結(jié)構(gòu)為丙烯酰胺單體構(gòu)成的長鏈，鏈與鏈之間通

5、過甲叉橋聯(lián)結(jié)在一起；鏈的縱橫交錯形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使凝膠具有分子篩的性質(zhì)；網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還能限制蛋白質(zhì)等樣品的擴散運動，使凝膠具有抗對流的作用；長鏈富含酰胺基團，使其成為穩(wěn)定的親水凝膠；該結(jié)構(gòu)不帶電荷，在電場中電滲現(xiàn)象極為微小。(2)聚丙烯酰胺凝膠結(jié)構(gòu)上的特點：11（1）凝膠度： 是指100mg凝膠溶液中含有單體（Acr）和交聯(lián)劑 （Bis）的總克數(shù)，用T%表示。（2）交聯(lián)度： 是指凝膠溶液中，交聯(lián)劑占單體和交聯(lián)劑總量的 百分?jǐn)?shù)，用C%表示。 一般濃縮膠的濃度為7.5%，分離膠的濃度為10%。 (3)凝膠的質(zhì)量決定因素：12 聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數(shù)T(

6、總百分濃度)和C(交聯(lián)百分濃度)。 上式中：a為丙烯酰胺的克數(shù)，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)，m為緩沖液體積（ml）。 當(dāng)C保持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當(dāng)T保持恒定，C為4時，有效孔徑最小，C大于或小于4時，有效孔徑均變大，C大于5時凝膠變脆，不宜使用，實驗中最常用的C是2.6和3 。 a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應(yīng)在30左右。常用29 ： 113第一、三個不連續(xù)性： 凝膠孔徑的不連續(xù)； 緩沖液離子組成及各層凝膠pH的不連續(xù)； 在電場中形成的電位梯度的不連續(xù)。第二、不連續(xù)系統(tǒng)中的三種物理效應(yīng)： 電荷效應(yīng)： 分子篩效應(yīng): 濃縮效應(yīng): (4)不連續(xù)P

7、AGE的原理：14不連續(xù)PAGE電泳膠體系統(tǒng)的組成：1電泳系統(tǒng)pH膠體濃度緩沖液上層 (負(fù)極) 緩沖液 2樣本溶液 3濃縮膠 6.7 4分離膠 膠體 5下層 (正極)緩沖液 Tris-HClTris-HClTris-glycine Tris-glycine Tris-glycine 8.3 8.3 8.9 8.3 5% 7% - - - 15 在濃縮膠中的三個主要作用角色：甘氨酸: pH=8.9 負(fù)電荷 pI=6.7 不帶電荷Cl-1:蛋白質(zhì)(酶):小分子大分子16 濃縮效應(yīng)：分離膠濃縮膠樣本8.96.7離子缺乏空間ABC+8.017以鄰甲氧基苯酚（即愈創(chuàng)木酚）為過氧化物酶的底物，在此酶存在下

8、，H2O2可將鄰甲氧基苯酚氧化成紅棕色的4-鄰甲氧基苯酚，其反應(yīng)為：該紅棕色的物質(zhì)可用分光光度計在470nm處測定其消光值，即可求出該酶的活性。5、過氧化物酶活性測定18三、實驗材料、主要儀器和試劑1材料：小麥幼苗 2儀器：（1）分光光度計； （2）移液管（3）離心機（4 000r/min）； （4）研缽 (5)垂直板電泳裝置（電泳槽，玻璃板，膠條，電泳梳子，制膠架等）； (6)穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀； （7）高速冷凍離心機； （8）電子天平； （9）電冰箱； （10）瓷盤、微量進樣器； （11）電熱恒溫水浴鍋； （12） S-22pC可見分光光度計；（13）電爐等19 3、試劑： （1）1N HCl

9、：用12N的濃鹽酸來配制； （2）分離膠緩沖液（pH8.9的Tris-HCl緩沖液）： （3）濃縮膠緩沖液（pH6.7 Tris-HCl緩沖液）： （4）分離膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液）： （5）濃縮膠丙膠貯液（Acr-Bis貯液）： （6）過硫酸銨溶液（NH4）2S2O8簡寫Ap：（當(dāng)天配制）； （7）核黃素溶液：8% （8）電極緩沖液：（pH8.3Tris-甘氨酸緩沖液） （9）40%蔗糖： （10）pH4.7乙酸緩沖液：20 （11）樣品提取液： （12）0.5%的溴酚藍(lán)：0.5g溶于100ml無離子水； （13）過氧化物酶同工酶聯(lián)苯胺染色液： 1g聯(lián)苯胺加9ml冰醋酸，溶解后加36

10、ml水用時加160ml水加Vc140.8mg加幾滴30%過氧化氫原液。聯(lián)苯胺是致癌物質(zhì)，稱取時應(yīng)戴手套； （14）0.05M pH5.5磷酸緩沖溶液； （15）0.05M 愈創(chuàng)木酚； （16）2%H2O2 ； 21 1、貯液的配制： 2、凝膠的制備： 2.1 膠板的制備： 2.2 分離膠的制備： 2.3 濃縮膠的制備： 3、酶液的制備： 4、裝槽、點樣： 5、電泳： 6、剝膠、固定、染色：四、實驗步驟： 222.1 膠板的制備： 2324 2.2 分離膠的制備： 按下表制備分離膠試劑名稱分離膠緩沖液分離膠丙膠貯液Ap無離子水體積比1241取用量（ml）36123 膠灌至距梳子齒下端1cm 灌畢

11、封上一層水加速聚合當(dāng)膠與水出現(xiàn)清晰界限時表明聚合好。 2526 2.3 濃縮膠的制備： 按下表制備濃縮膠 試劑名稱濃縮膠緩沖液濃縮膠丙膠貯液Ap蔗糖體積比1222取用量1222 用濾紙吸干水倒入濃縮膠插入梳子封水，照光當(dāng)膠色由黃變?yōu)槿榘咨砻骶酆虾谩?73、酶液的制備： 稱取大麥幼苗莖部1g 加樣品提取液1ml 于冰浴中研成勻漿然后以2ml提取液分幾次洗入離心管在高速離心機上以4000轉(zhuǎn)/每分鐘，離心10min 倒出上清液，以等量40%蔗糖混合低溫放置待用。284.1 裝槽： 取出膠板下端膠條用濾紙擦凈凡士林油將膠板固定在電泳槽上（凹板一側(cè)向內(nèi)） 上下槽裝電極緩沖液。294.2 點樣： 輕拔電泳梳子用微量進樣器點樣每孔約30l。305、電泳： 接通電源穩(wěn)流調(diào)節(jié)電流到每孔1mA左右當(dāng)溴酚藍(lán)前沿進入分離膠后，可適