1、益痛清對(duì)膜性腎病模型的治療及其機(jī)制研究膜性腎病N，ebranusnephrpathy是以電子致密物在腎小球毛細(xì)血管壁上皮下沉積為特征的原位免疫復(fù)合物腎炎。近年來(lái)大量臨床理論征明，中醫(yī)藥對(duì)N的治病有較好的療效，尤其在緩解蛋白尿方面。益腎清配方是以黃芪、小薊、川芎、海風(fēng)藤及車前子五種中藥組成，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、清熱化瘀、涼血止血、利水清濁的功能，可減輕或緩解N的蛋白尿、保護(hù)腎功能、修復(fù)腎小球構(gòu)造的病理?yè)p傷。1材料1.1藥品和拭劑益腎清，棕紅色粉末，1g粉末相當(dāng)于13.75g生藥，北京制藥四廠提供。小牛血清白蛋白，帝道生物；大腸桿菌內(nèi)毒素，北京邦定；生化試劑盒，北京中生。1.2動(dòng)物雄性新西蘭家兔，1.5

2、-2.0kg，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。BALB/小鼠和57BL/6J小鼠，18-22g，雌雄各半，雄性istar大鼠，150-200g均由北京大學(xué)區(qū)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供。1.3儀器ZS-1A型半自動(dòng)生化分析儀，北京中生；TJ-6離心機(jī)和LSl701液閃儀，Bekan；VIS-7220型可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京瑞利。2方法2.1益腎情治療陽(yáng)離子化牛血清白蛋白-BSA誘導(dǎo)的家免N。2.1.1模型制作參考Bder1982年所用的方法制備-BSA并制作模型。42只家兔測(cè)定各項(xiàng)血尿生化指標(biāo)后，隨機(jī)選出8只作為正常組，其余動(dòng)物全部制作模型。首先每只動(dòng)物iv-BSAlg及大腸桿菌內(nèi)毒素1g，一周后開(kāi)場(chǎng)每天

3、iv-BSA10g，4-7周時(shí)劑量加倍。待模型成功后除選兩只模型動(dòng)物送病理檢查外，其余隨機(jī)分為模型組、益腎清10g、5g、2.5g生藥/kg體重劑量組并給藥治療。2.1.2觀察工程每周動(dòng)物稱重一次。分別于實(shí)驗(yàn)前、造模成功、藥物治療4周和8周時(shí)測(cè)定血尿生化指標(biāo)。動(dòng)物殺檢，作腎臟病理組織學(xué)檢查。2.2益腎清對(duì)正常小鼠免疫功能的影晌2.2.1非特異性免疫碳粒廓清法將40只BALB/小鼠隨機(jī)分成益腎清28g、14g、7g生藥/kg體重劑量組和溶劑對(duì)照組0.25%溶液。連續(xù)給藥20天后，小鼠iv印度墨汁0.05l/10g體重，于1in和5in時(shí)分別取血20l，加到2l0.1%的碳酸鈉溶液中搖勻比色(68

4、0n)測(cè)光密度。計(jì)算廓清指數(shù)K和吞噬指數(shù)。2.2.2體液免疫血清溶血素的分光光度測(cè)定法將40只57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，小鼠ip20%SRB0.2，免疫后第4天取血，離心得血清，稀釋500倍作溶血反響，比色540n。計(jì)算樣品半數(shù)溶血值H50。2.2.3細(xì)胞免疫淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)3H-TdR摻人法將40只57BL/6J小鼠分組給藥同非特異性免疫。連續(xù)給藥20天后，制備小鼠脾細(xì)胞懸液，參加培養(yǎng)板，同時(shí)參加nA或LPS，5%2培養(yǎng)72小時(shí)。終止培養(yǎng)前6小時(shí)，加人3H-TdR終濃度為2i/l。搜集細(xì)胞，測(cè)定樣品放射強(qiáng)度。計(jì)算nA和LPS誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率。2.3益腎清對(duì)大鼠

5、的利尿作用將40只雄性安康istar大鼠食18h后，隨機(jī)分成益腎清20g、10g、5g生藥/kg體重劑量組和溶劑對(duì)照組生理鹽水，給藥5l/100g體重。給藥后半小時(shí)壓大鼠下腹部排盡余尿，分別放人代謝籠中，搜集給藥后1、2、3、4、5小時(shí)的尿量。2.4益腎清對(duì)大鼠血液流流變學(xué)的影晌將40只雄性安康iStar大鼠隨機(jī)分成益腎清20g、10g生藥/體重劑量組、模型組生理鹽水和溶劑對(duì)照組生理鹽水，給藥7天。最后一天除溶劑對(duì)照組外，其余四組動(dòng)物sAdr0.2l，共2次，兩次間隔6h，間隔中間將功物放入冰水浴中5in給予冷刺激，造成血瘀模型。末次注射Adr18h后，腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，B轉(zhuǎn)子剪切速率由

6、高到為307.20s-1、153.60s-1、61.44s-1、30.72s-1、15.36s-1，不同切變率下測(cè)全血表觀粘度b；別離血漿，307.20s-1下測(cè)血漿粘度p。2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理組間比擬用t檢驗(yàn)。3結(jié)果3.1益腎清對(duì)-BSA誘導(dǎo)的家兔N的治療作用3.1.1一般情況模型組動(dòng)物于造模后不同程度的攝食減少、精神不振、體重減輕、水腫、少尿等現(xiàn)象。給藥后治療組動(dòng)物水腫逐漸消失，模型組也有自愈趨勢(shì)。治療組動(dòng)物體重高于模型組，但仍低于正常組，各組沒(méi)有顯著性差異。3.1.2血尿生化指標(biāo)造模第3周模型組有動(dòng)物出現(xiàn)蛋白尿，至造模第7周所有模型組動(dòng)物均出現(xiàn)蛋白尿，TP24、BUN、H比正常組顯著升高P0

7、.01，ALB明顯降低(P0.05)，TRIG也明顯升高(P0.05)說(shuō)明模型己經(jīng)形成。藥物治療4周時(shí)，僅益腎清10g生藥/kg體重劑量組的TP24比模型組明顯降低(P0.05)，其余各組各指標(biāo)均無(wú)明顯交化。治療8周時(shí)，治療組的TP24、BUN、TRIG及H均比模型組明顯降低P.01或P0.05，ALB明顯上升P0.05，根本恢復(fù)至正常程度。3.1.3腎臟病理組織學(xué)檢查3.1.3.1肉眼觀察實(shí)驗(yàn)完畢時(shí)，動(dòng)物殺檢，發(fā)現(xiàn)正常組的腎臟和脾臟外觀外表光滑，色澤正常。益腎清各治療組的外觀色澤及大小無(wú)明顯變化。而模型組的腎臟兩端鈍圓，中間略隆起，外表不甚光滑，個(gè)別腎及脾臟明顯增大，腎臟、脾臟的臟器系數(shù)均比

8、正常組明顯增大(P0.05)。3.1.3.2病理改變正常組免疫熒光檢查陰性，光鏡和電鏡檢查未見(jiàn)異常。模型組IgG、3沿腎小球毛細(xì)血管壁高強(qiáng)度顆粒狀沉積，3沉積較弱。光鏡檢查可見(jiàn)GB增厚，系膜增生并有少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡檢查可見(jiàn)GB彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積，上皮細(xì)胞足突交融。益腎清各治療組的免疫熒光檢查與模型組相比無(wú)差異。10g、5g生藥/kg體重劑量組的光鏡和電鏡檢查已根本恢夏正常，2.5g生藥/體重劑量的的光鏡檢查已恢復(fù)正常，但電鏡檢查仍有GB輕度增厚和節(jié)段性上皮細(xì)胞足突交融現(xiàn)象。3.2益腎清對(duì)正常小鼠免疫功能的影響益腎清28g、14g生藥/kg體重劑量組，小鼠的、H50及nA和L

9、PS誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的才能比溶劑對(duì)照組明顯增強(qiáng)P0.05或P0.01。各劑量組之間有明顯的量效關(guān)系。3.3益腎清對(duì)大鼠的利尿作用益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠1小時(shí)尿量及5小時(shí)內(nèi)總尿量與溶劑對(duì)照組相比都有顯著增加P0.01，提示其有較強(qiáng)的利尿作用。3.4益腎清對(duì)大鼠血液流變學(xué)的影響血瘀模型組動(dòng)物的b值和p值皆顯著高于溶劑對(duì)照相P0.01，標(biāo)志模型的形成；益腎清20g、10g生藥/kg體重劑量組，大鼠的b值和p值比模型組均顯著降低P0.01，P0.05。說(shuō)明益腎清能降低血瘀大鼠全血的高、低切變粘度及血漿粘度，提示其有活血化瘀的作用。4討論自1982年以來(lái)，Bder等用-BSA成功誘導(dǎo)

10、了家兔N之后，陽(yáng)離子抗原已被廣泛地應(yīng)用于腎炎的實(shí)驗(yàn)研究。該模型與人類N頗為相似，具有一定的代表性。它發(fā)病率高，重復(fù)投好，病理改交一致，合適腎炎發(fā)病機(jī)理及防治的研究。本實(shí)驗(yàn)成功地復(fù)制了-BSA誘導(dǎo)的家免N模型。比擬正常組，模型組動(dòng)物TP24和BUN明顯升高，ALB顯著降低，TRIG和H也顯著增加，這些指標(biāo)的變化與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)一致。根據(jù)N的病理改變可分四期。本打破的模型組IgG、3沿腎小球毛細(xì)血管壁高強(qiáng)度顆粒狀沉積。光鏡檢查可見(jiàn)GB增厚，系膜增生并有少量粒細(xì)胞浸潤(rùn)，電鏡檢查可見(jiàn)GB彌漫增厚，上皮下多數(shù)電子致密物沉積上皮細(xì)胞足突交融。此病癥與N期病理病癥相符，說(shuō)明此實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛷?fù)制成功。益腎清的主要成分有：黃芪、小薊、川芎、海風(fēng)藤及車前子。黃芪主補(bǔ)氣升陽(yáng)，利水退腫。小薊主清熱解毒，涼血止血，清下焦熱結(jié)，可控制炎癥反響。川芎與海風(fēng)藤協(xié)同作用，