1、ICS 67.120.30CCS B 5035福 建 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB35/T 19842021水產(chǎn)品乙酰甲喹及其主要代謝物鑒別技術(shù)規(guī)程 Specifications of identification techniques of mequindox and its main metabolites in fishery products 2021-06-21發(fā)布2021-09-21實(shí)施福建省市場(chǎng)監(jiān)督管理局 發(fā) 布DB35/T 19842021目 次前言 . II1 范圍 . 12 規(guī)范性引用文件 . 13 術(shù)語和定義 . 14 原理 . 15 試劑和材料 . 16 儀器和設(shè)備 . 27

2、 分析步驟 . 28 結(jié)果計(jì)算與表示 . 49 回收率、重現(xiàn)性、再現(xiàn)性和靈敏度 . 4附錄A（資料性） 色譜圖示例. 5附錄B（資料性） 回收率試驗(yàn)研究結(jié)果. 7IDB35/T 19842021前 言本文件按照GB/T 1.12020標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則的規(guī)定起草。本文件由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提出。本文件由福建省海洋與漁業(yè)局歸口。本文件起草單位：福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所、廈門瑞德利校準(zhǔn)檢測(cè)技術(shù)有限公司、福建賽福食品檢測(cè)研究所有限公司。本文件主要起草人：潘葳、劉文靜、羅欽、丁亞閩、郭嬌嬌、傅建煒。IIDB35/T 19842021水產(chǎn)品乙酰甲喹及其

3、主要代謝物鑒別技術(shù)規(guī)程1 范圍本文件規(guī)定了水產(chǎn)品中乙酰甲喹及其5種主要代謝物鑒定的原理、試劑和材料、儀器和設(shè)備、分析步驟、結(jié)果計(jì)算與表示以及回收率、重現(xiàn)性和再現(xiàn)性。本文件適用于水產(chǎn)品中乙酰甲喹（MEQ）及其5種主要代謝物3-甲基-2-（1-羥基）乙基-喹噁啉-N，lN-二氧化物（M1）、3-甲基-2-（1-羥基）乙基-喹噁啉-N-一氧化物（M2）、3-甲基-2-乙?；?喹噁啉4 4-N-一氧化物（M3）、3-甲基-2-乙酰基-喹噁啉（M4）和3-甲基-2-（1-羥基）乙基-喹噁啉（M10）殘4留量的鑒定。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注

4、日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T 66822008 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T 308912014 水產(chǎn)品中抽樣規(guī)范3 術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4 原理用二氯甲烷和乙酸乙酯混合液提取試樣中的乙酰甲喹及其代謝物，提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用甲醇-水流動(dòng)相渦旋溶解殘?jiān)谜和槿コ渲械闹?，溶解液?jīng)微孔濾膜過濾，高效液相色譜-紫外檢測(cè)法測(cè)定，外標(biāo)法定量。5 試劑和材料除另有規(guī)定，所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T 66822008中一級(jí)水規(guī)定，具體試劑與材料如下：二氯甲烷（CH

5、2Cl2）；乙酸乙酯（C4H8O2）；甲醇（CH4O）：色譜純；正己烷（C6H14）；二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液（75+25，體積比）：將75體積二氯甲烷與25體積乙酸乙酯混合；標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及樣品前處理所用流動(dòng)相：將38體積甲醇與62體積一級(jí)水混合；乙酰甲喹MEQ標(biāo)準(zhǔn)品（Mequindox，C11H10N2O3，純度99.0%）；1DB35/T 19842021 乙酰甲喹代謝物M1標(biāo)準(zhǔn)品（2-isoethanol mequinoox，C11H12N2O3，純度99.0%）； 乙酰甲喹代謝物M2標(biāo)準(zhǔn)品（2-isoethanol-1-desoxymequindox，C 11H12N2O2，純度9

6、9.0%）； 乙酰甲喹代謝物M3標(biāo)準(zhǔn)品（1-desoxymequindox，C11H10N2O2，純度99.0%）； 乙酰甲喹代謝物M4標(biāo)準(zhǔn)品（bisdesoxymequindox，C11H10N2O，純度99.0%）； 乙酰甲喹代謝物M10標(biāo)準(zhǔn)品（2-isoethanol bisdesoxymequindox，C11H12N2O，純度99.0%）； 乙酰甲喹及5種代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取適量乙酰甲喹、乙酰甲喹代謝物M1、M2、M3、M4、M10標(biāo)準(zhǔn)品（精確至0.1 mg），分別置于6個(gè)100 mL容量瓶中，用甲醇分別溶解并定容至刻度，配制成濃度均為100 g/mL的6種不同化合物的標(biāo)準(zhǔn)貯備

7、液，4 8 保存，有效期2個(gè)月； 乙酰甲喹及5種代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液：分別準(zhǔn)確移取1.00 mL以上乙酰甲喹及5種代謝物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一10 mL容量瓶中，用體積比為38+62的甲醇-水流動(dòng)相溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，配制成濃度為10 g/mL的6種不同化合物的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，即配即用； 乙酰甲喹及5種代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確移取0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL以上乙酰甲喹及5種代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)中間液于不同的50 mL容量瓶中，用體積比為38+62的甲醇-水流動(dòng)相溶液稀釋并定容至刻度，搖勻，得到不同濃度的乙酰甲喹及代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（質(zhì)量

8、濃度分別為0.05 g/mL、0.10 g/mL、0.20 g/mL、0.50 g/mL、1.00 g/mL），即配即用； 水相微孔濾膜：0.22 m。 6 儀器和設(shè)備 高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器或二極管陣列檢測(cè)器。 組織搗碎機(jī)：轉(zhuǎn)速12 000 r/min。 離心管：50 mL（螺旋蓋），10 mL（具塞）。 離心機(jī)：50 mL，10 mL，轉(zhuǎn)速不低于4 000 r/min。 均質(zhì)器：功率不低于500 W。 電子天平：感量0.1 mg，0.01 g。 渦旋混合器。 超聲波清洗器：功率不低于250 W。 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。 7 分析步驟 樣品前處理 7.1.1 試樣制備 按照GB/T 30891

9、2014附錄B的規(guī)定，取可食部分用組織搗碎機(jī)（6.2）勻漿，備用。如不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)在-18 以下保存?zhèn)溆谩?7.1.2 提取 稱取勻漿后的樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加20 mL二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液，振搖混勻，用均質(zhì)器均質(zhì)，再超聲提取15 min，4 000 r/min離心10 min，將提取液移至100 mL雞心瓶2 DB35/T 19842021 中。殘?jiān)儆?0 mL二氯甲烷-乙酸乙酯混合提取液重復(fù)以上萃取和離心步驟，合并上清液于雞心瓶中，40 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。 7.1.3 凈化 向蒸發(fā)近干的雞心瓶中準(zhǔn)確加入1.00 mL體積比為38+62的甲醇-水流

10、動(dòng)相、5 mL正己烷渦旋混合1 min溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至10 mL具塞離心管中，4 000 r/min離心10 min，棄去上層正己烷，下層溶液過0.22 m微孔濾膜后，供液相色譜分析。 樣品測(cè)定 7.2.1 高效液相色譜參考條件 以下分析條件可供參考，采用其它條件應(yīng)驗(yàn)證其適用性： 色譜柱：C18，150 mm4.6 mm i.d.，粒徑3 m，或性能相當(dāng)者； 柱溫：35 ； 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：240 nm； 進(jìn)樣體積：10 L； 流速：0.8 mL/min； 流動(dòng)相：梯度洗脫。流動(dòng)相及梯度洗脫條件見表1。 表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件 時(shí)間 min 流動(dòng)相A（超純水） % 流動(dòng)相B（甲醇） % 0.

11、00 8.00 62.0 62.0 30.0 30.0 62.0 62.0 38.0 38.0 70.0 70.0 38.0 38.0 11.00 17.00 18.00 22.00 7.2.2 液相色譜測(cè)定 7.2.2.1 分別取適量的乙酰甲喹及5種代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及待測(cè)樣液，按7.2.1列出的條件進(jìn)行液相色譜分析測(cè)定。由保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量，根據(jù)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度及乙酰甲喹及5種代謝物響應(yīng)峰面積，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。工作曲線線性相關(guān)系數(shù)R0.99。 27.2.2.2 待測(cè)樣液中乙酰甲喹及5種代謝物的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)行分析。分析間每20次樣

12、品測(cè)定后應(yīng)加入一個(gè)與樣品峰面積相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液，如果測(cè)得的值與原值相對(duì)平均偏差超過5%，則應(yīng)重新進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。標(biāo)準(zhǔn)樣品及典型樣品色譜圖參見附錄A。 3 DB35/T 19842021 8 結(jié)果計(jì)算與表示 結(jié)果計(jì)算 試樣中乙酰甲喹及其代謝物的含量按式（1）進(jìn)行計(jì)算： X cV f （1） m式中： X試樣中乙酰甲喹及代謝物的含量（以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)），單位為毫克每千克（mg/kg）； c由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得出的乙酰甲喹及代謝物濃度，單位為微克每毫升（g/mL）； V試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）； f試樣稀釋倍數(shù)； m試樣質(zhì)量，單位為克（g）。 結(jié)果表示 8.2.1 測(cè)定結(jié)果以平行測(cè)定的算術(shù)平

13、均值表示。 8.2.2 測(cè)定結(jié)果1 mg/kg時(shí)，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。 8.2.3 測(cè)定結(jié)果1 mg/kg時(shí)，有效數(shù)字保留到小數(shù)點(diǎn)后第3位。 9 回收率、重現(xiàn)性、再現(xiàn)性和靈敏度 回收率 回收率試驗(yàn)結(jié)果參見附錄B。 重復(fù)性 9.2.1 0.003 mg/kg被測(cè)組分含量0.01 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)32%。 9.2.2 0.01 mg/kg被測(cè)組分含量0.1 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)22%。 9.2.3 0.1 mg/kg被測(cè)組分含量1.0 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)18%。 9.2.4 被測(cè)組分含量1.0 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)14%。 再現(xiàn)性 9.3.1 0.003 m

14、g/kg被測(cè)組分含量0.01 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)46%。 9.3.2 0.01 mg/kg被測(cè)組分含量0.1 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)34%。 9.3.3 0.1 mg/kg被測(cè)組分含量1.0 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)25%。 9.3.4 被測(cè)組分含量1.0 mg/kg時(shí)，精密度RSD應(yīng)19%。 靈敏度 本文件測(cè)定水產(chǎn)品中乙酰甲喹及其5種主要代謝物殘留量的檢出限均為0.003 mg/kg，定量限均為0.010 mg/kg。 4 DB35/T 19842021附 錄 A（資料性）色譜圖示例色譜圖示例參見圖A.1圖A.5。0.500.400.300.200.100.002.003

15、.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00min圖A.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖0.700.600.500.400.300.200.100.00-0.102.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00min圖A.2 蝦肉試樣色譜圖0.0300.0250.0200.0150.0100.0050.0002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015

16、.0016.0017.00min圖A.3 青蛤肉試樣色譜圖5DB35/T 198420210.700.600.500.400.300.200.100.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00min圖A.4 蟹肌肉試樣色譜圖0.140.120.100.080.060.040.020.000.002.004.006.008.0010.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00min圖A.5 鰻鱺肌肉試樣色譜圖6DB35/T 19842021附 錄 B（資料性）回收率試驗(yàn)

17、研究結(jié)果回收率研究結(jié)果見表B.1。表B.1 回收率研究結(jié)果回收率添加水平%樣品基質(zhì)（mg/kg）MEQM1M2M10M3M40.010.020.200.010.020.200.010.020.200.010.0260.282.270.285.581.289.276.094.492.2118.084.494.261.274.490.594.760.478.270.598.190.2102.264.268.280.184.576.294.270.190.689.4102.372.478.294.598.162.471.472.281.591.2102.368.274.294.598.181.295.160.670.283.286.195.7103.760.284.464.591.261.064.473.582.192.498.464.480.284.595.292.7102.482.494.491.595.786.495.584.290.472.174.560.270.47