1、邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織基因的表達(dá)特征研究卓少元方肇勤盧文麗潘志強(qiáng)梁超吳中華劉小美侯俐張輝廖明娟高必峰【摘要】目的提醒H22荷瘤小鼠邪毒壅盛證腫瘤組織基因表達(dá)的特征。方法采用GenehipuseExn1.0STArray等技術(shù)及芯片分析方法，觀察H22荷瘤小鼠邪毒壅盛、早期氣虛、中期陽氣虛及中晚期氣陰陽虛證腫瘤組織基因表達(dá)的差異。結(jié)果挑選到邪毒壅盛證獨(dú)特性高表達(dá)的基因32個(gè)，其中包括Tte3、Phf7、Ldh等參與睪丸發(fā)育、精子或卵子發(fā)生的基因22個(gè)，Adipq、Nra、Tnfaip6等與腫瘤有關(guān)的基因4個(gè)，以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6個(gè)。挑選到邪毒壅盛證

2、獨(dú)特性低表達(dá)的基因2個(gè)，有rt和L668417。結(jié)論邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織中存在大量獨(dú)特性表達(dá)的基因，可能是該證候與其他證候區(qū)別的內(nèi)在特征?！娟P(guān)鍵詞】腫瘤；證候；同病異證；邪毒壅盛證；基因芯片；小鼠Abstrat：bjetiveTinvestigategenesexpressinprfileinturtissuesfH22ieithbstrutinfevilsyndres.ethdsGenesexpressinintheturtissuesfH22ieithsyndresfbstrutinfevilsyndres,“Qidefiieny,defiienyf“QiandYang,rde

3、fiienyf“QiYinandYang,ereanalyzedbyAffyetrixGenehipuseExn1.0STArray.Results32speialhigher-expressingeneserebserved,inluding22geneshihinvlveintestilegrth,speratgenesisrgenesis,4genesrelatedtturs,and6thergene.Siultaneusly,2speialler-expressingeneserebserved.nlusinNuerusgeneshavespeialexpressinintheturt

4、issuefH22ieithbstrutinfevilsyndres,hihaybeintrinsidifferenebeteenthissyndreand3thersyndres.Keyrds：Tur;Syndre;DifferentSyndrefrthesaedisease;bstrutinfEvilSyndres;Genehip;ie“同病異證和“同病異治是中醫(yī)理論的特色之一，其內(nèi)在物質(zhì)根底是什么，是長期以來被關(guān)注和研究的課題。本工程組以往的研究建立起H22荷瘤小鼠常見證候的標(biāo)準(zhǔn)化檢測與辨證14，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的開展，荷瘤小鼠會(huì)自發(fā)形成證候并發(fā)生演變，早期以邪毒壅盛證和氣虛證為主，以后開展

5、為陽氣虛證和氣陰陽虛證，與人類非常相似5，6。為提醒“同病異證物質(zhì)根底，我們采用Affyetrix的GenehipuseExn1.0STArray技術(shù)，對(duì)H22荷瘤小鼠邪毒壅盛證、氣虛證、陽氣虛證和氣陰陽虛證4個(gè)常見證候的腫瘤、下丘腦、垂體、腎上腺等組織基因的表達(dá)進(jìn)展了檢測。本文重點(diǎn)討論邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織基因表達(dá)的特征?，F(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1芯片檢測數(shù)據(jù)的獲取采用工程組最近研究獲得的4種常見證候荷瘤小鼠腫瘤組織的外顯子芯片數(shù)據(jù)：昆明種小鼠購自上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，雄性，體重24g26g，合格證號(hào)SXK滬2022-0003，清潔級(jí)，腋下接種H22腫瘤腹水癌細(xì)胞后，采用

6、小鼠計(jì)量化四診和辨證方法1，挑選出最典型的早期接種后8d邪毒壅盛證和氣虛證，中期接種后21d陽氣虛證和中晚期接種后29d氣陰陽虛證荷瘤小鼠各16只，并分別提取4個(gè)不同證候小鼠腫瘤組織RNA，將各證候16個(gè)樣本合并，采用AffyetrixGenehipuseExn1.0STArray及其方法進(jìn)展檢測。外顯子芯片的檢測結(jié)果有兩種輸出方式：外顯子和核心基因。本文取16661個(gè)核心基因進(jìn)展初步分析7。1.2芯片數(shù)據(jù)的處理1.2.1相關(guān)基因的挑選條件四張芯片中讀數(shù)至少有一組芯片統(tǒng)計(jì)讀數(shù)以下簡稱讀數(shù)大于270的基因該芯片讀數(shù)均數(shù)，以排除那些表達(dá)過低者；邪毒壅盛芯片讀數(shù)與單純氣虛、陽氣虛、氣陰陽虛等3組比值

7、，大于2.0或小于0.5的基因視為上、下調(diào)的基因。1.2.2相關(guān)基因信息的挖掘利用互聯(lián)網(wǎng)上最具代表性、權(quán)威性的生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫NBI和清華同方全文數(shù)據(jù)庫NKI等，對(duì)符合挑選條件的相關(guān)基因進(jìn)展文獻(xiàn)信息挖掘和分析。2結(jié)果在芯片的16661個(gè)基因中，至少有一組讀數(shù)大于270的基因有6342個(gè)。其中，邪毒組與氣虛、陽虛、陰虛3組相比，比值均大于2.0的基因有Tte3、Vd2、ael、Atp8b3、Tuba3和Gst5等32個(gè)，而比值均小于0.5的有rtistatin和L668417等2個(gè)基因。根據(jù)其參與的生物學(xué)功能大體上可以分為以下幾類。2.1邪毒壅盛證腫瘤組織獨(dú)特高表達(dá)的基因2.1.1參與睪丸發(fā)育

8、、精子發(fā)生和成熟或卵子發(fā)生的基因有Tte3，Phf7，Ldh，Vd2，ael，F(xiàn)hl4，Tuba3等22個(gè)基因，這類基因在早期邪毒壅盛H22荷瘤小鼠腫瘤組織中的表達(dá)量都非常高，甚至個(gè)別基因芯片讀數(shù)大于500見表1；在正常小鼠中，這類基因大多數(shù)在睪丸組織特異表達(dá)，還有少數(shù)基因雖在其它組織中也有表達(dá)，但以睪丸組織表達(dá)程度最高。如Tte3，即T復(fù)合體相關(guān)睪丸表達(dá)3t-plex-assiatedtestisexpressed3基因，它來源于小鼠T復(fù)合體區(qū)域、并在小鼠睪丸生殖細(xì)胞中特異性表達(dá)8，在小鼠睪丸中通過與活性很高的酪氨酸激酶2asEinkinase2，K2的調(diào)節(jié)亞基特異性識(shí)別，參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和增

9、殖9；而在很多組織中都有表達(dá)Phf7PHDfingerprtein7，在人類和小鼠睪丸組織僅在支持細(xì)胞中表達(dá)表達(dá)程度很高，主要參與精子發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)10；Ldh基因編碼蛋白乳酸脫氫酶4latatedehydrgenase-4，LDH-4是一種僅在哺乳動(dòng)物睪丸中表達(dá)的代謝酶，基因核心啟動(dòng)子含有的G盒-70-65和REAP應(yīng)答元件，-53-49，-39-35是其在睪丸中完全表達(dá)所必需的順式作用元件11。表1邪毒壅盛證腫瘤組織獨(dú)特性高表達(dá)的參與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生等有關(guān)基因略*局部功能給予詳細(xì)介紹的重要基因2.1.2與腫瘤有關(guān)的基因包括Adipq、Nra、Tnfaip6和Pld4等4個(gè)基因見表2。這類

10、基因的表達(dá)產(chǎn)物是細(xì)胞因子、黏附分子或酶類，不僅具有正常的生理功能，還與腫瘤有比擬親密的關(guān)系。如脂聯(lián)素Adipq是脂肪細(xì)胞分泌的一種脂肪細(xì)胞因子，具有增加胰島素敏感性、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抑制炎癥反響等作用，低脂聯(lián)素程度可獨(dú)立增加患子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等的危險(xiǎn)性，脂聯(lián)素可能具有抗腫瘤活性12；Nra，即神經(jīng)原相關(guān)細(xì)胞粘附分子neurn-glia-A-relatedelladhesinleule，在人黑色素瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞和組織中，是-atenin/LEF-1信號(hào)途徑的一個(gè)靶基因，其表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞的遷移和腫瘤的發(fā)生13可能是通過金屬蛋白酶etallprtease介導(dǎo)的NRA脫落的胞外區(qū)來實(shí)

11、現(xiàn)的14；而腫瘤壞死因子誘導(dǎo)蛋白6Tnfaip6，turnersisfatralphainduedprtein6，又名TSG6，在炎癥損傷和卵巢排卵過程中表達(dá)上調(diào)，表現(xiàn)出抗炎活性、并在雌性生殖中起關(guān)鍵作用15，可作為前列腺癌或癌前期損傷診斷和預(yù)后的一個(gè)潛在靶標(biāo)16；Pld4磷脂酶4是G1/S期表達(dá)的早期基因之一，可能在細(xì)胞生長中起重要作用，Pld4RNA在再生肝中的表達(dá)明顯高于正常肝臟，并廣泛分布于腫瘤細(xì)胞如肝細(xì)胞瘤hepata和sr轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中17。2.1.3其他功能的基因有6個(gè)，即Atp8b3，Pnpla3，Retn，L380907，Efhd1和Phyhipl。見表3。表2邪毒壅盛證腫瘤組

12、織獨(dú)特性高表達(dá)的與腫瘤有關(guān)的基因略*局部功能給予詳細(xì)介紹的重要基因2.2邪毒壅盛證腫瘤組織獨(dú)特性低表達(dá)的基因這類基因很少，僅有rt和L668417兩個(gè)見表4。其中，rt的基因產(chǎn)物皮質(zhì)抑素rtistatin，RT或ST，是一種在構(gòu)造上與生長抑素satstatin，SRIF非常相似的神經(jīng)肽，可與所有的生長抑素受體結(jié)合，表現(xiàn)出神經(jīng)元活性受抑等與SRIF共同的特性。但是，它也有許多與生長抑素不同的特性，例如與大腦皮層中乙酰膽堿的興奮作用相拮抗誘導(dǎo)慢波睡眠、自發(fā)活動(dòng)減少，以及對(duì)生長抑素沒有反響的陽離子選擇性電流的激活等。此外，RT存在于人類內(nèi)分泌胰腺，可能參與胰島素和/或胰高血糖素程度的調(diào)節(jié)18。表3邪

13、毒壅盛證腫瘤組織獨(dú)特性高表達(dá)的其他類基因略表4邪毒壅盛證腫瘤組織獨(dú)特性低表達(dá)的基因略*局部功能給予詳細(xì)介紹的重要基因3討論證候的形成有著復(fù)雜的物質(zhì)根底，為此，采用基因芯片這樣高效、大通量的檢測手段非常必要。為了防止荷瘤小鼠個(gè)體的差異，我們采用了標(biāo)準(zhǔn)化的小鼠四診檢測與計(jì)量化的辨證方法，并將同一證候最典型的16只小鼠腫瘤RNA樣本合并，使芯片檢測數(shù)據(jù)可以較客觀地反映出各證候的集中趨勢。GenehipuseExn1.0STArray含有16661個(gè)基因，面對(duì)如此多的基因，如何挑選那些可能具有重要病理意義的基因呢？基于功能重要的基因往往表達(dá)量大的生物學(xué)特點(diǎn)，我們?nèi)∷行酒x數(shù)均數(shù)270作為入選標(biāo)準(zhǔn)，在

14、4個(gè)組別中一致小于該均數(shù)者放棄，希望能首先關(guān)注那些表達(dá)量較大者。邪毒壅盛是H22荷瘤小鼠早期一個(gè)常見的證候，突出表如今腫瘤增長迅速、小鼠死亡率高、預(yù)后差，與同期的氣虛證有很大的區(qū)別，是典型的同病異證6，7。是哪些基因表達(dá)的改變導(dǎo)致了這種證候的發(fā)生，并使得腫瘤增長如此迅速？通過對(duì)4張不同證候腫瘤芯片讀數(shù)的分析，我們看到，與其他3種證候相比，在邪毒壅盛證荷瘤小鼠腫瘤組織獨(dú)特性表達(dá)的34個(gè)基因中，有32個(gè)基因表達(dá)升高，其中竟有22個(gè)以往的研究發(fā)現(xiàn)與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生和成熟或卵子發(fā)生等有關(guān)，這些基因不僅數(shù)目眾多，而且表達(dá)量大。邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織有如此多的參與發(fā)育生殖的基因，這還是首次被觀

15、察到。通過文獻(xiàn)檢索我們還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)基因中包括有細(xì)胞因子或粘附分子類基因，或多或少與各種腫瘤有著親密的關(guān)系，具有共性。這些基因在邪毒壅盛證小鼠腫瘤表達(dá)獨(dú)特，很可能是該證候小鼠腫瘤快速增長、并導(dǎo)致該證候與其他證候差異的關(guān)鍵物質(zhì)根底之一。該結(jié)果還提示，不管是邪毒壅盛證，還是其他證候，確實(shí)存在著獨(dú)特性表達(dá)的基因，有規(guī)律可循，并可能是中醫(yī)證候理論復(fù)雜內(nèi)涵的一角。因此，本研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)“同病異證的物質(zhì)根底以及我們今后深化的研究奠定了基?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1方肇勤.辨證論治實(shí)驗(yàn)方法學(xué)實(shí)驗(yàn)小鼠診法和辨證,第1版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,2022:132.2方肇勤,潘志強(qiáng),付曉伶,等.小鼠四診采集工程標(biāo)準(zhǔn)的建議J

16、.中國中醫(yī)根底醫(yī)學(xué)雜志,2022,11(9):692.3方肇勤,潘志強(qiáng),湯偉昌,等.小鼠四診工作站構(gòu)建與操作標(biāo)準(zhǔn)討論J.上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2022,20(1):42.4方肇勤,潘志強(qiáng),盧文麗,等.小鼠常見證候的辨證標(biāo)準(zhǔn)J.中國中醫(yī)根底醫(yī)學(xué)雜志,2022,12(7):508.5方肇勤,潘志強(qiáng),陳曉.實(shí)驗(yàn)小鼠四診方法學(xué)的創(chuàng)立和意義J.上海中醫(yī)藥大學(xué)雜志,2022,40(7):1,封3.6方肇勤,侯俐,盧文麗,等.荷瘤小鼠證候的發(fā)生、演變、兼證及預(yù)后J.上海中醫(yī)藥雜志,2022,41(1):57.7方肇勤,盧文麗,潘志強(qiáng),等.不同證候荷瘤小鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)基因轉(zhuǎn)錄的特征J.中華中醫(yī)藥雜志,

17、2022，(增刊):8.8RappldGA,TrsdaleJ,LihterP.Assignentfthehuanhlgueftheuset-plexgeneTTE3thuanhrse6q27J.Genis.1992Aug;13(4):1337.9BaiX,hanED,XuX.TheprtEinfanegene,Ttex4,interatsithprteinkinaseK2betasubunitandishighlyexpressedinusetestisJ.BiheBiphysResun，2022Jul18;307(1):86.10XiaJ,Xu,LiJ,etal.NYD-SP6,anvelg

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