1、本文檔下載自 HYPERLINK / 文庫下載網(wǎng)，內(nèi)容可能不完整，您可以點擊以下網(wǎng)址繼續(xù)閱讀或下載： HYPERLINK /doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.html /doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.html柱前衍生化RP_HPLC法分離苯乙醇胺類化合物對映體_楊晶第26卷第1期2009年1月沈陽藥科大學學報JournalofShenyangPharmaceuticalUniversityVol.26No.1p.36Jan.2009文章編號:100622858(2009)0120036204柱前衍生化RP2HPLC法分離苯乙醇胺類化合物對映體

2、楊晶,關(guān)瑾11,2,潘莉,程卯生,李發(fā)美331(1.沈陽藥科大學藥學院,遼寧沈陽110016;2.110124;3.沈陽藥科大學,)2摘要:目的以2,3,4,6222DTC)為手性衍生化試劑,建立苯乙采用RP2HPLC法。考察了衍生化反應(yīng)中堿,并考察流動相的組成和pH值等因。討論了化合物的分子結(jié)構(gòu)對手性衍生化及衍生后的非對-1映異構(gòu)體色譜分離的影響。結(jié)果在三乙胺和GITC的濃度分別為10和5mmol?L的乙腈溶液中,室溫下反應(yīng)20min后,有5個苯乙醇胺化合物轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的非對映異構(gòu)體的硫脲衍生物。在-1色譜條件為:DiamonsilC18色譜柱(150mm4.6mm,5m),30mmol?L醋

3、酸銨(pH6.0)2乙腈-1(體積比為5050)為流動相,檢測波長254nm,流速1.0mL?min,室溫下,5個苯乙醇胺化合物對映體衍生化后非對映異構(gòu)體的分離度達到4以上。結(jié)論該方法可作為苯乙醇胺類化合物對映體分離的方法之一。關(guān)鍵詞:反相高效液相色譜法;手性分離;手性衍生化;苯乙醇胺類化合物對映體中圖分類號:R917文獻標志碼:A苯乙醇胺腎上腺素受體(222AR)激動劑是2AR激動劑的一種,主要用于治療支氣管哮喘、慢性支氣管炎和肺氣腫等引起的氣道阻塞性疾病。絕大多數(shù)的苯乙醇胺類2AR激動劑分子中具有手性中心,存在光學異構(gòu)體,通常左旋苯乙醇胺2AR激動劑藥理活/doc/1aa3982eeff9

4、aef8941e06b9.html性高于右旋體1。建立此類化合物的手性分離方法對深入研究其對映體的藥效、藥理作用具有重要意義。目前對苯乙醇胺類2AR激動劑的手性分離方法多采用高效液相手性固定相法2-4體,分離度均達到4以上。討論了化合物的結(jié)構(gòu)與衍生化反應(yīng)及手性分離的關(guān)系,進一步擴展了GITC的應(yīng)用。方法簡單、操作方便,可以用于對映體的質(zhì)量控制及立體選擇性藥物代謝動力學的研究。與價格昂貴的手性固定相法相比,大大降低了分析成本,為苯乙醇胺類化合物的手性分離提供了一個有力工具。1儀器與材料JASCOPU2980高效液相色譜系統(tǒng)(日本Jas2co公司),ANASTRA色譜工作站(美國SuntekSci

5、ence公司)。,尚未有采用手性衍生化法分2離此類化合物的報道。2,3,4,62四2O2乙?；?D2葡萄糖異硫氰酸酯(GITC)是應(yīng)用廣泛的衍生2化試劑之一,常作為氨基酸、氨基醇等類化合物的衍生化試劑5-8。作者首次采用GITC柱前衍生化法,將苯乙醇胺類化合物18(化學結(jié)構(gòu)式見圖1)對映體轉(zhuǎn)化為非對映異構(gòu)體后,采用RP2HPLC法在DiamonsilC18色譜柱上進行分離。成功地分離了克倫普羅(7)等5對苯乙醇胺對映苯乙醇胺類化合物18(實驗室自制,純度2質(zhì)量分數(shù)99%),2,3,4,62四2O2乙?；?D2葡萄糖異硫氰酸酯(GITC,美國Sigma公司),甲醇、乙腈(色譜純,天津市康科德科技

6、有限公司),醋酸銨、磷酸二氫鉀、三乙胺(分析純,天津市恒興化學試劑制造有限公司),水(重蒸水,實驗室自制)。收稿日期:2008204209作者簡介:楊晶(19812),女(漢族),黑龍江哈爾濱人,博士研究生,E2mailhuyjsprite;李發(fā)美/doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.html(19472),女(漢族),江西興國人,教授,主要從事藥物色譜分析新技術(shù)新方法和藥物體內(nèi)過程研究,Tel.024223986289,E2maillifamei。第1期楊晶等:柱前衍生化RP2HPLC法分離苯乙醇胺類化合物對映體Faminecompounds1-822.1色譜條件冰箱放

7、置3周穩(wěn)定)100L,并加入10mmol?L三乙胺的乙腈溶液100L,蓋緊試管塞,渦旋混合1min,室溫放置反應(yīng)20min,取10L進樣,記錄色譜圖。2.3衍生化條件考察GITC是一種非?；顫姷漠惲蚯杷狨ヮ愌苌噭?在室溫下即可與氨基發(fā)生反應(yīng),得到穩(wěn)定的非對映異構(gòu)的硫脲衍生物。作者研究的化合物結(jié)構(gòu)中由于苯環(huán)上的氨基電子云密度降低,只有脂肪側(cè)鏈上的NH與GITC進行11的化學反應(yīng)。以克倫普羅(7)為例,與GITC的衍生化反應(yīng)見圖2。-1色譜柱:DiamonsilC18柱(150mm4.6mm,-15m);流動相:30mmol?L醋酸銨(pH6.0)2乙腈(體積比為5050);檢測波長:254n

8、m;柱溫:室溫;流速:1.0mL?min;進樣量:10L。2.2衍生化條件稱取苯乙醇胺類對映體混合物樣品適量溶于乙腈中,配制成1mmol?L的樣品溶液。取-11mmol?L的樣品溶液100L置于10mL具塞-1試管中,加入5mmol?LGITC的乙腈溶液(4-1-1Fig.2DerivatizationreactionofclenproperolandGITC2.3.1三乙胺的濃度對衍生化反應(yīng)的影響實驗所用化合物均以其鹽酸鹽的形式存在,而化合物與GITC的衍生化反應(yīng)屬于親核反應(yīng),化合物的鹽酸鹽與GITC無法/doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.html直接進行反應(yīng),故須在

9、堿性條件下反應(yīng),此時胺上的N孤對電子以游離形式存在,有利于親核反應(yīng)的進行。實驗采用三乙胺(TEA)為堿化試劑,用以中和鹽酸并為衍生化反應(yīng)提供堿性環(huán)境,從而省去了將化合物的鹽酸鹽處理為游離堿的繁瑣步驟。實驗中考察-1了TEA濃度在130mmol?L內(nèi)時,對各對苯乙醇胺化合物衍生化的影響。隨著TEA濃度的增大,各反應(yīng)產(chǎn)物的峰面積(衍生化產(chǎn)率)逐漸增-1大,在TEA的濃度大于10mmol?L后幾乎保持不變。而在高的TEA濃度下,有一定的雜質(zhì)峰出現(xiàn)。所以選擇TEA的濃度為10mmol?L的條件下進行衍生化反應(yīng)。2.3.2GITC的濃度、反應(yīng)時間對衍生化的影響實驗考察了GITC的濃度在120mmol?L

10、內(nèi),對各衍生化反應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),當GITC濃度過低時,仍可在色譜圖上觀測到未反應(yīng)的苯乙醇胺化合物,GITC濃度的增大有利于衍生化反-1應(yīng)的進行;當GITC的濃度增大到5mmol?L時,各衍生化反應(yīng)幾近完全,更高的GITC濃度不再增大衍生化產(chǎn)物的峰面積。GITC與苯乙醇胺類化合物在室溫下迅速反應(yīng),以各化合物衍生后在色譜柱上被洗脫下來的第一個非對映異構(gòu)體的色譜峰面積為衍生化產(chǎn)率的指標(圖3)對反應(yīng)結(jié)果進行評價。從圖3可以看出,各化合物的衍生化37-1-1沈陽藥科大學學報第26卷產(chǎn)率隨著反應(yīng)時間的延長而增大,當反應(yīng)時間達到20min時各衍生化產(chǎn)物的峰面積達到最大,更長的反應(yīng)時間不再增大衍生化產(chǎn)物

11、的峰面積。故選定GITC的濃度為5mmol?L、反應(yīng)時間為20min。-12.4.2有機改性劑的種類和濃度對分離的影響分別選用不同比例的甲醇、乙腈作為有機改性劑,考察有機改性劑的種類和濃度對衍生后非對映異構(gòu)體分離的影響。實驗表明,以甲醇或乙腈為有機改性劑均可以實現(xiàn)衍生物的分離,乙腈更有利于色譜分/doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.html離,不僅非對映異構(gòu)體衍生物的分離度較大而且色譜峰峰形對稱。乙腈的體積分數(shù)在40%70%內(nèi)變化時,分離度有所減小,與GITC交叉現(xiàn)象。當-1(pH值為6.0)和乙腈的體積5050時,所有衍生化后的非對映異構(gòu)體在較短的保留時間下均可達到良好

12、分離(Rs4)。在本實驗選定的條件下,經(jīng)GITC柱前衍生化,采用RP2HPLC法,在流動相為30mmol?L醋酸銨(pH6.0)-乙腈(體積比為5050)、檢測-1波長254nm、流速1.0mL?min、室溫下,化合物14、7與GITC形成非對映異構(gòu)體,并實現(xiàn)了色譜分離,分離度分別為5.7、4.9、4.5、4.0、5.2,其-11Compound1;2Croperol;3Compound3;4Compound2;5Compound4Fig.3Effectofreactiontimeonderivatization2.4色譜條件考察2.4.1緩沖液種類、濃度和pH值對分離的影響在Diamonsi

13、lC18色譜柱上,分別考察了不同濃度的醋酸銨和磷酸二氫鉀,對衍生后非對映異構(gòu)體分離的影響。實驗結(jié)果表明,緩沖鹽的加入可以調(diào)節(jié)色譜峰形,改善峰拖尾,但其種類和濃度對色譜分離影響不大,故選擇在水相中添加-130mmol?L醋酸銨。通常緩沖溶液的pH值是影響色譜分離的主要因素,實驗考察了緩沖溶液的pH值為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0時對各衍生物的分離度的影響。克倫普羅和化合物14與GITC衍生化反應(yīng)得到的非對映異構(gòu)體的分離度(RS)隨pH的變化趨勢見圖4,可以發(fā)現(xiàn)衍生化后的非對映異構(gòu)體在不同的pH條件下分離度變化不大,最終選擇了一個適中的pH值6.0作為最后分離的條件。色譜圖見圖5。過量的

14、GITC在9min左右出峰,衍生化所得的非對映異構(gòu)體在10min后出峰?；衔?、6和8(馬布/doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.html特羅)均未發(fā)生衍生化反應(yīng),化合物以原形被檢測到。3討論a.GITC結(jié)構(gòu)中反應(yīng)基團異硫氰基與空間位阻較大的全乙?；?D2葡萄糖基直接相連,所以GITC與底物的空間位阻作用對衍生化反應(yīng)影響顯著?；衔?和6屬于22苯基222氨基乙醇化合物,結(jié)構(gòu)中氨基與苯環(huán)之間只隔有1個碳原子,所以苯環(huán)與GITC之間的空間位阻作用阻礙了反應(yīng)的進行?；衔?4、7、8屬于12苯基222氨基乙醇化合物,氨基與苯環(huán)相隔2個碳原子,但在化合物8結(jié)構(gòu)中氨基與立體位阻

15、很大的叔丁基直接相連,叔丁基與GITC的空間位阻作用導致衍生化反應(yīng)不能進行;而其他5個化合物氨基上的取代基均為位阻小的異丙基和正丁基,與GITC的空間位阻作用小,可以順利發(fā)生衍生化反應(yīng)得到非對映異構(gòu)體衍生物。b.在選定的色譜條件下,上述5對12苯基2221Compound1;2Clenproperol;3Compound2;4Compound3;5Compound4Fig.4EffectofpHvalueonresolution38氨基乙醇類化合物非對映異構(gòu)體的分離度均大于4,且相差不多?？梢酝茰y出,GITC的大分子結(jié)構(gòu)在色譜分離中起到主要作用。GITC結(jié)構(gòu)中的全乙?；?D2葡萄糖基具有剛性強

16、、親脂性強的第1期楊晶等:柱前衍生化RP2HPLC法分離苯乙醇胺類化合物對映體特點,從而對非對映異構(gòu)衍生產(chǎn)物的色譜行為差異有直接影響。化,首次建立了苯乙醇胺類化合物對映體的GITC柱前衍生化高效液相色譜法。該方法簡單易行,為苯乙醇胺類化合物的手性分離提供了一個有力工具。作者成功分離了用在之前建立的Chiral24pakAS2H手性固定相法無法分離的5個化合物,兩種分離手性苯乙醇胺類化合物的方法各有特色,并具有一定的互補性。參考文獻1B.tandasthma2100J.EurJPharma/doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.htmlcol,2002,445(1/2):1-

17、12.2ZHANGDan2dan,LIFa2mei,KIMDH,etal.Resolutionof2blockersonachiralstationaryphasebasedon( )2(182crown26)22,3,11,122tetracarboxylicacid:UnusualtemperatureeffectJ.JChromatogrA,2005,1083(1/2):89-95.3LUXiu2mei,LIUPei,CHENHua2shan,etal.Enantiose2lectivepharmacokineticsofmabuterolinratsstudiedu2singseque

18、ntialachiralandchiralHPLCJ.BiomedChromatogr,2005,19(9):703-708.4YANGJing,GUANJin,PANLi,etal.Enantioseparationandimpuritydeterminationoftheenantiomersofnovelphenylethanolaminederivativesbyhighperformanceliq2uidchromatographyonamylosestationaryphaseJ.AnalChimActa,2008,610(2):263-267.5NIMURAN,TOYAMAA,K

19、INOSHITAT.Opticalreso2lutionofaminoacidenantiomersbyhigh2performanceliquidchromatographyJ.JChromatogrA,1984,316:547-552.6周曄,孫曾培.用GITC手性試劑衍生化高效液相色譜法拆分2氨基醇類藥物對映體J.藥學學報,1990,25(4):311-314.:/doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.htmlr7GALJ,MURPHYRC.Ontheavailabilityof2,3,4,622tetra2O2acetyl2D2glucopyranosylAComp

20、ound1;BCompound2;CCompound3;DCompound4;EClenproperol;1GITC;2,3Diastereoi2somersisothiocyanate,achiralderivatizingagentinHPLCJ.JLiqChroma2togr,1984,7(11):2307-2314.8鄧婕,李志良,肖玉梅,等.柱前衍生高效液相色譜法Fig.5HPLCofofdiastereoisomeroffivephenylethano2laminecompoundsafterderivatization分離分析12氮雜雙環(huán)2,2,2辛232基胺對映異構(gòu)體J.分析化

21、學,2006,34(10):1475-1478.4結(jié)論作者通過對衍生化條件和色譜條件進行優(yōu)(下轉(zhuǎn)至第44頁)39沈陽藥科大學學報第26卷Abstract:ObjectiveTodevelopaHPLCmethodforsimultaneousdeterminationofkakkalide,irisolidone,tectorigenin272O2xylosylglucosideandbiochaninAinflowersofPuerarialobata.MethodsTheHPLCanal2ysiswascarriedoutonaKromasilC18(200mm4.6mm,5m)colum

22、n,withalinearitygradientof1?eticacidinwater()2methanol2acetonitrile,atthe/doc/1aa3982eeff9aef8941e06b9.htmlflowrateof0.8mL?min.Thedetectivewavelengthwassetat254nm,andthecolumntemperaturewassetat35.ResultsThecalibrationcurvewaslinearwithintherangeof42.8-856mg?L-1-1forkakkalide,9.12-182.4mg?L21-1forir

23、isolidone,13.2-264mg?L-1fortectorigenin272O2xylosylglucosideand4.2-84mg?LforbiochaninA,respectively.Theaveragerecoveriesforfourmarkercompoundswerefrom98.3%to100.7%.onsThismethodissimple,accurateandpracticalforqualitycontrolofflowedifferencesinthecontentsoffourmarkercompoundsduringtwdifferentmedici2n

24、alparts.Keywords:origenin272O2xylosylglucoside;biochaninA;HPLC(上接第39頁)Chiralseparationofphenylethanolaminecompoundsbypre2columnderivatizationhighperformanceliq2uidchromatography,PANLi,CHENGMao2sheng,LIFa2mei(1.SchoolofPharmacy,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China;2.Sc/doc/1aa3982eef

25、f9aef8941e06b9.htmlhoolofAp2pliedChemistry,ShenyangInstituteofChemicalTechnology,Shenyang110142,China;3.SchoolofPhar2maceuticalEngineering,ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China)YANGJing,GUANJinAbstract:ObjectiveTodevelopapre2columnhighperformanceliquidchromatographicmethodforthesep211,23312arationofsomephenylethanolaminecompoundswith2,3,4,62tetra2O2acetyl2D2glucopyranosylisothiocya2nate(GITC)asderivativeagent.MethodsTheeffectsofconcentrationoftriethylamine(TEA),concentra2tionofGITCandreactiontimeonder