1、果樹(shù)莖尖超低溫脫毒研究進(jìn)展論文摘要：果樹(shù)病毒病害一直是制約果樹(shù)生產(chǎn)持續(xù)開(kāi)展的重要因素。采用無(wú)毒種苗是防控果樹(shù)病毒病害的有效途徑之一。脫毒技術(shù)是生產(chǎn)無(wú)毒苗的核心技術(shù)。莖尖超低溫脫毒是近年來(lái)建立的一種新的脫毒技術(shù)。到目前為止，該技術(shù)已成功地用于脫除包括李 (Prunus)、香蕉 (Musa)、葡萄 (Vitis vinifera)、草莓 (Fragaria glandiglora)和樹(shù)莓 (Rubus idaeus) 等果樹(shù)的6種病毒和柑桔黃龍病 HLB，一種細(xì)菌性病害。與傳統(tǒng)的脫毒方法相比擬，莖尖超低溫脫毒具有脫毒率高、脫毒率不受莖尖大小及超低溫處理方法的影響、脫毒苗生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)。更重要的是

2、，莖尖超低溫處理可同時(shí)實(shí)現(xiàn)脫毒與植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的雙重目標(biāo)。與傳統(tǒng)的脫毒方法一樣，基因型特異性強(qiáng)是限制該技術(shù)廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素。本文全面介紹了果樹(shù)莖尖超低溫脫毒研究的開(kāi)展與現(xiàn)狀，并討論了莖尖超低溫脫毒的機(jī)理，旨在進(jìn)一步推動(dòng)果樹(shù)莖尖超低溫脫毒的研究和應(yīng)用。論文關(guān)鍵詞：超低溫脫毒,超低溫保存,果樹(shù),莖尖,無(wú)毒果樹(shù)病毒病害一直是制約果樹(shù)生產(chǎn)持續(xù)開(kāi)展的重要因素。果樹(shù)被病毒感染后，常表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)減弱,生長(zhǎng)勢(shì)降低，生理代謝減弱，產(chǎn)量和品質(zhì)明顯下降。嚴(yán)重時(shí),造成果樹(shù)消滅性危害。比擬帶毒苗和無(wú)毒苗對(duì)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的影響研究說(shuō)明：蘋(píng)果莖溝病毒(ASGV)對(duì)早酥梨(Pyruspyrifolia)幼樹(shù)生長(zhǎng)有明顯的影

3、響，帶毒苗的株高、干徑和分枝數(shù)較無(wú)毒苗分別降低13%，11%和51%，而秋季落葉率增長(zhǎng)11.4%。王際軒等研究了蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(ACLSV)，蘋(píng)果莖溝槽病毒(ASGV)和蘋(píng)果莖痘病毒(ASPV)對(duì)蘋(píng)果產(chǎn)量的影響，結(jié)果說(shuō)明，金矮生、富士和甜黃魁帶毒苗的產(chǎn)量分別比對(duì)照下降35.4%、31.1%和29.4%。李痘包病毒(PPV)可導(dǎo)致產(chǎn)量降低高達(dá)52.94%。最新的研究說(shuō)明，葡萄扇葉病毒(GFLV)導(dǎo)致Callet;葡萄產(chǎn)量下降20%以上，而葡萄卷葉病毒(GLRaV-1)可導(dǎo)致MantoNegro;葡萄減產(chǎn)高達(dá)40%以上。帶毒苗對(duì)果實(shí)的維生素C、總糖、總酸及果皮中花青苷也有明顯影響。上世紀(jì)40年代

4、巴西圣保羅爆發(fā)的柑桔衰退病(Citrustristezavirus,CTV)對(duì)該地區(qū)的柑桔業(yè)造成了消滅性危害。在果樹(shù)生產(chǎn)上，采用無(wú)毒種苗是防控果樹(shù)病毒病害的有效途徑之一。栽培無(wú)毒苗能明顯促進(jìn)果樹(shù)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與幼苗早結(jié)果，提高產(chǎn)量與品質(zhì)。脫毒技術(shù)是生產(chǎn)無(wú)毒苗的核心技術(shù)。因此，建立高效、簡(jiǎn)易的脫毒技術(shù)無(wú)疑具有重要的研究?jī)r(jià)值和實(shí)踐應(yīng)用意義。果樹(shù)傳統(tǒng)的脫毒技術(shù)包括莖尖培養(yǎng)、熱處理、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)和微型嫁接等。莖尖培養(yǎng)對(duì)莖尖大小要求十分嚴(yán)格，莖尖過(guò)大難以脫毒；而莖尖過(guò)小那么難以再生完整植株。熱處理脫毒費(fèi)工、費(fèi)時(shí)，并且對(duì)耐熱性較強(qiáng)的病毒和耐熱性較差的植物的應(yīng)用受到限制。微型嫁接程序復(fù)雜，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。超低溫

5、保存(Cryopreservation)是將植物的離體材料如莖尖、細(xì)胞等置于液氮中(-196)保存的一種技術(shù)。在液氮條件下，細(xì)胞的分裂活動(dòng)和生理代謝停止。因此，植物離體材料可以無(wú)限期保存，并且保持其遺傳穩(wěn)定性。因此，超低溫保存被視為植物種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存最理想、最有效的方法。自1960年日本的Sakai博士首次報(bào)道植物離體材料超低溫成功保存以來(lái)，該方法已在包括大田作物和園藝植物、草木和木本植物、溫帶和熱帶植物上都有成功的報(bào)道。莖尖超低溫療法(Cryotherapyofshoottips)是將莖尖置于液氮中進(jìn)行短暫處理，脫除病毒的方法。到目前為止，該技術(shù)已成功地用于脫除包括李(Prunus)、香蕉

6、(Musa)、葡萄(Vitisvinifera)、草莓(Fragariaglandiglora)和樹(shù)莓(Rubusidaeus)等果樹(shù)的6種病毒及柑桔黃龍病(HLB,一種細(xì)菌性病害)。莖尖超低溫脫毒被認(rèn)為是脫除植物病毒最有效的方法,為脫毒苗生產(chǎn)開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。更重要的是，莖尖超低溫處理可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源的長(zhǎng)期保存與脫除植物病毒雙重目標(biāo)。本文全面地介紹了果樹(shù)莖尖超低溫脫毒的所有案例，討論了莖尖超低溫脫毒的機(jī)理，與傳統(tǒng)脫毒方法進(jìn)行了比擬。旨在進(jìn)一步推動(dòng)果樹(shù)莖尖超低溫脫毒的研究與應(yīng)用。1果樹(shù)莖尖超低溫脫毒案例介紹1.1李痘包病毒(Plumpoxvirus,PPV)Brison等以感染PP

7、V的李屬種間雜交砧木Fereley-Jaspi(R)試管苗為試材，莖尖經(jīng)玻璃化法超低溫處理后，獲得再生植株。再生植株經(jīng)ELISA和IC-PCR檢測(cè)，其脫毒率為50%。而對(duì)照(莖尖培養(yǎng))的脫毒率僅為19%。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Brison等認(rèn)為，莖尖超低溫脫毒有望成為植物脫毒的一種新的有效方法。1.2黃瓜花葉病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)和香蕉條紋病毒(Bananastreakvirus,BSV)黃瓜花葉病毒(CMV)和香蕉條紋病毒(BSV)分別歸屬于Geminivirus屬和Badnavirus屬病毒，前者通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播,而后者通過(guò)粉蚧傳播。對(duì)香蕉生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，也制約香

8、蕉育種。Helliot等用雙重感染黃瓜花葉病毒(CMV)和香蕉條紋病毒(BSV)的Williams;香蕉品種為試材。供試材料在試管中誘導(dǎo)形成群生分生組織(Meristemclumps)。群生分生組織經(jīng)玻璃化法超低溫處理后,培育成完整植株。植株帶毒狀況檢測(cè)(ELISA)說(shuō)明，分生組織培養(yǎng)對(duì)黃瓜花葉病毒的脫毒率為76%，但完全不能脫除香蕉條紋病毒。而超低溫處理對(duì)黃瓜花葉病毒和香蕉條紋病毒的脫毒率分別為30%和90%。1.3葡萄A病毒(GrapevinevirusA,GVA)葡萄A病毒(GVA)歸屬于Vitivirus，是葡萄克勃莖溝病(Koberstemgrooving,KSG)的病原。葡萄克勃莖

9、溝病(KSG)是葡萄粗皮綜合癥(Rugosewoodcomplex)的四種病癥類(lèi)型之一。葡萄A病毒存在于植株韌皮部，由粉蚧傳播。感染葡萄粗皮綜合癥的植株表現(xiàn)出生長(zhǎng)勢(shì)減弱，植株矮小，春季萌芽延遲，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植株衰退死亡；局部植株嫁接口上部腫大，形成小腳;現(xiàn)象；有的嫁接口上部樹(shù)皮增厚，木栓化，組織疏松粗糙；嫁接口附近的木質(zhì)部和樹(shù)皮形成層?？梢?jiàn)凹陷的莖痘斑或莖溝槽。染病植株萌芽延遲，生長(zhǎng)受到抑制，產(chǎn)量降低，嫁接成活率低。Wang等以田間感染GVA的Bruti;葡萄品種(VitisviniferaL.)試管苗為試材，取1mm的莖尖進(jìn)行超低溫冷凍。再生植株經(jīng)WesternBlotting檢測(cè)其帶毒狀況

10、。結(jié)果說(shuō)明，莖尖超低溫處理的脫毒率為97%,而莖尖培養(yǎng)(0.2mm)為12%。進(jìn)一步的研究說(shuō)明，液氮處理前的各步驟均不能脫毒，唯有液氮處理才能脫毒。這一結(jié)果證明，超低溫脫毒是通過(guò)液氮處理而實(shí)現(xiàn)的。對(duì)超低溫處理獲得的再生植株的形態(tài)觀(guān)察結(jié)果說(shuō)明，其植株的葉片形態(tài)與對(duì)照是一致的。基于上述結(jié)果，作者認(rèn)為莖尖超低溫脫毒是一種簡(jiǎn)便而有效的脫毒技術(shù)，為植物脫毒開(kāi)辟了一條嶄新的途徑。1.4草莓輕型黃邊病毒草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)是危害我國(guó)草莓生產(chǎn)的4種主要病毒之一，主要危害草莓屬植物。SMYEV屬黃癥病毒屬，通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播。單獨(dú)侵染時(shí)，僅使植株輕矮化，但該病毒很少單獨(dú)發(fā)生，常與其他病毒復(fù)合侵染，引起葉片黃

11、化或葉緣失綠，植株生長(zhǎng)勢(shì)嚴(yán)重減弱，植株矮化，產(chǎn)量和果實(shí)質(zhì)量嚴(yán)重下降，減產(chǎn)可高達(dá)75。蔡斌華等以草莓品種明寶;為材料，取莖尖做初代培養(yǎng)。繼代擴(kuò)繁5次后，取2mm左右的莖尖，利用玻璃化超低溫處理莖尖，獲得再生植株。用RT-PCR技術(shù)對(duì)再生植株進(jìn)行病毒檢測(cè)。結(jié)果說(shuō)明，經(jīng)玻璃化超低溫處理后，對(duì)SMYEV的脫除率為95，而對(duì)照完全不能脫毒。1.5樹(shù)莓叢生矮化病毒(Raspberrybushydwarfvirus,RBDV)樹(shù)莓叢生矮化病毒(RBDV)是Idaeovirus屬的唯一一種,該病毒通過(guò)花粉傳播，可危害樹(shù)莓(Rubusidaeus)、羅甘莓(R.loganobaccus)、博伊森莓(R.ursi

12、nus)和黑樹(shù)莓(R.occidentalis)等。在全球懸鉤子屬果樹(shù)主產(chǎn)區(qū)均有分布。給懸鉤子屬果樹(shù)生產(chǎn)造成巨大危害。已有的研究結(jié)果說(shuō)明，樹(shù)莓叢生矮化病毒難以通過(guò)傳統(tǒng)的脫毒技術(shù)(如莖尖培養(yǎng)、熱處理、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)等)脫除。Wang等以感染RBDV的樹(shù)莓試管苗為試材，分別進(jìn)行了莖尖培養(yǎng)(0.1-0.3mm)、熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)(1mm)及莖尖(1mm)超低溫療法。結(jié)果說(shuō)明，上述三種方法均不能脫毒。隨后，Wang等把熱處理和莖尖超低溫相結(jié)合以期脫除RBDV。他們先將帶毒的試管苗置于熱處理?xiàng)l件下(白晝38，黑夜26，16小時(shí)的光周期)處理4-5周后，取莖尖(1mm)進(jìn)行超低溫處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熱處

13、理4-5周的莖尖經(jīng)超低溫處理后，其脫毒率可達(dá)33-35%。由此，他們認(rèn)為，熱處理結(jié)合莖尖超低溫處理可能是目前植物脫毒最有效的一種方法，該法甚至能有效地脫除能侵染莖尖分生組織的病毒，如RBDV。1.6柑桔黃龍病(CitrusHuanglongbing,HLB)柑桔黃龍病(CitrusHuanglongbing,HLB)又稱(chēng)黃梢病、黃枯病、青果病，是由一種被稱(chēng)為韌皮部桿菌的細(xì)菌引起的病害。該細(xì)菌寄生在柑桔韌皮部篩管細(xì)胞內(nèi)，為革蘭氏陰性細(xì)菌(CandidatusLiberobacterasiaticum)。該病原通過(guò)柑桔木虱傳播。HLB能侵染柑桔屬(Citrus)、金柑屬(Fortunella)和枳

14、屬(Poncirus)植物。主要分布在亞洲和非洲的40多個(gè)國(guó)家。在我國(guó)，主要分布在廣東、廣西、福建和臺(tái)灣四省。感病后的柑桔樹(shù)可在3-5年內(nèi)喪失結(jié)果能力，甚至導(dǎo)致植株死亡。給柑桔生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。Ding等對(duì)莖尖超低溫脫除HLB進(jìn)行了系統(tǒng)研究。他們發(fā)現(xiàn)，利用莖尖超低溫處理能有效地脫除HLB。對(duì)5個(gè)材料的HLB脫除率分別為：羅崗橙，93%、碰柑，93%、沙田柚，94%、北京檸檬，91%和紅江橙，91%。2莖尖超低溫脫毒的機(jī)理病毒在植物體內(nèi)的分布是不均勻的：帶毒植株的病毒濃度隨距頂端分生組織靠近而降低；反之，那么升高。因此，頂端分生組織可能形成一個(gè)無(wú)毒區(qū)。莖尖培養(yǎng)正是利用這一概念來(lái)獲得無(wú)毒苗。為

15、了揭示莖尖經(jīng)超低溫脫毒的機(jī)理，對(duì)超低溫處理后成活細(xì)胞在莖尖的分布和超低溫處理前病毒在莖尖的分布做了大量研究。結(jié)果說(shuō)明，莖尖經(jīng)超低溫處理后，絕大局部細(xì)胞被凍死，僅有分生組織頂端幾層細(xì)胞和第一、第二葉原基的局部細(xì)胞能成活。這些成活的細(xì)胞，在超低溫處理前，細(xì)胞胞核大、核仁明顯，胞質(zhì)中的液泡小，高爾基體、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和原質(zhì)體明顯。胞核與胞質(zhì)比大。對(duì)甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)和甘薯褪綠矮縮病毒(SPCSV)在莖尖分生組織中的定位研究說(shuō)明,不管是單一感染還是混合感染，SPFMV僅能侵染第四葉原基及其以外的組織；而SPCSV那么只能侵染第五葉原基及其以外的組織。上述結(jié)果說(shuō)明，帶毒的莖尖經(jīng)超低溫處理后，

16、帶毒的細(xì)胞根本不能成活，而成活的細(xì)胞大多是不帶毒的，由此而發(fā)育的完整植株那么可能是無(wú)毒的。值得注意的是，上述解釋僅適合于不能侵染莖尖分生組織的病毒種類(lèi)，如洋李痘包病毒、香蕉條紋病毒和葡萄A病毒等；而對(duì)那些能侵染莖尖分生組織的病毒(如RBDV)是不適合的。對(duì)這類(lèi)病毒而言，單一的莖尖超低溫處理難以脫毒，熱處理結(jié)合莖尖超低溫處理才可能脫毒。3超低溫脫毒與傳統(tǒng)脫毒技術(shù)的比擬3.1脫毒率高大量的研究說(shuō)明，莖尖超低溫處理的脫毒率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的莖尖培養(yǎng)。以GVA為例，莖尖超低溫處理的脫毒率為97%，而莖尖培養(yǎng)僅能獲得12%的脫毒率。3.2莖尖超低溫脫毒率不受莖尖大小的影響莖尖大小是影響莖尖培養(yǎng)脫毒率的關(guān)鍵因

17、素。莖尖培養(yǎng)時(shí)，多用0.2-0.4mm莖尖,取材難。與之比擬，莖尖超低溫脫毒率不受莖尖大小的影響。以SPFMV和SPCSV為例，用超低溫處理0.5-1.5mm的莖尖均能獲得100%的脫毒率；而莖尖培養(yǎng)時(shí)，0.5-1.0mm的莖尖能完全脫毒，當(dāng)莖尖增大到1.5mm時(shí)，對(duì)SPFMV的脫毒率僅為7%。3.3莖尖超低溫脫毒率不受超低溫方法的影響大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：一種超低溫處理方法可能僅適合于某一(或某些)基因型，而不能適合另一(或另一些)基因型。到目前為此，針對(duì)某一(或某些)基因型已建立了多種莖尖超低溫保存方法。不同基因型多種超低溫保存方法的建立，為不同基因型的超低溫脫毒提供了技術(shù)條件。已有的研究說(shuō)

18、明，不同莖尖超低溫處理方法對(duì)脫毒率沒(méi)有影響。3.4莖尖超低溫脫毒的周期與莖尖培養(yǎng)相似脫毒苗生產(chǎn)周期的長(zhǎng)短會(huì)直接影響無(wú)毒苗的生產(chǎn)本錢(qián)。已有的研究說(shuō)明，莖尖超低溫脫毒所需時(shí)間與莖尖培養(yǎng)相似，而明顯短于熱處理及熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)。3.5莖尖超低溫脫毒表現(xiàn)出基因型特異性大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，超低溫處理表現(xiàn)出基因型特異性，主要影響超低溫處理莖尖的成活率與再生率。這是限制超低溫脫毒廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵因素。然而，傳統(tǒng)的脫毒技術(shù)，如莖尖培養(yǎng)，同樣存在基因型特異性。3.6莖尖超低溫處理可同時(shí)實(shí)現(xiàn)脫毒與種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的雙重目標(biāo)將莖尖置于液氮中長(zhǎng)期處理，可實(shí)現(xiàn)資源的長(zhǎng)期保存；而將莖尖置于液氮中行短暫處理，可實(shí)現(xiàn)脫毒，獲得

19、無(wú)毒苗。因此，莖尖超低溫處理可同時(shí)實(shí)現(xiàn)脫毒與種質(zhì)資源長(zhǎng)期保存的雙重目標(biāo)。4結(jié)論與展望到目前為此，莖尖超低溫療法已成功地用于脫除包括李(Prunus)、香蕉(Musa)、葡萄(Vitisvinifera)、草莓(Fragariaglandiglora)和樹(shù)莓(Rubusidaeus)等果樹(shù)的6種病毒和柑桔黃龍病。與傳統(tǒng)脫毒技術(shù)相比，莖尖超低溫脫毒具有多種優(yōu)點(diǎn)，已被確認(rèn)為一種新的脫毒技術(shù)。目前，尚缺乏對(duì)超低溫脫毒苗的遺傳穩(wěn)定性鑒定與田間表現(xiàn)觀(guān)察的研究，同時(shí)，研究的種類(lèi)較少。應(yīng)加強(qiáng)該技術(shù)在其它果樹(shù)植物上的研究，并逐步在生產(chǎn)中應(yīng)用。致謝本研究得到陜西省13115;工程和西北農(nóng)林科技大學(xué)校長(zhǎng)基金的資助，

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