1、 血站核酸檢測 甘肅省紅十字血液中心12021/7/20 星期二血站核酸檢測的意義 核酸檢測（NAT）可以 有效地縮短病毒特異抗原和抗體免疫測定的“窗口期”，從而減少輸血風(fēng)險，提高輸血安全。22021/7/20 星期二乙型肝炎病毒（HBV）感染檢測中，NAT除可縮短HBV感染檢測的窗口期外，還可以減少HBV急性感染恢復(fù)期、慢性隱匿性HBV感染以及變異病毒株感染的漏檢。丙型肝炎病毒（HCV）感染檢測中，可將HCV感染檢測的窗口期縮短，減少免疫靜默感染的漏檢。人類免疫缺陷病毒（HIV）感染檢測中，可將HIV感染檢測的窗口期縮短。32021/7/20 星期二 檢測窗口期 Window Period4

2、2021/7/20 星期二52021/7/20 星期二核酸研究的歷史 1869 米舍爾（Friedrich Miescher） 從膿球分離出細胞核，不受蛋白酶分解，磷含量高，命名為“核素”(nuclein)。 1944 美國微生物學(xué)家埃弗里（O.T. Avery ）等的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗。 1953 沃森和克里克（WATSON，CRICK）-DNA雙螺旋Francis Crick 62021/7/20 星期二核酸研究的歷史 1960年代中期桑格(Sanger)的DNA測序法 1972 伯格(Paul Berg) 重組DNA技術(shù) 引起人腫瘤的猴病毒基因與噬菌體lambda的重組 1973 博耶（H

3、erbert Boyer）和科恩（Stanley Cohen）-使用重組DNA技術(shù)首次得到了重組DNA微生物(基因工程技術(shù)) 1983 穆利斯（Kary Mullis) PCR技術(shù)72021/7/20 星期二核酸的種類DEOXYRIBONUCLEICACID（DNA）RIBONUCLEIC ACID（RNA） ribosome RNA(rRNA) transfer RNA(tRNA) messenger RNA(mRNA)82021/7/20 星期二核酸的分子組成元素組成 C H O N P （恒定，910%）基本結(jié)構(gòu)單位核苷酸 磷酸 核苷（戊糖 、堿基）92021/7/20 星期二核酸的理化

4、性質(zhì)核酸分子具有強烈的紫外吸收DNA變性是雙鏈解離為單鏈的過程 DNA的增色效應(yīng) Tm值變性的核酸可以復(fù)性或形成雜交雙鏈 復(fù)性 退火 102021/7/20 星期二核酸分子復(fù)性和雜交示意圖112021/7/20 星期二122021/7/20 星期二磁珠提取的原理：第一步：細胞的裂解：破碎細胞，并向溶液中加入磁珠第二步：結(jié)合核酸：pH較低，在高鹽環(huán)境下，硅膠磁珠帶正電荷，選擇性的與 優(yōu)化試劑中的核酸結(jié)合第三步：洗滌：用洗滌液將非核酸成分沖洗分離（為清洗干凈該步驟可以重復(fù)多次）第四步：核酸的洗脫：pH升高，在低鹽環(huán)境下，核酸被洗脫下來132021/7/20 星期二142021/7/20 星期二核酸

5、檢測基本原理核酸檢測：一系列直接檢測病原體核酸的技術(shù)的總稱，對靶核酸直接擴增或?qū)ζ涓綆У男盘枖U增，使看不見的極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號。152021/7/20 星期二NAT檢測技術(shù)方法PCR擴增技術(shù)轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增方法（TMA 、NASBA）其它NAT技術(shù)（bDNA、LAMP、LCR、SDA等）162021/7/20 星期二PCR 原理DNADNA172021/7/20 星期二TMA的原理Transcription-Mediated Amplification 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增技術(shù)模擬DNA 轉(zhuǎn)錄成mRNA 的自然過程DNA模板在反應(yīng)中作為中介利用2個引物和2種酶(RNA聚合酶和逆轉(zhuǎn)錄酶

6、）RNA聚合酶與DNA 模板的啟動子序列結(jié)合等溫擴增（41.5）轉(zhuǎn)錄翻譯逆轉(zhuǎn)錄182021/7/20 星期二TMA的原理特異性靶標(biāo)捕獲特異性捕獲探針與病毒核酸分子及內(nèi)標(biāo)物雜交結(jié)合，并將其固定在磁珠表面。對體系進行重復(fù)的洗滌，去除血液樣品中除病毒核酸外的其他成分。轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增借助逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA多聚酶的共同作用，在等溫條件下，經(jīng)過一小時的擴增得到約10億個目標(biāo)產(chǎn)物片斷。雙動力學(xué)化學(xué)發(fā)光檢測 試劑消除未結(jié)合的檢測探針，雙動力學(xué)化學(xué)發(fā)光檢測，分別檢測內(nèi)標(biāo)與病毒分子信號。192021/7/20 星期二202021/7/20 星期二理想的核酸擴增實驗室設(shè)計A產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向擴增區(qū)空氣流向標(biāo)本制備區(qū)空

7、氣流向 試劑準(zhǔn)備區(qū) 空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間專用走廊工作流向212021/7/20 星期二理想的核酸擴增實驗室設(shè)計B產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向擴增區(qū)空氣流向標(biāo)本制備區(qū)空氣流向 試劑準(zhǔn)備區(qū) 空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間 專用走廊 工作流向222021/7/20 星期二核酸擴增檢測實驗室設(shè)計的一般原則各區(qū)獨立注意風(fēng)向因地制宜方便工作232021/7/20 星期二關(guān)于“區(qū)域”合并如使用擴增和產(chǎn)物分析同時完成的實時熒光PCR儀進行核酸擴增檢測，擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可以合并。如使用核酸提取、擴增及產(chǎn)物分析等均在一臺儀器上完成的全自動核酸檢測分析儀，標(biāo)本制備區(qū)、擴增區(qū)和產(chǎn)物分析區(qū)可合并。242021/7/20 星期

8、二符合基本要求的核酸擴增檢測實驗室的條件 （1）試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)和擴增及產(chǎn)物分析區(qū)等三個或四個區(qū)域在物理空間上，必須是完全相互獨立的，各區(qū)域無論是在空間還是在使用中，應(yīng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。（2）各區(qū)的可移動的儀器設(shè)備及各種物品包括實驗記錄本、記號筆、試管架及清潔用具等必須專用。（3）應(yīng)在標(biāo)本制備區(qū)、擴增及產(chǎn)物分析區(qū)等相對有可能出現(xiàn)“污染物”的區(qū)域安裝排風(fēng)扇或其它排風(fēng)和有效的裝置，以使空氣按試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本制備區(qū)擴增（及產(chǎn)物分析）區(qū)方向流動。252021/7/20 星期二核酸擴增實驗室的工作流程 試劑準(zhǔn)備區(qū) 標(biāo)本制備區(qū) 擴增區(qū)及擴增產(chǎn)物分析區(qū)262021/7/20

9、星期二試劑貯存準(zhǔn)備區(qū) 核酸擴增實驗室中最為“潔凈”的區(qū)域，不應(yīng)有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標(biāo)準(zhǔn)品和陽性對照。所有實驗用潔凈物品如離心管、吸頭等的存放和準(zhǔn)備處。商品試劑盒自制試劑：一次較大量配制，然后分裝成小瓶保存，每次檢測時，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。儀器設(shè)備主要有加樣器、天平、離心機和冰箱等，最好配備超凈工作臺。272021/7/20 星期二標(biāo)本制備區(qū) 儀器設(shè)備主要有混樣設(shè)備、核酸提取儀、生物安全柜、加樣器、高速臺式（冷凍）離心機、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應(yīng)放在實驗室門口等易受人員走動影響的地方，也不應(yīng)直對分體式空調(diào)。主要是用于血液樣本的混樣、核酸樣本的提

10、取。加樣器吸頭必須帶濾芯。使用加熱模塊時，如在模塊孔中填入二氧化硅細砂，然后將標(biāo)本管置于細砂中溫育，可得到較為一致的溫育溫度。282021/7/20 星期二擴增及產(chǎn)物分析區(qū) 擴增反應(yīng)體系的配制和提取核酸的加入，可在標(biāo)本制備區(qū)也可在本區(qū)內(nèi)進行，關(guān)鍵是要防止產(chǎn)物的污染。如果空間允許的話，也可在一個獨立的區(qū)域內(nèi)進行。加樣時，先加提取的核酸模板樣本，每加完一個即蓋好蓋子，然后加陽性質(zhì)控核酸模板，再就是標(biāo)本制備陰性質(zhì)控和僅含按樣本一樣稀釋的主反應(yīng)混合液的擴增陰性質(zhì)控，這樣做的目的是，最大可能地測出以前擴增產(chǎn)物的交叉污染。292021/7/20 星期二擴增及產(chǎn)物分析區(qū)熱循環(huán)儀的電源應(yīng)專用，并配備一個不間斷

11、電源（UPS）或穩(wěn)壓電源。每次擴增后，可使用可移動紫外燈對擴增熱循環(huán)儀進行照射。擴增儀應(yīng)定期進行校準(zhǔn)。302021/7/20 星期二312021/7/20 星期二工作流程標(biāo)本采集標(biāo)本匯集核酸提取核酸擴增結(jié)果確認(rèn)322021/7/20 星期二332021/7/20 星期二關(guān)注采集、保存、運輸?shù)年P(guān)鍵點留樣方式、采血管采血后什么時間離心采血后保存溫度、時間離心后保存溫度、時間（運輸）檢測前的保存溫度、時間長期保存的樣本342021/7/20 星期二第一步：標(biāo)本的采集-采血管無菌真空采血管一、血清管普通血清管帶分離膠的血清管二、抗凝管EDTA 2K或3K抗凝管EDTA 2K抗凝間分離膠（PPT)枸櫞酸

12、鈉抗凝管352021/7/20 星期二第一步：標(biāo)本的采集-留樣方式 最佳方式：旁袋1管 5ml用于核酸檢測 2管 5ml用于酶免疫測定等 3管用于長期保存留樣 旁路采樣1管 5ml用于核酸檢測 2管 5ml用于酶免疫測定等 3管用于長期保存留樣 小辮留樣(不可取)1管 5ml用于核酸檢測 2管 5ml用于酶免疫測定等362021/7/20 星期二第二步：標(biāo)本的采集-離心離心條件 800-1600g 20min離心時間 4小時以內(nèi) 以免RNA的降解372021/7/20 星期二第三步：標(biāo)本的運送應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本溫度2-8 C符合生物安全標(biāo)準(zhǔn)382021/7/20 星期二第四步：標(biāo)本的

13、接收保存確認(rèn)標(biāo)本數(shù)量 運輸狀態(tài) 標(biāo)本狀態(tài)：溶血、脂血保存： 用于檢測的樣本管：檢測前保存 4小時內(nèi)離心，離心后2天內(nèi)進行檢測的可存放2-8 C。 用于留樣備查的樣本：3個月以內(nèi)存放于-20 C以下，3個月以上置于-70 C以下。392021/7/20 星期二樣本匯集在Star上進行準(zhǔn)備工作：將采血管開蓋后裝載到專用32孔樣品架上。采血管上條形碼一律面向條碼掃描器，以方便掃描條碼。按照要求，將TIP頭、PCR板、24深孔板、洗脫管、磁套、廢棄管放置于平臺相應(yīng)位置。402021/7/20 星期二樣本匯集412021/7/20 星期二樣本匯集422021/7/20 星期二樣本匯集432021/7/2

14、0 星期二核酸提取同樣在Star核酸提取儀上進行，緊跟Pooling之后，利用自動移液配置裂解液、結(jié)合液、洗液、洗脫液等，利用磁性分離功能自動完成核酸樣本的裂解、提取、純化、PCR試劑配制、PCR上樣等實驗操作。442021/7/20 星期二452021/7/20 星期二核酸擴增462021/7/20 星期二結(jié)果確認(rèn)陰性反應(yīng)：進入合格血液的放行程序。陽性反應(yīng)：單檢分項目檢測呈陽性反應(yīng)單檢混合項目檢測呈陽性反應(yīng)混樣分項目檢測呈陽性反應(yīng)混樣混合項目檢測呈陽性反應(yīng)472021/7/20 星期二混樣分項目檢測呈陽性反應(yīng)按照試劑說明書進行雙孔拆分檢測檢出陽性標(biāo)本陽性反應(yīng)標(biāo)本陰性反應(yīng)標(biāo)本進入血液的隔離程序

15、，填寫相關(guān)報表，將標(biāo)本及血液篩查檢測報告送衛(wèi)生部臨床檢驗中心進入合格血液的放行程序全部標(biāo)本為陰性反應(yīng)進入合格血液的放行程序，實驗室需查找原因并完成分析報告482021/7/20 星期二質(zhì)量控制室內(nèi)質(zhì)量控制室間質(zhì)量評價492021/7/20 星期二502021/7/20 星期二遼寧省血液中心 實驗室工作調(diào)整工作模式:早8晚4標(biāo)本接收-采血當(dāng)天 EIA檢測-采集后第2天,當(dāng)天出最終結(jié)論報告.核酸檢測:全血EIA(合格)NAT(第3天)血小板:EIA與NAT平行檢測(第2天)采用依據(jù):快篩、陽性率低確保報告時限 血小板30小時 全血54小時7+1檢測模式512021/7/20 星期二標(biāo)本質(zhì)量的控制采

16、血管選擇采樣方式 旁袋采樣（理想） 血袋導(dǎo)管采樣(被稀釋的可能、規(guī)定順序-風(fēng)險降到最低)標(biāo)本正確標(biāo)識 措施： 動作連續(xù)不能中斷 清場 計算機控制（PDA實物核查、及時傳輸采集信息）離心時間 4小時內(nèi)522021/7/20 星期二計算機控制保證標(biāo)本、血液同源標(biāo)本采集人員采用PDA 對血袋、標(biāo)本管等實物進行核查532021/7/20 星期二離心處理一、標(biāo)本采集后離心542021/7/20 星期二離心處理二、標(biāo)本接收后實驗室再離心552021/7/20 星期二江蘇省血液中心 核酸檢測實驗室的設(shè)置應(yīng)關(guān)注的細節(jié)各實驗區(qū)可以移動的物品最好用不同顏色進行標(biāo)記。以防各區(qū)混用。樣品制備室最好多配備一臺4樣品冰箱

17、，用于混樣后樣品的臨時保存；陰陽性對照試劑盒的保存。樣品制備室最好配備開蓋機，用于真空采血管的去帽。在樣品制備室，實驗耗材、試劑準(zhǔn)備區(qū)域和樣品處理區(qū)域最好分開。562021/7/20 星期二核酸檢測實驗室的設(shè)置應(yīng)關(guān)注的細節(jié)各區(qū)還需配備：無粉手套，專用工作服，一次性鞋套、口罩，一次性吸水紙，紗布塊。55.5g/100ml的次氯酸鈉溶液，的乙醇溶液等。在樣本制備區(qū)，生物安全柜不應(yīng)放在實驗室門口等易受人員走動影響的地方，也不應(yīng)直對分體式空調(diào)?；鞓觾x的加樣吸頭必須帶濾芯。樣品制備區(qū)和核酸檢測區(qū)的儀器還應(yīng)配備電源。572021/7/20 星期二核酸檢測實驗室的設(shè)置江蘇省血液中心核酸檢測實驗室簡介實驗分區(qū)

18、：分4個室(區(qū))：試劑準(zhǔn)備室(區(qū))，為藍色標(biāo)記；標(biāo)本制備室(區(qū))，為綠色標(biāo)記；核酸擴增檢測室(區(qū))，為黃色標(biāo)記；全自動核酸檢測室(區(qū))，為灰色標(biāo)記。采用的檢測系統(tǒng)：科華和羅氏兩套檢測系統(tǒng),兩者共用試劑準(zhǔn)備室(區(qū))和標(biāo)本制備室(區(qū))，核酸擴增檢測分別在各自的擴增檢測區(qū)。582021/7/20 星期二核酸檢測樣品的質(zhì)量保證應(yīng)注意的細節(jié)首先要制定樣品采集手冊，并對采血人員進行全員培訓(xùn)。采血管的選擇：最好選擇EDTA 2K或3K抗凝帶分離膠的抗凝管。注意樣品采集后的充分混勻，一般顛倒次以上。樣品離心：應(yīng)采用大容量低溫離心機，離心要充分，離心條件最好g、分鐘。樣品的開蓋：應(yīng)在離心后，放冰箱靜置min后，再開蓋。應(yīng)在生物安全柜中進行?；鞓又敛鸱謾z測其間,將樣品放冰箱臨時保存。592021/7/20 星期二核酸檢測樣