1、1第十五章第十五章細(xì)細(xì) 胞胞 破破 碎碎2生物分離過(guò)程的一般流程生物分離過(guò)程的一般流程本章內(nèi)容3常見(jiàn)的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)胞破碎技術(shù)包涵體的純化方法本章的主要內(nèi)容4概述概述不同類(lèi)型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類(lèi)型：不同類(lèi)型的細(xì)胞分泌目標(biāo)產(chǎn)物的類(lèi)型：l動(dòng)物細(xì)胞多分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液動(dòng)物細(xì)胞多分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液l植物細(xì)胞多為胞內(nèi)產(chǎn)物植物細(xì)胞多為胞內(nèi)產(chǎn)物l微生物（細(xì)菌微生物（細(xì)菌/酵母酵母/真菌）胞內(nèi)、胞外真菌）胞內(nèi)、胞外 對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物需要收集菌體或細(xì)胞進(jìn)行對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物需要收集菌體或細(xì)胞進(jìn)行破碎。破碎。5概述概述(大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于

2、發(fā)酵液中。及氨基酸等目標(biāo)產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。(有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。有些目標(biāo)產(chǎn)物存在于生物體中。l尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì)是在細(xì)胞內(nèi)沉積。在細(xì)胞內(nèi)沉積。l脂類(lèi)物質(zhì)和一些抗生素包含在生物體中。脂類(lèi)物質(zhì)和一些抗生素包含在生物體中。6概概 述述細(xì)胞破碎（細(xì)胞破碎（cell rupturecell rupture）技術(shù)是指利用外力破）技術(shù)是指利用外力破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)包括目的產(chǎn)物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。物成分釋放出來(lái)的技術(shù)。細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌細(xì)胞破碎技術(shù)是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的

3、非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。為了研究細(xì)胞破碎，提高其破碎率，有必要了為了研究細(xì)胞破碎，提高其破碎率，有必要了解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。解各種微生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。715.1 15.1 細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對(duì)破碎的影響細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)對(duì)破碎的影響Z微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞外層均為細(xì)胞壁，細(xì)胞壁里面是細(xì)胞膜，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有壁里面是細(xì)胞膜，動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞壁，僅有細(xì)胞膜。細(xì)胞膜。Z通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓通常細(xì)胞壁較堅(jiān)韌，細(xì)胞膜脆弱，易受滲透壓沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主要來(lái)自于沖擊而破碎，因此細(xì)胞破碎的阻力主

4、要來(lái)自于細(xì)胞壁。細(xì)胞壁。Z不同細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞不同細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不完全相同，故細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就壁的機(jī)械強(qiáng)度不同，細(xì)胞破碎的難易程度也就不同。不同。8細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)Z 幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是幾乎所有細(xì)菌的細(xì)胞壁都是由肽聚糖組成，它是難溶性由肽聚糖組成，它是難溶性的聚糖鏈；的聚糖鏈；Z 相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相鄰聚糖鏈上的短肽又交叉相聯(lián)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的三維相聯(lián)，構(gòu)成了細(xì)胞壁的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，包圍在細(xì)胞周?chē)?；包圍在?xì)胞周?chē)?；Z 使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)使細(xì)胞具有一定的形狀和強(qiáng)度。度。9細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)u破碎細(xì)菌

5、的主要阻力是來(lái)自于破碎細(xì)菌的主要阻力是來(lái)自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存其網(wǎng)結(jié)構(gòu)的致密程度和強(qiáng)度取決于聚糖鏈上所存在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。在的肽鍵的數(shù)量和其交聯(lián)的程度。u革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌有很大革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與革蘭氏陽(yáng)性菌有很大不同。不同。 u革蘭氏陰性革蘭氏陰性菌典型的生物是大腸桿菌，通過(guò)這種菌典型的生物是大腸桿菌，通過(guò)這種細(xì)胞生產(chǎn)了很多細(xì)胞重組的產(chǎn)物。細(xì)胞生產(chǎn)了很多細(xì)胞重組的產(chǎn)物。藥物名稱(chēng)藥物名稱(chēng)宿主宿主用途用途胰島素胰島素大腸桿菌大腸桿菌治療糖尿病治療糖尿病人生長(zhǎng)激素人生長(zhǎng)激素大腸桿菌大腸桿菌治療侏儒病

6、治療侏儒病-干擾素干擾素大腸桿菌大腸桿菌治療毛狀細(xì)胞白血病等治療毛狀細(xì)胞白血病等10 酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖酵母細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖u最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維最里層是由葡聚糖的細(xì)纖維組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛組成，它構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，使細(xì)胞具有一定的性骨架，使細(xì)胞具有一定的形狀，形狀，u上面的是一層糖蛋白，上面的是一層糖蛋白，u最外層是甘露聚糖，由最外層是甘露聚糖，由1,61,6- -磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在磷酸二酯鍵連接成網(wǎng)狀。在該層的內(nèi)部，有甘露聚糖該層的內(nèi)部，有甘露聚糖- -酶的復(fù)合物。酶的復(fù)合物。u破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要破碎酵母細(xì)胞壁的阻力主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程決定于壁結(jié)構(gòu)交

7、聯(lián)的緊密程度和它的厚度。度和它的厚度。11真菌的細(xì)胞壁真菌的細(xì)胞壁l真菌的細(xì)胞壁較厚，主要由多糖組成，其次真菌的細(xì)胞壁較厚，主要由多糖組成，其次還含有較少量的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)。還含有較少量的蛋白質(zhì)和脂類(lèi)。l不同的真菌，細(xì)胞壁的組成有很大的不同，不同的真菌，細(xì)胞壁的組成有很大的不同，其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚其中大多數(shù)真菌的多糖壁是由幾丁質(zhì)和葡聚糖構(gòu)成，少數(shù)含纖維素。糖構(gòu)成，少數(shù)含纖維素。l與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的與酵母和細(xì)菌的細(xì)胞壁一樣，真菌細(xì)胞壁的強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，強(qiáng)度和聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有關(guān)，不僅如此，它還含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所它還含有幾

8、丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，所以強(qiáng)度有所提高。以強(qiáng)度有所提高。12l紅面包霉菌細(xì)胞壁具有同心圓層紅面包霉菌細(xì)胞壁具有同心圓層狀結(jié)構(gòu)主要存在三種聚合物狀結(jié)構(gòu)主要存在三種聚合物l最外層最外層(a)(a)是是-和和-葡聚糖的葡聚糖的混合物，混合物，l第第2 2層層(b)(b)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)是糖蛋白的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)l第第3 3層層(c)(c)主要是蛋白質(zhì)，主要是蛋白質(zhì)，l最內(nèi)層最內(nèi)層(d)(d)主要是幾丁質(zhì)。主要是幾丁質(zhì)。紅面包霉菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖紅面包霉菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)示意圖13微生微生物物革蘭氏革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏革蘭氏陰性細(xì)菌陰性細(xì)菌酵母菌酵母菌霉菌霉菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 n

9、m10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要主要組成組成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(30-40%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6-8%)(6-8%)脂類(lèi)脂類(lèi)(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90

10、%)脂類(lèi)脂類(lèi)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生微生物物革蘭氏革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌陽(yáng)性細(xì)菌革蘭氏革蘭氏陰性細(xì)菌陰性細(xì)菌酵母菌酵母菌真菌真菌壁厚壁厚20-80 nm20-80 nm10-13 nm10-13 nm100-300nm100-300nm100-250nm100-250nm層次層次單層單層多層多層多層多層多層多層主要主要組成組成肽聚糖肽聚糖(40-90%)(40-90%)多糖多糖胞壁酸胞壁酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)脂多糖脂多糖(1-4%)(1-4%)肽聚糖肽聚糖 (5-10%)(5-10%)脂蛋白脂蛋白脂多糖脂多糖(11-22%)(11-22%)磷脂磷脂蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)葡聚糖葡聚糖(30-4

11、0%)(30-40%)甘露聚糖甘露聚糖(30%)(30%)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)(6-8%)(6-8%)脂類(lèi)脂類(lèi)(8.5-(8.5-13.5%)13.5%)多聚糖多聚糖(80-90%)(80-90%)脂類(lèi)脂類(lèi)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)14植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)l對(duì)于已生長(zhǎng)結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為對(duì)于已生長(zhǎng)結(jié)束的植物細(xì)胞壁可分為初生壁和次生初生壁和次生壁兩部分。壁兩部分。l初生壁是細(xì)胞生長(zhǎng)期形成的。初生壁一般較?。ǔ跎谑羌?xì)胞生長(zhǎng)期形成的。初生壁一般較?。? 13m3m），富有彈性。），富有彈性。l由多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，多糖主要成分為纖維素、半由多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，多糖主要成分為

12、纖維素、半纖維素和果膠類(lèi)物質(zhì)。纖維素是長(zhǎng)鏈纖維素和果膠類(lèi)物質(zhì)。纖維素是長(zhǎng)鏈D-D-葡聚糖，許葡聚糖，許多這樣的長(zhǎng)鏈形成微纖絲。多這樣的長(zhǎng)鏈形成微纖絲。l它是構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架，細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度主要來(lái)它是構(gòu)成細(xì)胞壁的骨架，細(xì)胞壁的機(jī)械強(qiáng)度主要來(lái)自于微纖絲。自于微纖絲。15植物次生細(xì)胞壁植物次生細(xì)胞壁 某些植物細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)停止后，在細(xì)胞質(zhì)和初生某些植物細(xì)胞，當(dāng)生長(zhǎng)停止后，在細(xì)胞質(zhì)和初生細(xì)胞壁之間形成了次生細(xì)胞壁。次生壁一般較厚細(xì)胞壁之間形成了次生細(xì)胞壁。次生壁一般較厚(4m(4m以上以上) )，常有三層組成。，常有三層組成。n在次生壁中，纖維素和半纖維素含量比初生壁增在次生壁中，纖維素和半纖維素含量

13、比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，而且存在木質(zhì)素的沉積。而且存在木質(zhì)素的沉積。 因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，因此次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。16研研 磨磨15.2 15.2 細(xì)胞破碎技術(shù)細(xì)胞破碎技術(shù)17機(jī)械破碎機(jī)械破碎搗碎法研磨法勻漿法超聲法 物理破碎物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法化學(xué)破碎化學(xué)破碎有機(jī)溶劑：表面活性劑：酸堿酶促破碎酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切通過(guò)機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力，使組織、細(xì)胞破碎。力，使組織、細(xì)胞破碎。通過(guò)各種物理

14、因素的作用，通過(guò)各種物理因素的作用，使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破使組織、細(xì)胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細(xì)胞破碎。壞，而使細(xì)胞破碎。通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞通過(guò)各種化學(xué)試劑對(duì)細(xì)胞膜的作用，而使細(xì)胞破碎膜的作用，而使細(xì)胞破碎通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外通過(guò)細(xì)胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使加酶制劑的催化作用，使細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，細(xì)胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達(dá)到細(xì)胞破碎而達(dá)到細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎方法及其原理細(xì)胞破碎方法及其原理18一機(jī)械法機(jī)械破碎法又可分為機(jī)械破碎法又可分為高壓勻漿破碎法（高壓勻漿破碎法（homogenizationhomogenization）高速珠研磨破碎法（高速珠研磨破碎法（bead grin

15、dingbead grinding）超聲波破碎法（超聲波破碎法（ultrasonicationultrasonication）19采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）。采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成）。1.高壓勻漿法高壓勻漿法（High-pressure homogenization）細(xì)胞懸浮液自高壓室針細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速?lài)姵龈哌_(dá)幾百米，高速?lài)姵龅臐{液又射到靜止的撞的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程這一系列高速運(yùn)動(dòng)過(guò)程中經(jīng)歷了高速剪切、碰中經(jīng)歷

16、了高速剪切、碰撞及壓力驟降，造成細(xì)撞及壓力驟降，造成細(xì)胞破碎。胞破碎。2021高壓勻漿器的種類(lèi)高壓勻漿器的種類(lèi)高壓勻漿器的種類(lèi)較多高壓勻漿器的種類(lèi)較多：pWABWAB公司的公司的AVP Gaulin 31MRAVP Gaulin 31MR型型pBran and luebbe Bran and luebbe 公司公司SHL40SHL40型型p意大利意大利Niro SoaviNiro Soavi高壓勻漿機(jī)高壓勻漿機(jī)22高壓勻漿法使用時(shí)注意事項(xiàng)高壓勻漿法使用時(shí)注意事項(xiàng)u高壓勻漿器的操作溫度上升約高壓勻漿器的操作溫度上升約- -/10MPa/10MPa為了控制溫度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)為了控制溫

17、度的升高，可在進(jìn)口處用干冰調(diào)節(jié)溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在溫度，使出口溫度調(diào)節(jié)在2020左右。左右。u可以采用單次通過(guò)勻漿器或多次循環(huán)通過(guò)等方可以采用單次通過(guò)勻漿器或多次循環(huán)通過(guò)等方式。式。u在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎在工業(yè)規(guī)模的細(xì)胞破碎中，對(duì)于酵母等難破碎的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞，常采用的及濃度高或處于生長(zhǎng)靜止期的細(xì)胞，常采用多次循環(huán)的操作方法。多次循環(huán)的操作方法。23高壓勻漿法適用的范圍高壓勻漿法適用的范圍大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法高壓勻漿法適用的范圍：高壓勻漿法適用的范圍：酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；酵母和大多數(shù)細(xì)菌細(xì)胞的破碎；料液細(xì)胞濃度可以很高，

18、料液細(xì)胞濃度可以很高，20%20%左右。左右。不宜使用高壓勻漿法。不宜使用高壓勻漿法。易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，較小的革蘭氏陽(yáng)性菌，含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻含有包含體的基因工程菌（因包含體堅(jiān)硬，易損傷勻漿閥）漿閥）24影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素被破碎的細(xì)胞分率符合如下公式：被破碎的細(xì)胞分率符合如下公式： ln1/(1-R)=KNPln1/(1-R)=KNP (15-1) (15-1) 式中式中 R R 破碎率，為破碎率，為NN次循環(huán)后，蛋白次循環(huán)后，蛋白質(zhì)的釋放量質(zhì)的釋放量RnRn與最大釋放量與最

19、大釋放量RmRm之比；之比； K K 與溫度有關(guān)的速度常數(shù)；與溫度有關(guān)的速度常數(shù)； P P 操作壓力，操作壓力，MPaMPa； 與微生物種類(lèi)有關(guān)的常數(shù)。與微生物種類(lèi)有關(guān)的常數(shù)。25l升高壓力有利于破碎，升高壓力有利于破碎，減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過(guò)勻漿閥就可達(dá)到幾減少細(xì)胞的循環(huán)次數(shù)，甚至一次通過(guò)勻漿閥就可達(dá)到幾乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過(guò)小。乎完全的破碎，這樣就可避免細(xì)胞碎片不至過(guò)小。但但p p大到一定值時(shí)對(duì)勻漿器的磨損增加，也有實(shí)驗(yàn)表明大到一定值時(shí)對(duì)勻漿器的磨損增加，也有實(shí)驗(yàn)表明p p超生一定值時(shí)，超生一定值時(shí)，R R增加但很慢。增加但很慢。在工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為在

20、工業(yè)生產(chǎn)中，通常采用的壓力為555570Mpa70Mpa。l破碎性能還隨菌體種類(lèi)和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而不同破碎性能還隨菌體種類(lèi)和生長(zhǎng)環(huán)境的不同而不同大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎，大腸桿菌的細(xì)胞比酵母細(xì)胞容易破碎，生長(zhǎng)在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長(zhǎng)在復(fù)雜培養(yǎng)基生長(zhǎng)在簡(jiǎn)單的合成培養(yǎng)基上的大腸桿菌比生長(zhǎng)在復(fù)雜培養(yǎng)基上容易破碎。上容易破碎。影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素影響高壓勻漿器細(xì)胞破碎因素26高壓勻漿法高壓勻漿法-X-X-擠壓器擠壓器l改進(jìn)的高壓方法：將濃縮的菌體懸液冷卻至改進(jìn)的高壓方法：將濃縮的菌體懸液冷卻至- -2525至至-30-30形成冰晶體，利用形成冰晶體，利用500MPa500MP

21、a以上的以上的高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。高壓沖擊，冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。l細(xì)胞破碎是由于冰晶體在受壓時(shí)的相變，包埋細(xì)胞破碎是由于冰晶體在受壓時(shí)的相變，包埋在冰中的細(xì)胞變形所引起的。在冰中的細(xì)胞變形所引起的。l主要用于實(shí)驗(yàn)室中。主要用于實(shí)驗(yàn)室中。l優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片的優(yōu)點(diǎn)是適用的范圍廣，破碎率高，細(xì)胞碎片的粉碎程度低以及活性的保留率高粉碎程度低以及活性的保留率高l對(duì)冷凍一融解敏感的生化物質(zhì)不適用。對(duì)冷凍一融解敏感的生化物質(zhì)不適用。272）珠磨法 bead millu珠磨是常用的方法u細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨珠、

22、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于劑（直徑小于1mm1mm）一起快速）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。含物。u在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采在工業(yè)規(guī)模的破碎中，常采用高速珠磨機(jī)用高速珠磨機(jī)WSK臥式高效全能珠磨機(jī)28高速珠磨機(jī)工作原理l磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤(pán)攪拌器磨室內(nèi)放置玻璃小珠，裝在同心軸上的園盤(pán)攪拌器高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動(dòng)；高速旋轉(zhuǎn)，使細(xì)胞懸浮液和玻離小珠相互攪動(dòng)；l細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰撞和磨料滾動(dòng)引起細(xì)胞破碎是由剪切力層之間的碰

23、撞和磨料滾動(dòng)引起l在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤(pán)和出口平在出口處，旋轉(zhuǎn)園盤(pán)和出口平板之間的狹縫很小，可阻擋玻板之間的狹縫很小，可阻擋玻離小珠，使不被料液帶出。離小珠，使不被料液帶出。l由于操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量，由于操作過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生熱量，故磨室還裝有冷卻夾套，以冷故磨室還裝有冷卻夾套，以冷卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。卻細(xì)胞懸浮液和玻離小珠。29Netzsch LM-20型珠磨機(jī)A-具有冷卻夾套的圓筒形磨室B-具有冷卻裝置的攪拌軸和圓盤(pán)C-環(huán)形震動(dòng)俠縫分離器D-變速馬達(dá)1和2料液進(jìn)出口3和4 攪拌冷卻劑進(jìn)出口5和6磨室冷卻劑進(jìn)出口l園盤(pán)以?xún)煞N位置交錯(cuò)地安裝在軸上，l一種處于徑向，一種與軸傾斜，l徑向盤(pán)使磨料沿徑向

24、運(yùn)動(dòng)，傾斜盤(pán)則產(chǎn)生軸向運(yùn)動(dòng)。l由于交錯(cuò)的運(yùn)動(dòng)，提高了破碎效率。30珠磨機(jī)破碎作用方程u破碎作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，破碎作用是相對(duì)于時(shí)間的一級(jí)反應(yīng)速度過(guò)程，符合下列公式：符合下列公式： ln1/(1-R)=Kt 15-2ln1/(1-R)=Kt 15-2 uR R 破碎率；破碎率；K K一一 一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)；一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)；t t一一 時(shí)間。時(shí)間。uK K與攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠與攪拌轉(zhuǎn)速、細(xì)胞懸浮液濃度和循環(huán)速度、玻璃小珠裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。裝量和珠體直徑，以及溫度等相關(guān)。珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%80%以下：降低能

25、耗、減少大分以下：降低能耗、減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率產(chǎn)生的細(xì)胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來(lái)的困難。易分離而給后續(xù)操作帶來(lái)的困難。313）超聲波破碎l超聲波破碎法（超聲波破碎法（Ultrasonication)Ultrasonication)利用超聲波利用超聲波振蕩器發(fā)射的振蕩器發(fā)射的15-25kHz15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。懸浮液。l超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好

26、。l超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類(lèi)、濃度和超超聲波的細(xì)胞破碎效率與細(xì)胞種類(lèi)、濃度和超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。聲波的聲頻、聲能有關(guān)。32超聲波破碎的機(jī)理JY92-II D超聲波超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)細(xì)胞粉碎機(jī)(一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用一般認(rèn)為在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用（cavitation),cavitation),(液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大液體中局部空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞的沖擊波和剪切力，引起的粘滯性旋渦在細(xì)胞上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從上造成了剪切力，使細(xì)胞內(nèi)液體發(fā)生流動(dòng)，從而使細(xì)胞破碎。而使細(xì)胞破碎。(操

27、作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或操作過(guò)程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部冷卻的容器中進(jìn)行。外部冷卻的容器中進(jìn)行。33超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)超聲波破碎是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，一般桿菌比球菌易破碎，G-G-細(xì)菌比細(xì)菌比G+G+細(xì)菌易破細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。碎，對(duì)酵母菌的效果較差。但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)失活?；钚晕镔|(zhì)失活。超聲波破碎的有效能量利用率極低超聲波破碎的有效能量利用率極低由于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，由

28、于對(duì)冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但但。34技術(shù)技術(shù)原理原理效果效果 成本成本舉例舉例勻漿法勻漿法(孔型孔型)須使細(xì)胞通過(guò)的小須使細(xì)胞通過(guò)的小孔，使細(xì)胞受到剪孔，使細(xì)胞受到剪切力而破碎切力而破碎劇烈劇烈 適中適中細(xì)胞懸浮液大規(guī)模細(xì)胞懸浮液大規(guī)模處理處理珠磨破碎珠磨破碎法法細(xì)胞被玻璃珠或鐵細(xì)胞被玻璃珠或鐵珠搗碎珠搗碎劇烈劇烈 便宜便宜細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理細(xì)胞的大規(guī)模處理超聲波法超聲波法用超聲波的空穴作用超聲波的空穴作用使細(xì)胞破碎用使細(xì)胞破碎適中適中 昂貴昂貴細(xì)胞懸浮液小規(guī)模細(xì)胞懸浮液小規(guī)模處理處理研磨法研磨法細(xì)胞被研磨物磨碎細(xì)胞被研磨物磨碎適中適中 便宜便宜勻漿法

29、勻漿法(片型片型)細(xì)胞被攪拌器劈碎細(xì)胞被攪拌器劈碎適中適中 適中適中動(dòng)物組織及動(dòng)物細(xì)動(dòng)物組織及動(dòng)物細(xì)胞胞不同機(jī)械破碎方法的比較35非機(jī)械破碎方法非機(jī)械破碎方法酶溶破碎法（酶溶破碎法（enzyme lysisenzyme lysis）化學(xué)破碎法（化學(xué)破碎法（chemical treatmentchemical treatment）去垢劑破碎法（去垢劑破碎法（detergentsdetergents）滲透壓沖擊破碎法（滲透壓沖擊破碎法（osmotic shockosmotic shock）凍融破碎法（凍融破碎法（freezing and thawingfreezing and thawing）36

30、二二 非機(jī)械法非機(jī)械法非機(jī)械方法很多1 酶解2 化學(xué)法溶胞3 物理法n滲透壓沖擊n凍結(jié)和融化n干燥法其中酶法和化學(xué)法溶胞應(yīng)用最廣。二37 1 酶解（酶溶法 Enymatic lysis)酶解是利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜。1）外加酶法常用的溶酶常用的溶酶溶菌酶、溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、蛋白酶、甘露糖酶、甘露糖酶、糖苷酶、糖苷酶、肽鍵內(nèi)切酶、肽鍵內(nèi)切酶、殼多糖酶等殼多糖酶等38外加酶法n酶解法的特點(diǎn)是專(zhuān)一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時(shí)，必酶解法的特點(diǎn)是專(zhuān)一性強(qiáng)，因此在選擇酶系統(tǒng)時(shí)，必須根據(jù)細(xì)胞的

31、結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來(lái)選擇。須根據(jù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成來(lái)選擇。l溶菌酶（溶菌酶（lysozyme)lysozyme)能專(zhuān)一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分能專(zhuān)一性地分解細(xì)胞壁上肽聚糖分子的子的-1,4-1,4糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類(lèi)細(xì)胞壁的裂糖苷鍵，因此主要用于細(xì)菌類(lèi)細(xì)胞壁的裂解。革蘭氏陽(yáng)性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生解。革蘭氏陽(yáng)性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶壁現(xiàn)象。但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無(wú)溶壁現(xiàn)象。但對(duì)于革蘭氏陰性菌，單獨(dú)采用溶菌酶無(wú)效果，必須與螯合劑效果，必須與螯合劑EDTAEDTA一起使用。一起使用。l放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類(lèi)似于革蘭氏陽(yáng)性菌，以肽聚糖放線菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)類(lèi)似于革蘭氏

32、陽(yáng)性菌，以肽聚糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶，為主要成分，所以也能采用溶菌酶，l酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、酵母和真菌由于細(xì)胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。幾丁質(zhì)等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等。l植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維素酶裂解。半纖維素酶裂解。39外加酶法有時(shí)采用幾種酶的混合物會(huì)產(chǎn)生更好的效果，加有時(shí)采用幾種酶的混合物會(huì)產(chǎn)生更好的效果，加入時(shí)需確定相應(yīng)的次序。入時(shí)需確定相應(yīng)的次序。 對(duì)酵母細(xì)胞采用酶法破碎時(shí)，先加入蛋白酶作對(duì)酵母細(xì)胞采用酶法破碎時(shí)，先加

33、入蛋白酶作用蛋白質(zhì)用蛋白質(zhì)- -甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下原生質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破質(zhì)體，這時(shí)若緩沖液的滲透壓變化，則細(xì)胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。40酶解法的特點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：u發(fā)生酶解的條件溫和u能選擇性地釋放產(chǎn)物u胞內(nèi)核酸等泄出量少，細(xì)胞外形較完整缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶溶酶法通用性差（不同菌種需選擇不同的酶) )產(chǎn)物抑制的存在。產(chǎn)物抑制的存在。 41酶解-自溶作用 l 自溶作用是酶解的另一種方

34、法，自溶作用是酶解的另一種方法，利用生物體自利用生物體自身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶身產(chǎn)生的酶來(lái)溶胞，而不需外加其他的酶。l在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能在微生物代謝過(guò)程中，大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)水解細(xì)胞壁上聚合物的酶，以便生長(zhǎng)過(guò)程繼續(xù)下去。下去。l自溶作用：改變其生長(zhǎng)環(huán)境（溫度、緩自溶作用：改變其生長(zhǎng)環(huán)境（溫度、緩沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)沖液），可以誘發(fā)產(chǎn)生過(guò)剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。生其它的自溶酶，以達(dá)到自溶目的。l缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)缺點(diǎn)是：易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)

35、胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。胞懸浮液粘度增大，過(guò)濾速度下降。42某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來(lái)。2 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法（Chemical permeation）該法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。該法取決于化學(xué)試劑的類(lèi)型以及細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成。 43n酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采用6mol/L HCl。n堿能溶解細(xì)胞壁上脂

36、類(lèi)物質(zhì)或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來(lái)。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。（1）酸、堿處理法）酸、堿處理法44細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：細(xì)胞破碎常用的表面活性劑：十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDSSDS，陰離子型）；。，陰離子型）；。非離子型如非離子型如Triton X-100Triton X-100和吐溫（和吐溫（TweenTween）等）等對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞對(duì)疏水性物質(zhì)具有很強(qiáng)的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來(lái)。（2 2）表面活性劑）表面活性劑無(wú)論

37、表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，無(wú)論表面活性劑是陰離子、陽(yáng)離子還是非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通能與細(xì)胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶解透性增加或溶解45能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物能分解細(xì)胞壁中的磷脂，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來(lái)。質(zhì)被釋放出來(lái)。有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等有機(jī)溶劑可采用丁酯、丁醇、丙酮、氯仿和甲苯等 （3 3）有機(jī)溶劑）有機(jī)溶劑（4 4）EDTAEDTA螯合劑螯合劑處理處理G-G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞壁外層有破壞作用。細(xì)

38、菌，對(duì)細(xì)胞壁外層有破壞作用。G-G-細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通常靠二價(jià)陽(yáng)離子細(xì)菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r(jià)陽(yáng)離子CaCa2+2+或或MgMg2+2+結(jié)合脂多糖結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦和蛋白質(zhì)來(lái)維持，一旦EDTAEDTA將將CaCa2+2+或或MgMg2+2+螯合，大量的脂多糖螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。46u通用性差；通用性差；u時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)時(shí)間長(zhǎng)，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放率不超過(guò)50%50%；u有些化學(xué)試劑有毒。有些化學(xué)試劑有毒。u化學(xué)試劑的加入常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化帶來(lái)困難，化學(xué)試劑的加入常會(huì)給隨后產(chǎn)物的純化

39、帶來(lái)困難， 并影響最終產(chǎn)物純度并影響最終產(chǎn)物純度化學(xué)滲透法特點(diǎn)：化學(xué)滲透法特點(diǎn)：缺點(diǎn)缺點(diǎn)l對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過(guò)，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；l細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。分離和進(jìn)一步提取。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)473 3 物理法物理法u滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法u凍結(jié)凍結(jié)-融化法融化法u干燥法干燥法481）滲透壓沖擊法 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法，n將細(xì)胞

40、放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或?qū)⒓?xì)胞放在高滲透壓的溶液中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外蔗糖溶液），由于滲透壓的作用，細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋?zhuān)驅(qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然釋?zhuān)驅(qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓的突然變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而變化，胞外的水迅速滲入胞內(nèi)，引起細(xì)胞快速膨脹而破裂。破裂。 僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等

41、），使或在培養(yǎng)過(guò)程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。49 2）凍結(jié)-融化法 將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約將細(xì)胞放在低溫下冷凍（約-15-15），然后在室溫中），然后在室溫中融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。 一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞一方面能使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，從而增加細(xì)胞的親水性能，的親水性能， 另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，形成冰晶粒，引起細(xì)胞膨脹而破裂。破裂。 適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次，此

42、外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。次，此外，在凍融過(guò)程中可能引起某些蛋白質(zhì)變性。 50使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。當(dāng)采用丙酮、丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽丁醇或緩沖液等對(duì)干燥細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就容易被抽提出來(lái)。提出來(lái)。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-3025-30的氣流中吹干；的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。真空干燥多用于細(xì)菌。冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)冷凍干燥適用于不穩(wěn)定的生化物質(zhì)3 3）干燥法）干燥法氣流干燥氣流干燥真空干燥真空干燥噴霧干燥噴

43、霧干燥冷凍干燥冷凍干燥5152選擇破碎方法的依據(jù)：選擇破碎方法的依據(jù)：u細(xì)胞處理量；細(xì)胞處理量； u細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)( (高聚物交聯(lián)程度、種高聚物交聯(lián)程度、種類(lèi)和壁厚度類(lèi)和壁厚度) )；u目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性；目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性； u破碎程度；破碎程度；u目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性釋放53選擇性釋放目標(biāo)產(chǎn)物的一般原則僅破壞或破碎存在目標(biāo)產(chǎn)物的位置周?chē)鷏當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用較混和的當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞膜附近時(shí)，可采用較混和的方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)融化法等。方法，如酶溶法、滲透壓沖擊法和凍結(jié)融化法等。當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則

44、需采用強(qiáng)烈的機(jī)當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)時(shí)，則需采用強(qiáng)烈的機(jī)械破碎法械破碎法l當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時(shí)，當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物處于與細(xì)胞膜或細(xì)胞壁結(jié)合的狀態(tài)時(shí)，調(diào)節(jié)溶液調(diào)節(jié)溶液PHPH值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親值，離子強(qiáng)度或添加與目標(biāo)產(chǎn)物具有親和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)和性的試劑如：螯合劑、表面活性劑等，使目標(biāo)產(chǎn)物容易溶解釋放。物容易溶解釋放。(2)機(jī)械破碎法和化學(xué)法并用可使操作條件更加溫和，在相同的目標(biāo)產(chǎn)物釋放率條件下，降低細(xì)胞的破碎程度。54 討論題：青霉素酰化酶細(xì)胞破碎的研究討論題：青霉素?；讣?xì)胞破碎的研究 一一. 化學(xué)法化學(xué)法 20%(W/V)大腸桿菌懸

45、浮液大腸桿菌懸浮液 + B.A 37攪拌攪拌 高高速離心速離心 測(cè)上清液酶活。測(cè)上清液酶活。1.處理時(shí)間處理時(shí)間 R% 2.5h2. 丁酯用量丁酯用量條件：條件：37 ，攪拌，攪拌3小時(shí)小時(shí)適宜的適宜的B.A加量為加量為12% ，釋放率釋放率R=55%12%55%R12%2.03U/mg比活55二二. 化學(xué)法化學(xué)法凍融法結(jié)合凍融法結(jié)合 加加B.A(12%,37B.A(12%,37攪拌攪拌3h3h） 菌懸液菌懸液 凍融凍融( (凍結(jié)凍結(jié)14h 14h 融化融化) ) 釋放率釋放率70%70%；比活；比活2.69 u/mg2.69 u/mg 三三. 化學(xué)化學(xué)超聲波振蕩法結(jié)合超聲波振蕩法結(jié)合 先丁酯

46、處理，再超聲波（先丁酯處理，再超聲波（9090秒），秒），釋放率釋放率72%72% 小型設(shè)備，不能工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。小型設(shè)備，不能工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。四四. 高壓勻漿法高壓勻漿法 20%(W/V)20%(W/V)菌懸液，菌懸液，P=50MPaP=50MPa，N=3N=3。釋放率釋放率R=38.4%R=38.4%， 原因原因: :細(xì)胞破碎后細(xì)胞破碎后, ,仍有較多酶吸附在細(xì)胞碎片上。仍有較多酶吸附在細(xì)胞碎片上。五五. 高壓勻漿高壓勻漿化學(xué)法結(jié)合化學(xué)法結(jié)合 先高壓勻漿，再加先高壓勻漿，再加10%10%丁酯，丁酯，3737攪拌攪拌3h3h，高速離心，高速離心(3(3萬(wàn)萬(wàn)rpm)rpm)，釋放率釋放率：R=

47、60%R=60%六六. 珠磨珠磨 直徑直徑0.4mm0.4mm玻璃珠。玻璃珠。釋放率釋放率：R=95%R=95%56破碎率的測(cè)定破碎率的測(cè)定細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，細(xì)胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到水相，使導(dǎo)電率上升。使導(dǎo)電率上升。 直接測(cè)定法直接測(cè)定法 目的產(chǎn)物測(cè)定法目的產(chǎn)物測(cè)定法 導(dǎo)電率測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。采用染色法把破碎的細(xì)胞與未破碎的細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；如破碎的革蘭氏陽(yáng)性菌可染成革蘭氏陰性菌的顏色；采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整的細(xì)胞呈紫采用革蘭氏染色法染色酵母破碎液，完整

48、的細(xì)胞呈紫色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。色，而受損害的細(xì)胞呈亮紅色。將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物含量將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心，測(cè)定上清液中目的產(chǎn)物含量或活性，并與或活性，并與100%100%破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。破碎率的標(biāo)準(zhǔn)值比較，計(jì)算其破碎率。57破碎技術(shù)的研究方向破碎技術(shù)的研究方向 多種破碎方法相結(jié)合多種破碎方法相結(jié)合化學(xué)法、酶法、機(jī)械法相結(jié)合。化學(xué)法、酶法、機(jī)械法相結(jié)合。酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、鰲合劑、滲透壓法結(jié)合酶法與高壓勻漿、超聲波震蕩、鰲合劑、滲透壓法結(jié)合如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，如用溶解酶預(yù)處理面包酵母，然后高壓勻漿，95MPa95M

49、Pa壓壓力下勻漿力下勻漿4 4次，總破碎率接近次，總破碎率接近100%100%。而單獨(dú)采用高壓勻。而單獨(dú)采用高壓勻漿法，同樣條件下破碎率只有漿法，同樣條件下破碎率只有32%32%。有機(jī)溶劑與凍融法、干燥法結(jié)合有機(jī)溶劑與凍融法、干燥法結(jié)合58破碎技術(shù)的研究方向破碎技術(shù)的研究方向- -與上游過(guò)程相結(jié)合與上游過(guò)程相結(jié)合v在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基、生長(zhǎng)期、操作參數(shù)（如在發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基、生長(zhǎng)期、操作參數(shù)（如pHpH、溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、稀釋率等）等因素都對(duì)細(xì)胞壁溫度、通氣量、攪拌轉(zhuǎn)速、稀釋率等）等因素都對(duì)細(xì)胞壁膜的結(jié)構(gòu)與組成有一定的影響。膜的結(jié)構(gòu)與組成有一定的影響。v在生長(zhǎng)后期，加入某些能抑

50、制或阻止細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑在生長(zhǎng)后期，加入某些能抑制或阻止細(xì)胞壁物質(zhì)合成的抑制劑制劑( (如青霉素如青霉素) )，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，新分裂的細(xì)胞其，繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間后，新分裂的細(xì)胞其細(xì)胞壁有缺陷，利于破碎；細(xì)胞壁有缺陷，利于破碎；v選擇較易破碎的菌種作為寄主細(xì)胞，如革蘭氏陰性細(xì)菌；選擇較易破碎的菌種作為寄主細(xì)胞，如革蘭氏陰性細(xì)菌；v用基因工程的方法對(duì)菌種進(jìn)行改造，如在細(xì)胞內(nèi)引進(jìn)噬菌用基因工程的方法對(duì)菌種進(jìn)行改造，如在細(xì)胞內(nèi)引進(jìn)噬菌體基因，培養(yǎng)結(jié)束后，控制一定條件（如溫度等），激活體基因，培養(yǎng)結(jié)束后，控制一定條件（如溫度等），激活噬菌體基因，使細(xì)胞自?xún)?nèi)向外溶解，釋放出內(nèi)含物。噬菌體基因，使細(xì)胞

51、自?xún)?nèi)向外溶解，釋放出內(nèi)含物。59破碎技術(shù)研究方向破碎技術(shù)研究方向-與下游工程相結(jié)合與下游工程相結(jié)合舉例：萃取破碎法提取酵母醇脫氫酶舉例：萃取破碎法提取酵母醇脫氫酶60（ inclusion bodies IBs)15.4 15.4 基因工程包含體的純化基因工程包含體的純化基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理基因工程菌培養(yǎng)液不同表達(dá)形式的前處理(胞外分泌型表達(dá)：離心胞外分泌型表達(dá)：離心, ,收集液相收集液相濃縮濃縮純化。純化。(胞內(nèi)表達(dá)：胞內(nèi)表達(dá)：l胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心胞內(nèi)可溶性表達(dá)：離心, ,收集菌體收集菌體細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎離心，離心，收集上清收集上清純化純化l胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：離心胞內(nèi)周質(zhì)表達(dá)：

52、離心, ,收集菌體收集菌體低濃度溶菌酶或滲透低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標(biāo)物壓沖擊等溶解目標(biāo)物離心離心, ,收集上清液收集上清液純化。純化。l不溶性包涵體：離心不溶性包涵體：離心, ,收集菌體收集菌體細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎離心離心, ,收集收集沉淀沉淀包涵體洗滌包涵體洗滌目標(biāo)蛋白變性溶解目標(biāo)蛋白變性溶解復(fù)性復(fù)性純化。純化。61外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白外源蛋白的積累外源蛋白的積累人胰島素人胰島素50%50%形成包涵體形成包涵體 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在細(xì)胞間區(qū)在細(xì)胞間區(qū)-人體干擾素人體干擾素25%25%形成包涵體形成包涵體凝乳酶原凝乳酶原形成包

53、涵體形成包涵體牛生長(zhǎng)激素牛生長(zhǎng)激素30%30%形成包涵體形成包涵體 - -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶形成間區(qū)包涵體形成間區(qū)包涵體人胰島素原人胰島素原5%26%5%26%形成包涵體形成包涵體62Z 包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。包涵體：一種蛋白質(zhì)不溶性聚集體，包括目標(biāo)蛋白、菌體蛋白等。目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生目標(biāo)蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)是正確的，但立體結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的，所以沒(méi)有生物活性。物活性。Z 包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)正常包涵體的形成：大腸桿菌中目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)水平過(guò)高，超過(guò)正常代謝水平，過(guò)多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體

54、。代謝水平，過(guò)多表達(dá)產(chǎn)物聚集在細(xì)胞內(nèi)，形成不溶性的包涵體。Z 高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？高表達(dá)產(chǎn)生的積聚物在細(xì)胞內(nèi)部形成不溶物原因？ 蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀；蛋白過(guò)量積聚，超過(guò)溶解度，導(dǎo)致沉淀；蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子間疏水基團(tuán)相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀；蛋白生成太快，分子內(nèi)部二硫鍵的錯(cuò)誤連接導(dǎo)致沉淀；表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合表達(dá)蛋白過(guò)多，與其結(jié)合/ /誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài)誘導(dǎo)組分不足，不能形成溶解狀態(tài) 蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)自身不穩(wěn)定。包含體的構(gòu)成63基因工程包涵體的純化

55、方法基因工程包涵體的純化方法收集菌體細(xì)胞細(xì)胞破碎包涵體包涵體的洗滌目標(biāo)蛋白的變性溶解目標(biāo)蛋白的復(fù)性包含體的出現(xiàn)不僅增加了包含體的出現(xiàn)不僅增加了生物分離設(shè)計(jì)的難度，也生物分離設(shè)計(jì)的難度，也為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提為蛋白質(zhì)折疊機(jī)理研究提出了新的課題。出了新的課題。欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)欲獲得天然活性態(tài)的目標(biāo)產(chǎn)物，必需分離包含體后，產(chǎn)物，必需分離包含體后，溶解包含體并使其中的目溶解包含體并使其中的目標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活標(biāo)蛋白恢復(fù)應(yīng)有的天然活性。性。64包涵體獲得幾種常見(jiàn)的工藝路線(一)機(jī)械破碎機(jī)械破碎( (高壓勻漿、高速珠磨）高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體離心提取包含體加變性劑溶解加變性劑溶解除

56、變性劑復(fù)性除變性劑復(fù)性65特點(diǎn)特點(diǎn): :是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用是利用了包含體與細(xì)胞碎片的密度差，用離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分離心法將包含體與細(xì)胞碎片和可溶性蛋白質(zhì)分開(kāi)，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)開(kāi)，獲得了干凈的包含體，再對(duì)包含體溶解復(fù)性。性。優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒擺脫了大量的雜蛋白、核酸、熱原、內(nèi)毒素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)素等雜質(zhì)，使后面的分離純化簡(jiǎn)單了。從這個(gè)角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。角度上講，包含體的形成對(duì)分離純化亦有好處。缺點(diǎn)缺點(diǎn): :要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去大部分的細(xì)胞碎要經(jīng)過(guò)幾次離心才能除去

57、大部分的細(xì)胞碎片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。片，加工時(shí)間較長(zhǎng)。路線路線1 的特點(diǎn)的特點(diǎn)66包涵體獲得幾種常見(jiàn)的工藝路線（二）機(jī)械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復(fù)性除變性劑復(fù)性67 路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔路線（二）應(yīng)用了膜分離技術(shù)，用微孔膜除去可溶性蛋白質(zhì)。膜除去可溶性蛋白質(zhì)。u優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受優(yōu)點(diǎn)是封閉式操作，不污染環(huán)境也不受環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。環(huán)境污染，能量消耗也比離心法少。u缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，缺點(diǎn)：細(xì)胞碎片和包含體一起被膜擋住，難以分開(kāi)；而且膜的堵塞和濃差極化常難以分開(kāi)；而且膜的堵塞和濃差極化常常導(dǎo)致可溶性蛋白質(zhì)的滯留。常導(dǎo)致

58、可溶性蛋白質(zhì)的滯留。路線路線2 的特點(diǎn)的特點(diǎn)68包涵體獲得幾種常見(jiàn)的工藝路線（三）化學(xué)破碎（加變性劑）離心除細(xì)胞碎片除變性劑復(fù)性69l用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎用化學(xué)法破碎，所采用的試劑既可以破碎又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，又可以溶解包含體，將兩道工序和為一道，節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)節(jié)省了設(shè)備和時(shí)間，比前兩者更適合于實(shí)驗(yàn)室操作。驗(yàn)室操作。l缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒(méi)有除去，混缺點(diǎn)是所有的可溶性雜質(zhì)都沒(méi)有除去，混雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來(lái)困難。雜在產(chǎn)物中間，給后續(xù)分離帶來(lái)困難。 路線三：路線三：701）包涵體的洗滌）包涵體的洗滌l細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致

59、密。細(xì)胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。l洗滌的重要性：洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖還包括許多雜質(zhì)，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分等，復(fù)性時(shí)會(huì)與目標(biāo)蛋白一起復(fù)性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來(lái)困難。子而聚集，給后步純化帶來(lái)困難。l洗滌劑：洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)。去部分膜蛋白和脂質(zhì)類(lèi)雜質(zhì)。l洗滌劑濃度洗滌劑濃度以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體

60、中表達(dá)以溶解雜質(zhì)，不溶解包涵體中表達(dá)產(chǎn)物為原則。產(chǎn)物為原則。71 2）目標(biāo)蛋白的變性溶解）目標(biāo)蛋白的變性溶解 包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能包涵體中不溶性的目標(biāo)蛋白必須溶解到液相中，才能進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋進(jìn)一步純化。一般水溶液很難將其溶解，只有采用蛋白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。白質(zhì)變性才能使其形成可溶性的形式。 常用變性劑：常用變性劑： 5-8 mol/L鹽酸胍和鹽酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破壞離子間相互作用；作用：破壞離子間相互作用； 表面活性劑如表面活性劑如1-2 SDS，作用：破壞蛋白質(zhì)肽鏈間的疏水相互作用。作用：破壞蛋白