1、人體寄生蟲學實驗補充教材前 言 人體寄生蟲學是臨床醫(yī)學、基礎醫(yī)學、法醫(yī)學、預防醫(yī)學等專業(yè)的必修課程，也是一門實踐性很強的學科。實驗教學的內容包括了形態(tài)和功能兩大部分，教材采用本室自編的人體寄生蟲學實驗指南，該教材已沿用多年，雖幾經修訂，但其中涉及功能的綜合性實驗內容較少，已不能滿足基礎醫(yī)學專業(yè)本科生實驗教學的需要。本教材是在現(xiàn)有實驗教學的基礎上，將多年來在基礎醫(yī)學專業(yè)本科生中開展的人體寄生蟲學的綜合性功能實驗進行整理匯編而成，以人體寄生蟲病為主線，運用免疫學、分子生物學等研究方法，通過一個個相對獨立的實驗，探討有關人體寄生蟲病的診斷、致病機理等方面內容，為學生將來從事醫(yī)學研究工作奠定基礎。本補

2、充教材主要供本?；A醫(yī)學專業(yè)學生使用，也可作為臨床醫(yī)學八年制學生的實驗參考資料。病原生物學系2005年12月第一部分 日本血吸蟲致病相關實驗實驗目的：掌握日本血吸蟲的主要感染方式、寄生部位及成蟲形態(tài)特征；掌握日本血吸蟲病的診斷方法；了解肝、腸組織內日本血吸蟲卵的形態(tài)及其病變特征，日本血吸蟲的蟲卵抗原和成蟲抗原的制備。實驗一 日本血吸蟲動物模型的建立和解剖（本實驗為自主設計實驗，具體要求和內容見人體寄生蟲學實驗指南）實驗二 診斷日本血吸蟲病的免疫學方法之一ELISA實驗原理：酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）是常用的診斷日本血吸蟲

3、病的免疫學方法。將日本血吸蟲的可溶性抗原包被在特制的聚苯乙烯反應孔內，將待測的血清加到反應孔內，如血清中含有相應的特異性抗體，即可形成抗原抗體復合物，若在反應孔內加入相應的HRP酶標記二抗，即可通過底物的顯色反應來判斷實驗結果。ELISA方法可廣泛用于多種寄生蟲感染的檢測。實驗材料和方法：試劑PBS (10 mM pH7.4) NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 .12H2O 2.9g KH2PO4 0.2g 蒸餾水至 1000ml PBST（ 含0.05% Tween-20的PBS）包被液（PH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液）封閉液：3脫脂奶（3g脫脂奶/100mlPBS），底

4、物顯色液 檸檬酸（0.1M） 12.15ml Na2HPO4（0.2M） 12.85ml 鄰苯二胺（OPD） 20mg H2O2 80ml 雙蒸水 25ml 總體積 50ml, 臨用前加H2O2兔抗血清：血吸蟲感染動物實驗獲得，20凍存?zhèn)溆每雇肐gGHRP注：檢測病人時用待測病人的血清，二抗則用抗人IgG-HRP器材 分光光度計、酶標儀、超聲粉碎儀、離心機等主要步驟1 日本血吸蟲成蟲及蟲卵抗原的制備收集上述感染動物（家兔）的蟲卵及成蟲，用適量的PBS稀釋，超聲粉碎后高速離心30 分鐘，分別收集上清液，測定蛋白含量。2 ELISA過程：包被：以包被液稀釋上述抗原成5ug/ml, 100ul/孔，

5、4 濕盒過夜洗滌：以PBST洗滌5次封閉：以3脫脂奶封閉，300ul/孔，室溫1小時 與抗血清反應：加入兔抗血清（1：400），100ul/孔，室溫1小時同上洗滌6次與酶標二抗反應：加入羊抗兔IgGHRP（1：5000），100ul/孔，室溫1小時同上洗滌6次顯色：加入顯色液200ul/孔，室溫半小時，避光終止：以2N H2SO4 50ul 終止反應實驗結果觀察和分析OD490nm處讀取結果（陽性反應呈棕色或棕黃色）注意事項1 嚴格實驗操作，嚴防孔間交叉污染。2 實驗中要設定無抗原的空白對照、陽性對照和陰性對照。第二部分 溶組織內阿米巴致病相關的功能實驗實驗目的：掌握溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體和包囊

6、的形態(tài)特征及致病特征；熟悉溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體的偽足運動、吞噬紅細胞作用及阿米巴病的免疫學和分子生物學診斷方法；了解溶組織內阿米巴致病的分子特征和溶組織內阿米巴的培養(yǎng)方法。實驗一 溶組織內阿米巴吸附紅細胞抑制實驗實驗原理溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體可借助其一系列的致病因子侵襲宿主組織器官，尤其是半乳糖/乙酰氨基半乳糖凝集素(Gal/GalNAc lectin)，可介導滋養(yǎng)體附著于宿主結腸上皮細胞等細胞表面，進一步引起細胞溶解、組織破壞并形成潰瘍。實驗材料和方法試劑溶組織內阿米巴HM11MSS（標準株），美國NIH Dr. L.S.Diamond Lab引入，美國ATCC 注冊，本實驗室保種A液：0.5

7、M 葡萄糖 B液：0.5M 葡萄糖 C液：0.5M乙酰氨基半乳糖 D液：PBS2.5戊二醛器材 普通光學顯微鏡 離心機 加樣器 細胞計數(shù)板 主要步驟：1溶組織內阿米巴HM11MSS的無菌培養(yǎng)（教師準備）2紅細胞吸附抑制實驗1） 將阿米巴培養(yǎng)管置于冰上10分鐘，上下顛倒混合，以使滋養(yǎng)體從試管壁上脫落于培養(yǎng)液中2） 400g 離心2分鐘3） 棄上清液，加入PBS，調節(jié)阿米巴終濃度為105/ml4） 分別取100ul阿米巴液至4個1.5ml離心管中，各加入A液100l，B液100l，C液100l，D液100l，顛倒混勻，室溫靜置5分鐘5） 400g 離心2分鐘6） 棄上清液，加入50l PBS和50

8、ul紅細胞（106/ml）,混勻7） 冰浴10分鐘后轉入15ml 離心管中，加入10ul 蒸餾水，迅速于600rpm離心1分鐘8） 加入2.5戊二醛，固定30分鐘9） 400 rpm 離心2分鐘，重復2次10） 棄上清，剩余約100l，輕柔重懸11） 含0.2%H2O2的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液中染色30分鐘12） 400 rpm 離心2分鐘，重復1次，鏡下觀察實驗結果觀察和分析鏡下觀察各組溶組織內阿米巴吸附紅細胞情況并計數(shù)實驗二 Dot-blot (斑點雜交)實驗原理Dot-blot (斑點雜交)是一種常用的免疫學方法。將特定的阿米巴抗原點樣在硝酸纖維素濾膜上，然后加入特異性阿米巴抗體與膜

9、上相應的抗原反應，再加入HRP酶標記的二抗，通過染色即獲得相應結果。實驗材料和方法試劑抗原：溶組織內阿米巴的重組蛋白，表面半乳糖/乙酰氨基半乳糖可抑制性凝集素的中介亞單位 (全長150kD)0.01mol/L PH 7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS）0.05 吐溫20的PBS (PBST)封閉液：5脫脂奶（5g脫脂奶/100mlPBS）阿米巴病人血清及健康人血清辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體（anti-human IgG-HRP）顯色液1M PH7.6 Tris-Hcl 90ul3%CoCl2 100ul DAB 6mg蒸餾水 9.8ml臨用前加30H2O2 10ul 器材硝酸纖維素濾膜， p

10、arafilm封口膜，濕盒等 主要步驟：1. 剪膜 (1.5cm×4.0cm) 2. 將2ug抗原按2l/次，分次或分別點樣于膜上，室溫晾干約30min3. 準備濕盒，將玻片置于相關支架上，盒中加上適量的水或PBS，剪大小適當?shù)膒arafilm封口膜貼在玻片上4. 將膜置于parafilm上，加封閉液約500ul覆蓋膜，靜置于濕盒中30分鐘5. 吸去封閉液，加以封閉液稀釋的病人血清及健康人血清350l (1:200)，靜置1小時6. 吸去血清，以PBST洗膜。換液間隔時間依次為5min、5min、10min、10min7. 將膜置于濕盒中的玻片上，加1：500稀釋的抗人IgGHRP

11、350l，靜置1小時8. 吸去抗體，PBST洗膜，換液間隔時間同上9. 將膜浸入顯色劑中，以膜背景不被染色為度（一般顯色時間不超過30min）實驗結果觀察和分析 根據濾膜的顯色情況判斷結果，陽性反應呈棕色或棕黃色。實驗三 IFA診斷阿米巴病實驗原理免疫熒光試驗 (Immunofluorescence assay，IFA）是診斷阿米巴病的常用免疫學方法。其基本過程是將純培養(yǎng)的溶組織內阿米巴滋養(yǎng)體洗滌除去培養(yǎng)基后，固定，爾后加樣在在特定的玻片上，經封閉后加入不同稀釋度的待測血清，再加入熒光素（FITC）標記的二抗，在熒光顯微鏡下觀察熒光的有無和強弱來判斷結果。實驗材料和方法試劑溶組織內阿米巴HM1

12、1MSS（標準株），美國NIH Dr. L.S.Diamond Lab引入，美國ATCC 注冊，本實驗室保種抗原片（由HM11MSS標準株制備，20凍存?zhèn)溆茫?.01mol/L PH 7.4 磷酸鹽緩沖液（PBS），封閉液：3脫脂奶（3g脫脂奶/100mlPBS），阿米巴病人血清及健康人血清FITC標記的抗人IgG抗體（anti-human IgG-FITC）器材熒光顯微鏡， 洗缸，濕盒等主要步驟：1封閉：取出抗原片，每孔加50ul 封閉液，置濕盒內室溫15min 2加待測血清及陰性、陽性對照血清將不同稀釋度的待測血清（1：16，1：64，1：256，1：1024，1：4096）及陰性對照（1

13、：16，1：64）、陽性對照（1：256，1：1024，1：4096）以每孔50ul 加入抗原片上，置濕盒內室溫30min3 洗滌：在特制洗缸內以PBS洗滌15min，期間換洗液3次。4 加熒光素標記的二抗：1：100稀釋熒光素標記的抗體（稀釋液為3脫脂奶），每孔25ul，置濕盒內室溫30min（避光），洗滌15min, 同上5 加50甘油PBS，蓋上蓋玻片，于熒光顯微鏡下觀察。實驗結果觀察和分析 在熒光顯微鏡下觀察熒光的強弱來判斷結果實驗四 溶組織內阿米巴病的PCR診斷實驗原理PCR基本原理及方法是依據細胞分裂中的 DNA半保留復制機理以及dNTP分子在不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉變的性質

14、，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈變成單鏈DNA；單鏈DNA與人工合成的引物退火以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。依據PCR基本原理，通過特異性引物從溶組織內阿米巴的DNA中擴增獲得相應的特異性片段，根據瓊脂糖凝膠電泳上是否存在特定的DNA片段判斷結果。實驗材料和方法試劑碘液（碘5g, 碘化鉀10g, 蒸餾水100ml）10%甲醛-PBS 乙醚Triton X-100 2×Lysis buffer: 0.2M NaCl 20mM Tris-HCl pH 8.0 20mM EDTA pH8.0 4% SDS苯酚/氯仿/異戊醇 (25:

15、24:1)PCR 實驗相關試劑1） 10X buffer2） Taq酶3） dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP): 各2.5mMol4） 引物p11、p125） 消毒蒸餾水6） 致病性阿米巴DNA7） 電泳緩沖液 0.04mol/L Tris-乙酸 0.001mol/EDTA配制40ml 2%的瓊脂糖(Agarose)溶液：稱取Agarose 0.4g入250ml的燒瓶中，加入40ml電泳緩沖液，微波爐加熱溶解，待瓊脂糖溶液溫度降至75度時，加入溴化乙錠溶液(1mg/ml)20l，混勻，使終濃度為0.5g/ml。倒入電泳板中，冷卻備用。器材離心機、搖床、PCR儀、電泳槽、

16、紫外成像系統(tǒng)等主要步驟：一醛醚沉淀法取糞便1g左右（黃豆大?。?，加PBS混勻制成懸液，濾過二層紗布以去除粗渣，濾過液2500rpm離心1分鐘，棄上清液，沉渣加入10%的甲醛-PBS 5ml, 固定30min，加入3ml乙醚，劇烈振搖1分鐘，2500rpm離心1分鐘，棄上層液，以棉簽檫凈試管壁上的殘液，直接鏡檢或碘液染色鏡檢。（若為可疑AIDS病人，為安全起見，可直接以10%的甲醛-PBS 5ml或更多固定30min，再離心調節(jié)體積為5ml，余下步驟同前）二溶組織內阿米巴DNA的提取1沉渣反復凍融3-6次（凍 -30°C或-80°C 10min, 融 37°C 2m

17、in）2加Triton X-100, 使終濃度1%1.25%，100°C煮沸10min3冷卻至室溫，加入蛋白酶K，使終濃度為0.5mg/ml, 再加入等量Lysis buffer(2×)，55°C緩慢振蕩數(shù)小時或過夜，60度振蕩1小時。4加入等量酚：氯仿：異戊醇=25：24：1，緩慢振搖數(shù)小時或過夜。15000轉離心2min， 取水相，轉移入新管中。5重復步驟4兩次。6. 15000轉離心2min，取水相，轉移入新管中,估計容量。加入10% 3mol/L的乙酸鈉和2-2.5 倍的無水乙醇，-20度過夜。7.15000轉離心10min，棄上清液，加70%乙醇懸浮。1

18、5000轉離心10min，棄上清液，自 然干燥，加適量雙蒸水溶解備用。注：滋養(yǎng)體DNA抽提，與包囊相似，但更簡單，只要取含膿血的糞便，加入等量的Lysis buffer和最終0.5mg/ml的 蛋白酶K，55°C數(shù)小時而后60°C12小時，再P/C/I抽提，余下相同。組織液、膿液中的蟲體DNA提取則要根據組織的性質而定，組織液若粘稠可用不含針頭的OT針筒從送樣品的盛器中取0.1ml，若為一些稀釋的組織液可以高速離心后沉渣加Lysis buffer溶解。三PCR1. 取0.5ml薄壁管，依次加入 消毒水15l × 5 Buffer 2.5l × 5 MgC

19、l2 1.5l × 5 dNTP 2l ×5 p11 1.25l × 5 p12 1.25l ×5 Taq酶0.5l × 5 DNA 1l× 5 （最后加） 共125l，分裝成五管。 2PCR程序設置：94 94 59 72 722min 15 sec 30sec 60 sec 1min×34 cycles6 啟動PCR儀，待溫度升至80時將試管放入。7 PCR結束后，取10l DNA液與2l溴酚藍指示劑混合上樣，同時上樣DNA Marker 1ul， 100V電泳約25分鐘，紫外成像系統(tǒng)下觀察結果并拍照記錄結果。實驗結果觀

20、察和分析 通過觀察瓊脂糖凝膠電泳上是否存在特定的DNA片段進行診斷。第三部分 滴蟲病相關實驗實驗一 滴蟲病的藥敏試驗實驗原理 選用對陰道毛滴蟲的代謝有抑制阻斷作用的藥物，經孵育后以臺盼蘭染色觀察死亡的蟲體數(shù)并設無關藥物作為對照組。實驗材料和方法試劑陰道毛滴蟲蟲株由美國ATCC引入，本實驗室保種甲硝唑和吡喹酮陰道毛滴蟲純培養(yǎng)用的培養(yǎng)基（同溶組織內阿米巴培養(yǎng)，但pH 5.8）苔盼藍器材培養(yǎng)箱，細胞計數(shù)板，顯微鏡等主要步驟：1 培養(yǎng)：陰道毛滴蟲從低溫取出后復蘇，培養(yǎng)24小時后更換培養(yǎng)基，加入pH 5.8的BI-S-33培養(yǎng)基，36±0.5培養(yǎng)72小時再進行轉種。36±0.5培養(yǎng)，

21、當生長72小時達到對數(shù)生長期后即可進行實驗。（教師準備）2 藥物培養(yǎng)基配制：用不含任何抗菌素的BI-S-33培養(yǎng)基將含10mg/ml甲硝唑和吡喹酮的備用液稀釋成如下濃度：100g/ml、10g/ml、1g/ml、0.1g/ml；3 蟲體準備：陰道毛滴蟲培養(yǎng)生長72小時后，冰浴10分鐘，上下顛倒混和，以血球計數(shù)板計數(shù)，1600rpm離心2min后調節(jié)蟲體濃度，使之達到1×106/ml，取10l，加等量的0.1苔盼藍染色，保證活蟲數(shù)在98后方可進行實驗；4 實驗操作：取1ml陰道毛滴蟲培養(yǎng)液加入含不同藥物濃度的培養(yǎng)基中，終體積為6ml，36±0.5培養(yǎng)12小時，并設不含藥物培養(yǎng)

22、基為對照。12小時后取培養(yǎng)管冰浴，滋養(yǎng)體以0.1苔盼藍染色檢查，每管檢測100個，觀察死亡的蟲體數(shù)。實驗結果觀察和分析 在普通光學顯微鏡下觀察存活的陰道毛滴蟲的百分率來判斷結果。 附：阿米巴培養(yǎng)一 有菌培養(yǎng)主要用Robinsons培養(yǎng)基，不僅可以培養(yǎng)溶組織內阿米巴，也可以培養(yǎng)哈門氏內阿米巴、結腸內阿米巴、微小內蜒阿米巴等多種阿米巴。一般應用6ml7ml或更小的螺旋有蓋培養(yǎng)管。組成成分：1. 鹽水瓊脂斜面：溶解15g瓊脂粉和8g氯化鈉于1000ml蒸餾水中，加熱溶解。分裝在小試管(23ml)中高壓滅菌(121,15min)，當瓊脂冷卻至75左右，傾放使其形成斜面。2. 紅霉素：將0.5g實驗室用

23、紅霉素粉劑置于無菌容器中，加入20ml 70%乙醇溶解，4放置2小時以上，而后加滅菌水至50ml。3. 米粉：市售梗米粉經高壓消毒或180干燥滅菌。4. 配制50mmol鄰苯二甲酸氫鉀（Phthalate），pH6.3，高壓滅菌。5. 血清(牛或馬血清)：56 30min滅活。6. 大腸桿菌培養(yǎng)液(R液)： NaCl 5g (NH4) 2SO4 1g 檸檬酸.2H2O 2g MgSO4.7H2O 0.05g KH 2PO4 0.5g 乳酸(90%純度) 0.4ml加水至95ml，調節(jié)pH至7.0，最終調節(jié)容量至100ml，制備成貯存工作液。使用前稀釋，將10ml貯存液加入85ml雙蒸水，調節(jié)p

24、H至7.0，高壓滅菌。7. BR基礎阿米巴培養(yǎng)液：25ml R液中加入1個克隆的細菌或1ml細菌，37振搖培養(yǎng)2448小時。8. BRS完整阿米巴培養(yǎng)液：在上述BR溶液中加入等量血清，繼續(xù)培養(yǎng)24小時48小時即可備用。含阿米巴包囊的糞便培養(yǎng)操作步驟：在含瓊脂斜面的培養(yǎng)管中加入10mg米粉、120ml紅霉素液和足夠遮蓋斜面量的鄰苯二甲酸氫鉀和BRS液(4:1混合液)，加入少量(約50mg)糞便，混勻，37培養(yǎng)24小時后，移去培養(yǎng)上清液，再 加入適量4:1混合液和60ml紅霉素和米粉。37繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，取米粉與糞渣混合物一滴，顯微鏡下觀察有無滋養(yǎng)體；若未發(fā)現(xiàn)蟲體，則再加入米粉，繼續(xù)培養(yǎng)24小

25、時觀察。若發(fā)現(xiàn)蟲體可將少量培養(yǎng)混合液轉入新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，即為轉種。并可進一步轉成無菌培養(yǎng)。二、無菌培養(yǎng)最常用的是BIS-33培養(yǎng)基，也稱TYI-S-33培養(yǎng)基，幾乎可用于所有的內阿米巴屬原蟲、藍氏賈第鞭毛 蟲、陰道毛滴蟲等。培養(yǎng)在6ml的玻璃有蓋培養(yǎng)管中，由于阿米巴為兼性厭氧代謝，故應緊蓋管蓋，并呈5°的角度放置。BIS-33培養(yǎng)基含三個組分，即營養(yǎng)液、維生素混合液、成牛血清。營養(yǎng)液(870ml) 消化蛋白胨、酵母提取物混合物 30g 葡萄糖 10g NaCl 2g KH 2PO4 0.6g K2HPO4 1.0g L-半胱氨酸鹽-HCl(L-Cystein-HCl) 1g 維生素C 0.2g 枸櫞酸鐵胺(棕色結晶) 22.8mg 溶于600ml雙蒸水中，調節(jié)pH至6.8，最終容量調至870ml，分裝，121消毒，20分鐘。壓力降至零后速取出。冷卻后，于-20°貯存。維生素培養(yǎng)液(1000ml) 溶液A： 煙酰胺 (Niacinam