1、實驗四 大黃中游離蒽醌類成分的提取、分離與鑒定 一、概述植物來源：大黃系蓼科植物掌葉大黃(Rheum palmatum L)、唐古特大黃(Rheum tanguticum Maxim. ex Balf)或藥用大黃(Rheum offcinale Baill)的干燥根及根莖。大黃記載于神農(nóng)本草經(jīng)等許多文獻中，具有瀉下、健胃、清熱解毒等功效。自古以來，大黃在植物性瀉下藥中占有重要位置，是一味很早就被各國藥典收載的世界性藥材。功效：大黃具有多方面的生物活性，其抗菌、抗感染及抗腫瘤活性有效成分主要為蒽醌類衍生物，如：大黃酸、大黃素和蘆薈大黃素；止血的主要有效成分為大黃酚；瀉下的有效成分是結(jié)合型的蒽苷類

2、。蒽醌類衍生物占大黃總化學成分的35，該類成分少部分以游離狀態(tài)存在，大部分與葡萄糖結(jié)合成苷的形式存在。此外，大黃還含有鞣質(zhì)等多元酚類化合物，含量在10一30之間，具止瀉作用，與蒽苷的瀉下作用恰恰相反。 主要化學成分的結(jié)構(gòu)及物理性質(zhì) 大黃中含有多種游離的羥基蒽醌及其與糖所形成的苷類化合物，已知的游離羥基蒽醌主要有以下5種化合物。 大黃酸(rhein)，C15H806，黃色針晶，m.p321322(330分解)，UVmax431，258，231，204?？扇苡趬A水，微溶于乙醇、苯、三氯甲烷、乙醚和石油醚，不溶于水。 大黃素(emodin)，C15H1005，橙黃色針晶(乙醇)，m.p256257。

3、UVmax436，289，266，253，222。可溶于堿水，微溶于乙醚、三氯甲烷，不溶于水。 蘆薈大黃素(aloe emodin)，橙色針晶(甲苯)，m.p223224。UVmax429，287，254，225，202?？扇苡谝颐?、苯及堿水，不溶于水。 大黃素甲醚(physcion)，磚紅色單斜針狀結(jié)晶(苯)，m.p205207。溶于苯、三氯甲烷及甲苯，不溶于甲醇、乙醇、乙醚和丙酮，不溶于水。大黃酚(chrysophano1)，C15H1004，橙黃色針晶(乙醇或苯)，m.p195196。UVmax429，287，256，225，202?？扇苡诒?、三氯甲烷、苯、乙醚和冰醋酸和堿水，微溶于石

4、油醚，不溶于水。大黃酸葡萄糖苷(rhein 8-monoglucoside)，黃色針晶。m.p266267。大黃素葡萄糖苷(emodin monoglucoside)，橙色針晶(甲苯)。m.p190191。蘆薈大黃素葡萄糖苷(aloeemodin monoglucoside)，黃色針晶。m.p235。大黃酚葡萄糖苷(chrysophanol monoglucoside)，橙色針晶(甲苯)。m.p239。二、實驗部分(一)實驗目的要求1掌握蒽醌苷元的提取方法雙相酸水解法。2掌握梯度PH萃取法提取分離大黃中各種蒽醌苷元的原理及操作方法。3掌握羥基蒽醌類化合物的顏色反應及薄層色譜鑒別方法。(二)實驗

5、的基本原理 1提取原理 雙相酸水解法，為一相為與酸水不相互溶的有機溶劑，另一相為酸水，加熱回流水解的方法。由于大黃中的羥基蒽醌類化合物多以苷的形式存在，所以首先要將苷水解成苷元，本實驗選用硫酸和乙酸乙酯作為雙相酸水解的溶劑，采用加熱回流方法，提取大黃藥材中的游離蒽醌類化合物。根據(jù)苷元不溶于水，可溶于乙醚、乙酸乙酯等親脂性有機溶劑的性質(zhì)，即在加熱回流提取過程中，稀硫酸可將蒽醌苷水解成苷元，游離出來的蒽醌苷元隨即溶于乙酸乙酯中，從而將蒽醌苷元提取出來。 2分離原理 pH梯度萃取法 羥基蒽醌類化合物酸性強弱不同，用pH梯度法進行分離。具有羧基或多個位酚羥基的蒽醌可溶于5碳酸氫鈉溶液；具有一個位酚羥基

6、的蒽醌可溶于5碳酸鈉溶液，只具有位酚羥基的蒽醌，酸性弱，只溶于氫氧化鈉溶液。以分離酸度不同的蒽醌苷元。也可利用游離蒽醌的極性不同，采用硅膠柱色譜法進行分離(1)大黃中游離蒽醌的酸性強弱順序 大黃酸(COOH)大黃素(酚OH)蘆薈大黃素(醇OH)大黃素甲醚(OCH3)大黃酚(CH3)。 (2)大黃中游離蒽醌的極性大小順序 大黃酸大黃素蘆薈大黃素大黃素甲醚大黃酚。 大黃酚和大黃素甲醚酸性相近，但極性不同，可用硅膠柱色譜法進行分離。(三)實驗方法1總蒽醌苷元的提取、分離工藝流程 操作注意事項所得乙酸乙酯液中若帶有酸水液，應用分液漏斗分出棄去；此處用蒸餾水洗除乙酸乙酯液中的酸。萃取時容易發(fā)生乳化，而且

7、隨著堿液堿度的增高，乳化現(xiàn)象會越嚴重，所以要輕輕振搖。每次加堿液進行pH梯度萃取時，注意要測一下乙酸乙酯液的pH。萃取時一定要注意乳化層的分出，不要混入。2總蒽醌苷元的提取大黃粗粉50g，置500ml燒瓶中，加20硫酸溶液100ml和乙酸乙酯250ml，水浴回流提取2個h (加磁子攪拌)，放置，冷后過濾，殘渣棄去，乙酸乙酯提取液置分液漏斗中，分出酸水層，乙酸乙酯提取液用蒸餾水洗2次（每次20ml），將乙酸乙酯液放置在錐形瓶中，密封。3.游離蒽醌的分離與精制 (1)大黃酸的分離和精制將乙酸乙酯提取液置500m1分液漏斗中，用5NaHCO3溶液萃取三次（80ml, 60ml, 40ml），合并堿液

8、，在攪拌下滴加濃鹽酸，調(diào)節(jié)ph2，放置，待沉淀析出完全后，過濾，并用少量水洗沉淀物至洗出液呈中性，60干燥，得深褐色粉末，主為大黃酸。沉淀干燥后，樣品加冰醋酸10ml加熱溶解，趁熱過濾，濾液放置析晶，過濾，用少量冰醋酸淋洗結(jié)晶，得黃色針晶為大黃酸。 (2)大黃素的分離和精制經(jīng)NaHCO3溶液提取過的乙酸乙酯液，繼用5Na2CO3溶液萃取三次，每次用量40ml，合并堿液，在攪拌下滴加濃鹽酸，調(diào)節(jié)ph2，析出棕黃色沉淀，抽濾，水洗沉淀物至洗出液呈中性，60干燥，沉淀經(jīng)干燥后，用15ml丙酮熱溶，趁熱過濾，濾液靜置，析出橙色針晶，過濾后，用少量丙酮淋洗結(jié)晶，得大黃素。(3) 蘆薈大黃素，大黃素甲醚和

9、大黃酚混合物的分離經(jīng)Na2CO3提取過的乙酸乙酯液，再用5NaOH溶液提取三次，每次用量40ml，合并后的堿液同（1）法處理，所得產(chǎn)品為黃色粉末，為蘆薈大黃素、大黃酚和大黃素6甲醚的混合物。3.游離蒽醌類化合物的鑒定 (1)化學鑒定 堿液試驗 分別取各蒽醌結(jié)晶少許置于小試管中，加lml乙醇溶解，加10氫氧化鈉溶液數(shù)滴，觀察顏色變化。羥基蒽醌類應呈紅色。 醋酸鎂試驗 分別取各蒽醌結(jié)晶少許置于小試管中，各加乙醇lml使溶解，滴加05醋酸鎂乙醇溶液，觀察顏色變化，羥基蒽醌應顯橙色到藍紫色。 (2)色譜鑒定 薄層色譜鑒定 吸附劑：硅膠GCMCNa板。 樣 品：上述分別獲得的大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、

10、大黃素甲醚和大黃酚的三 氯甲烷溶液及各相應對照品的三氯甲烷溶液。 展開劑：石油醚乙酸乙酯醋酸(2：1：0.2)。 展開方式：上行展開。 顯 色：在可見光下觀察，記錄黃色斑點出現(xiàn)的位置，然后用濃氨水熏或噴5醋 酸鎂甲醇溶液，斑點顯紅色。 實驗結(jié)果記錄：觀察斑點顏色，記錄圖譜并計算Rf值。四、注意事項大黃中蒽醌類化合物的種類、含量與大黃的品種、采集季節(jié)、炮制方法及貯存時間均有關(guān)系。由于蒽醌類衍生物主要以苷的形式存在，所以較新鮮的原藥材蒽醌類成分含量高，如果是貯存時間長的飲片，則蒽醌類成分含量低，實驗選材要注意。用堿液萃取時要注意濃度和用量，酸化時，加酸要慢，多攪拌。分液漏斗的正確使用。 五、思考題1簡述液液萃取法的原理、溶劑選擇原則和操作技術(shù)。2什么叫雙相酸水解?掌握其原理和用途。3大黃中5種游離羥基蒽醌化合物的酸性和極性與結(jié)構(gòu)有什么關(guān)系?4pH梯度萃取法的原理是什么?該法適用于哪些中藥成分的分離?5蒽醌類化合物及其甙的薄層色譜用什么作吸附劑、展開劑和顯色劑?6. 蒽醌類與醋酸鎂顯色反應的必要條件是什么?其顏色反應與羥基所在的位置有何關(guān)系?參 考 文 獻1楊其菖主編天然藥物化學北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1998，84-872李嘉蓉主編天然藥物化學實驗北京：中國醫(yī)藥科技出版