1、限制性內(nèi)切酶及其他重要工具酶限制性內(nèi)切酶及其他重要工具酶 凡是酶，都有最適溫度、最適pH和離子強(qiáng)度的問(wèn)題，所以酶促反應(yīng)要注意Buffer的正確使用。限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識(shí)別雙是一類能識(shí)別雙鏈鏈DNA分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的DNA水水解酶。解酶。是體外剪切基因片段的重要工是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。限制性核酸內(nèi)切酶不僅是限制性核酸內(nèi)切酶不僅是DNA重組中重組中重要的工具，而且還可以用于基因組重要的工具，而且還可以用于基因組酶切圖譜的鑒

2、定。酶切圖譜的鑒定。1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象2) 核酸限制性內(nèi)切酶的類型核酸限制性內(nèi)切酶的類型3) 核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性核酸限制性內(nèi)切酶的基本特性4) 同裂酶和同尾酶同裂酶和同尾酶5) 核酸限制性內(nèi)切酶的命名法核酸限制性內(nèi)切酶的命名法6) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素主要內(nèi)容：1) 寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。限制與修飾系統(tǒng)是細(xì)胞的一種防衛(wèi)手段。 各各種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割種細(xì)菌都能合成一種或幾種能夠切割DNA雙雙鏈的核酸內(nèi)切酶，它們以此來(lái)限制外源鏈的核酸內(nèi)切酶

3、，它們以此來(lái)限制外源DNA存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自存在于自身細(xì)胞內(nèi)，但合成這種酶的細(xì)胞自身的身的DNA不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了不受影響，因?yàn)檫@種細(xì)胞還合成了一種修飾酶，對(duì)自身的一種修飾酶，對(duì)自身的DNA進(jìn)行了修飾，限進(jìn)行了修飾，限制性酶對(duì)修飾過(guò)的制性酶對(duì)修飾過(guò)的DNA不能起作用。這種現(xiàn)不能起作用。這種現(xiàn)象被稱為寄主象被稱為寄主控制的限制與修飾現(xiàn)象控制的限制與修飾現(xiàn)象。2)限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性限制性核酸內(nèi)切酶的類型及特性按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切按限制酶的組成、與修飾酶活性關(guān)系以及切斷核酸的情況不同，分為三類：斷核酸的情況不同，分為三類： 型型 型型* 型

4、型第一類（第一類（I I型）限制性內(nèi)切酶型）限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核的核苷酸順序，并在識(shí)別點(diǎn)附近的一些核苷酸上切割苷酸上切割DNADNA分子中的雙鏈，但是切割分子中的雙鏈，但是切割的核苷酸順序沒(méi)有專一性，是隨機(jī)的。這的核苷酸順序沒(méi)有專一性，是隨機(jī)的。這類限制性內(nèi)切酶在類限制性內(nèi)切酶在DNADNA重組技術(shù)或基因工重組技術(shù)或基因工程中用處不大，無(wú)法用于分析程中用處不大，無(wú)法用于分析DNADNA結(jié)構(gòu)或結(jié)構(gòu)或克隆基因。這類酶如克隆基因。這類酶如EcoEcoB B、EcoEcoK K等。等。 第二類第二類(II(II型型) )限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶能識(shí)別專一

5、的核苷能識(shí)別專一的核苷酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。酸順序，并在該順序內(nèi)的固定位置上切割雙鏈。由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸由于這類限制性內(nèi)切酶的識(shí)別和切割的核苷酸都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是都是專一的。因此，這種限制性內(nèi)切酶是DNADNA重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別重組技術(shù)中最常用的工具酶之一。這種酶識(shí)別的專一核苷酸順序最常見(jiàn)的是的專一核苷酸順序最常見(jiàn)的是4 4個(gè)或個(gè)或6 6個(gè)核苷酸，個(gè)核苷酸，少數(shù)也有識(shí)別少數(shù)也有識(shí)別5 5個(gè)核苷酸以及個(gè)核苷酸以及7 7個(gè)、個(gè)、8 8個(gè)、個(gè)、9 9個(gè)、個(gè)、1010個(gè)和個(gè)和1111個(gè)核苷酸的。個(gè)核苷酸的。 II II

6、型限制性內(nèi)切酶的型限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心識(shí)別順序是一個(gè)回文對(duì)稱順序，即有一個(gè)中心對(duì)稱軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向?qū)ΨQ軸，從這個(gè)軸朝二個(gè)方向“讀讀”都完全相都完全相同同。這種酶的切割可以有兩種方式：這種酶的切割可以有兩種方式：粘性末端：粘性末端：交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，交錯(cuò)切割，結(jié)果形成兩條單鏈末端，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，這種末端的核苷酸順序是互補(bǔ)的，可形成氫鍵，所以稱為粘性末端。所以稱為粘性末端。如如EcoEcoRIRI的識(shí)別順序?yàn)椋旱淖R(shí)別順序?yàn)椋?5 GAA|TT_C 35 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 3 C_TT|A

7、AG 5垂直線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)垂直線表示中心對(duì)稱軸，從兩側(cè)“讀讀”核苷酸順序都是核苷酸順序都是GAATTCGAATTC或或CTTAAGCTTAAG，這就是回文順序（，這就是回文順序（palindromepalindrome）。）。_ _和和表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成表示在雙鏈上交錯(cuò)切割的位置，切割后生成5G5G和和AATTC3AATTC3、3CTTAA3CTTAA和和G5G5二個(gè)二個(gè)DNADNA片段，各片段，各有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯有一個(gè)單鏈末端，二條單鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，其斷裂的磷酸二酯鍵以及氫鍵可通過(guò)鍵以及氫鍵可通過(guò)DNADNA連接酶的作用而連接酶的作

8、用而“粘合粘合”。IIII型酶切割方式的另一種是在同一位置型酶切割方式的另一種是在同一位置上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如上切割雙鏈，產(chǎn)生平頭末端。例如EcoEcoRV RV 的識(shí)別位置是：的識(shí)別位置是： 5 GAT|ATC 35 GAT|ATC 33 CTA|TAG 5 3 CTA|TAG 5 切割后形成切割后形成5 GAT5 GAT和和ATC 3ATC 3、 3 CTA3 CTA和和TAG 5TAG 5。這種末端。這種末端同樣可以通過(guò)同樣可以通過(guò)DNADNA連接酶連接起來(lái)。連接酶連接起來(lái)。平頭末端：平頭末端：第三類（第三類（ IIIIII型）限制性內(nèi)切酶型）限制性內(nèi)切酶也有專一也有專一的識(shí)別

9、順序，但不是對(duì)稱的回文順序的識(shí)別順序，但不是對(duì)稱的回文順序, ,在識(shí)在識(shí)別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切別順序旁邊幾個(gè)核苷酸對(duì)的固定位置上切割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。割雙鏈。但這幾個(gè)核苷酸對(duì)不是特異性的。因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一因此，這種限制性內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生的一定長(zhǎng)度定長(zhǎng)度DNADNA片段，具有各種單鏈末端。因此片段，具有各種單鏈末端。因此不能應(yīng)用于基因克隆。不能應(yīng)用于基因克隆。常用的限制性內(nèi)切酶BamH I GGATC_CHind III AAGCT_T EcoR V GAT!ATC 平頭末端 Nde I CATAT_GNco I CCATG_G同位酶（同裂酶、

10、同工酶） 舉例Hpa、Msp：GCG_GAfl II、BspT I CTTAA_G同尾酶Xba I：TCTAG_ANhe I：GCTAG_CSpe I：ACTAG_T同裂酶：同裂酶：有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，有時(shí)其差別只在于當(dāng)和切割位置都相同，有時(shí)其差別只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例制性內(nèi)切酶可以切割，另一種則不能。例如如HpaHpa和和MspMsp的識(shí)別順序都是的識(shí)別順序都是5GCG_C35GCG_C3，如果其中有，如果其中有5-5-甲基胞嘧啶

11、，則只有甲基胞嘧啶，則只有HpaHpa能夠切割。這些能夠切割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱為有相同切點(diǎn)的酶稱為同裂酶（同切酶或異同裂酶（同切酶或異源同工酶）源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶：同裂酶和同尾酶：有時(shí)兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生有時(shí)兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶同尾酶，可以，可以通過(guò)通過(guò)DNADNA連接酶將這類末端連接起來(lái)，但原來(lái)連接酶將這類末端連接起來(lái)，但原來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。如的酶切位點(diǎn)。如Xba Xba I I、Nhe Nhe I I以

12、及以及Spe Spe I I切割切割的的DNADNA序列不同，但均給出相同的序列不同，但均給出相同的“CTAG”CTAG”粘粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割。能再切割。同尾酶：同尾酶：4) 限制性核酸內(nèi)切酶的命名法限制性核酸內(nèi)切酶的命名法v 用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母用屬名的頭一個(gè)字母和種名的頭兩個(gè)字母表示寄主菌的物種名稱，如表示寄主菌的物種名稱，如E. coli 用用Eco表表示，所以用斜體字。示，所以用斜體字。v 用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌用一個(gè)字母代表菌株或型，如流感嗜血菌（Haemophilus influe

13、nzae）d菌株，即菌株，即Hind。如果一種特殊的寄主菌株，具有幾。如果一種特殊的寄主菌株，具有幾個(gè)不同的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表個(gè)不同的限制與修飾體，則以羅馬數(shù)字表示，如示，如Hind, Hind，Hind 等。等。5) 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素(1) DNA的純度；的純度；(2) DNA的甲基化程度；的甲基化程度；(3) 酶切消化反應(yīng)的溫度；酶切消化反應(yīng)的溫度；(4) DNA的分子結(jié)構(gòu)；的分子結(jié)構(gòu)；(5) 溶液中離子濃度及種類；溶液中離子濃度及種類；(6) 緩沖液的緩沖液的 pH值。值。其他重要工具酶1、T4 DNA連接酶催化DNA5磷酸基與3羥基之間形成磷酸二酯鍵用于DNA片段的連接需要Mg2+和ATP2、DNA 聚合酶I 大片段（Klenow酶）用于粘性末端缺口補(bǔ)平3、逆轉(zhuǎn)錄酶從信使RNA得到cDNA（Complementary DNA），以cDNA作為模板做PCR-RT-PCR4、堿性磷酸酶去