1、1、 組織總RNA勺提取相關(guān)試劑：Trizol;氯仿；苯酚；異丙醇；75%L酉RNase-free水相關(guān)儀器：制冰機；液氮馴缽/生物樣品研磨儀；高速離心機；移液器（1ml、200U、100pl/50M）;渦旋振蕩儀；恒溫金屬浴。相關(guān)耗材：解剖工具，冰盒，離心管，離心管架，吸頭（1ml,200山300）,一次性手套，實驗手套。實驗步驟1 .取暫養(yǎng)草魚，冰上放置一段時間，然后解剖，剪取腸道50700mg放入研缽中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml預(yù)冷TRIzol試劑，充分研磨至無顆粒物存在。2 .轉(zhuǎn)移到離心管中，室溫放置5min,使細胞充分裂解；3 .按1mlTrizol加入200d氯仿，蓋上蓋子

2、，迅速充分搖勻15s,然后室溫放置3min；4 .4C,12000g離心15min；此時混合物分為三層，下層紅色的苯酚氯仿層，中間層和上層無色水相；RNA存在于無色水相中；5 .小心吸取上清液，千萬不要吸取中間界面，否則有DNA污染；轉(zhuǎn)移至一個新的離心管，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻；6 .室溫放置10min;4C,12000g離心10min;7 .棄上清，加入1ml75%乙醇洗滌；渦旋，懸浮沉淀；4C,12000g離心5min;8 .棄上清；可以再次用75叱醇洗滌沉淀；9 .棄上清；用移液器輕輕吸取管壁或管底的殘余乙醇，注意不要吸取沉淀；室溫放置5min晾干沉淀；（RNA羊品不要過于干燥，否

3、則極難溶解）10 .沉淀中加入30MRNase-free水，輕彈管壁，使RNA解。RN順量檢測相關(guān)試劑：澳酚藍，TEB/TAE電泳緩沖液，澳乙錠（EB）相關(guān)儀器：（超微量分光光度計，移液器（2.5口或2M規(guī)格，10J規(guī)格），電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，制冰機）相關(guān)耗材：（無菌無絨紙，吸頭，離心管架，PCRt,PCRt架，錐形瓶，燒杯，一次性手套，實驗手套，冰盒）（1）RNA屯度的檢測：測定其Od。和OD80的值，根據(jù)其OD60/OD80的比值，當(dāng)其比值在1.92.1之間，說明提取的總RNA純度比較高，沒有蛋白質(zhì)和基因組的污染。（2） RNA整性的檢測：取2RNA,與2M澳酚藍

4、混勻，用1%勺瓊脂糖進行凝膠電泳，20min后，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察效果。當(dāng)28S與18S條帶清晰，且亮度比大約是2:1時，5s條帶若隱若現(xiàn)，而且沒有其它條帶時，說明完整性不錯，可以用于下游逆轉(zhuǎn)錄實驗。2、 逆轉(zhuǎn)錄（RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA相關(guān)儀器：（PCRZ/恒溫金屬浴，移液器（2.5U或2d規(guī)格，10d規(guī)格），100M冰盒，制冰機，PCRt）根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TOYOB公司）說明書進行，反應(yīng)體系及條件如下：試劑使用量(U)RnaseFreeH2O11.75-YOligo(dT)1TotalRNA(1000ng)YTotalVolume12.7565C,5min后，立即置于冰上。loij使用量(

5、M)上一步變性后RNA液12.755xRTBuffer4dNTPMixture(各10mM2RnaseInhibitor(10U/)0.25ReverTraAce1TotalVolume20然后放置于PCR儀上，反應(yīng)程序為：42C,60min;99C,5min;16C,5min。所得cDN順置于-20C保存。3、 PC網(wǎng)應(yīng)相關(guān)儀器：（PCRZ/恒溫金屬浴，移液器（2.5d或2d規(guī)格，10U規(guī)格），100M電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機）試劑使用量（U）ddH2O6.0反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1.010xPCRBuffer1.0dNTP(10mmol/l)0.2Taq酶(1U/M)

6、0.4Ghrelin-F110pmol/l)0.4Ghrelin-R110pmol/l)0.4MgCb(25mmol/l)0.6TotalVolume10反應(yīng)條件：95C,預(yù)變性3min；94c變性30s,55c退火30s,72c延伸45s,共35個循環(huán);72c延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5dPCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。4、 PCFT物的分離，回收和純化相關(guān)試劑：膠回收試劑盒相關(guān)儀器：(紫外照膠儀，移液器(200U,1ml規(guī)格)，離心機，恒溫金屬浴，渦旋混勻儀，制冰機，超微量分光光度計)相關(guān)耗材：(切膠刀片，吸頭，離心管架)PC甌應(yīng)得到目的條帶后，加大反應(yīng)體積，然后根據(jù)膠回收試劑盒說

7、明書進行目的片段的回收純化。將所得DNAC存于-20C。5、 目的片段與載體的連接相關(guān)儀器：(恒溫金屬浴，移液器(10M,2.54規(guī)格)渦旋混勻儀，制冰機)按照連接試劑盒(TAKARA公司)說明書進行操作。pMD-18T載體1JDNA2dddH2O2d然后加入5mLigationMix,4C/16c放置過夜連接。6、 轉(zhuǎn)化相關(guān)儀器：(超凈工作臺，離心機，包溫培養(yǎng)箱，恒溫搖床，恒溫金屬浴/水浴鍋，移液器(1000d,100d,10pl,2.5U規(guī)格)渦旋混勻儀，制冰機)CaCl2法制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞全過程冰上進行，4c離心，無菌操作。(1)以接種環(huán)從-80C保存的高效轉(zhuǎn)化菌種蘸取少量

8、菌液劃無抗生素平板，培養(yǎng)12h;(2)挑取單菌落接種于1ml無抗生素LB培養(yǎng)基中，37c劇烈震蕩培養(yǎng)6h;(3)按1:100接種菌液于25mlLB液體培養(yǎng)基中，37c震蕩培養(yǎng)1.52h,至ODb。達0.40.6;(這一步非常關(guān)鍵，培養(yǎng)過度的菌液含有較多的“老”細胞，制備成感受態(tài)細胞后其接受外援DNA勺能力較低，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率降低)(4)冰上預(yù)冷10min；然后4C,6000rpm離心10min;(6)棄上清，將細菌沉淀重新懸浮于25ml預(yù)冷的0.1MCaCl2中，冰浴20min；(7) 4C,6000rpm離心10min,棄盡上清；(8)以1.25ml(菌液體積的5%預(yù)冷的0.1MCaCl2溶

9、液重懸細菌沉淀，同時加入0.3ml預(yù)冷的100卻油(甘油終濃度達1520%),混勻后按每支100d在冰上分裝。-80C保存?zhèn)溆?。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞(1)將10U連接產(chǎn)物加入100d感受態(tài)菌液中，冰上放置30min;(2)然后放到42c水浴鍋中熱激90s,再在冰上放置3min；(3)加入890MLB液體培養(yǎng)基，37c震蕩培養(yǎng)60min;(4)每個培養(yǎng)平板中加入40/X-gal和4川PTG,然后吸取100d菌液，均勻涂布于含Amp的LB固體培養(yǎng)基平板上；(5) 37c培養(yǎng)箱中正放1h,待菌液被瓊脂完全吸干后，倒置平板，過夜培養(yǎng)16h。(培養(yǎng)時間不宜過長，否則有衛(wèi)星菌落產(chǎn)生)7、 菌液PCR僉

10、測相關(guān)儀器：(PCROZ/恒溫金屬浴，渦旋混勻儀，移液器(10規(guī)格，1000M規(guī)格)，100U電子天平，電泳儀，電泳槽，凝膠成像儀，微波爐，冰盒，制冰機)在平板上挑取1020個白色菌落，加入含有1mlAmp+LB夜體培養(yǎng)基的1.5ml離心管中，37c震蕩培養(yǎng)6ho3000rpm離心3min后吸掉上層400M上清液，短暫渦旋將沉淀打散，然后把菌液當(dāng)成模板，按上面PCR方法進行擴增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測是否含有目的條帶。挑選擴增出正確目的條帶的菌液送公司測序。附注：主要溶液和培養(yǎng)基的配制1)電泳緩沖液10XTBE:108gTris堿，55g硼酸，20ml0.5M的EDTA加入蒸儲水混勻后定容至

11、1000ml,調(diào)節(jié)pH為8.0;2) LB液體培養(yǎng)基：蛋白月東10g,酵母提取物5g,NaCl10g;加800ml去離子水，用10MNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,定容至1000ml,高壓(1.034X100000Pa)滅菌20min,4c保存；3) LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉至終濃度為1.5%,高溫、高壓滅菌20min后降溫至5060C,在無菌狀態(tài)下鋪制平板，室溫放置過夜后，置于4c保存；4)氨茉青霉素貯存液：用無菌雙蒸水配成100mg/ml,分裝，-20C保存。使用時終濃度為100ug/ml。5)用于制備感受態(tài)細胞的CaCl2(0.1mol/l)：稱取0.56gCaCl2(無水

12、，分析純)，溶解于50ml雙蒸水中，定容至100ml,高壓滅菌；6) X-gal(20mg/ml)的配制：將20mgX-gal溶于1ml二甲基甲酰胺中，-20C避光保存；7) IPTG(200mg/ml)的配制：將0.2gIPTG溶于1ml去離子雙蒸水中，0.22g濾膜除菌，-20C保存?zhèn)溆茫?RACE(dT)17-接頭引物：5GACTCGAGTCGACATCGA(T3接頭引物：5GACTCGAGTCGACATCG31.cDNA勺合成DEPCK9.75dOligodT接頭引物1dTotalRNA2d(1000ng)65C,5min；立即置于冰上第一步變性后的RNA容液12.7545XRTBuf

13、fer4ddNTPMixture(各10mM2dRnaseInhibitor(40UZJ)0.25dReverTraAce1d總體積204反應(yīng)條件：42C,60min;99c,5min;16C,5min。2.cDNA勺純化利用膠回收試劑盒進行（去除多余的dNTPW弓|物）。最后使用20dTE洗脫沉淀。3.第一輪PCRcDNA1d10XBuffer1ddNTP(10mmol/L)0.2dOligodT接頭引物(10gol/L)0.4d3RAC的卜弓1物（10叩ol/L）0.4dTaq酶(1U/山0.4dMgC2(25mmol/L)0.6dddHO6.0d反應(yīng)條件：降落PCRPCR產(chǎn)物稀釋10倍作

14、為模板進行下游實驗4.第二輪PCRcDNA1M10XBuffer1MdNTP(10mmol/L)0.2M接頭引物（10gol/L）0.4M3RAC時弓1物(10叩ol/L)0.4MTaq酶(1U/山0.4MMgC2(25mmol/L)0.6MddH2O6.0M反應(yīng)條件：降落PCR5RACE1.cDNA勺合成DEPCK9.75M基因特異性反義引物1MTotalRNA2M(1000ng)65C,5min；立即置于冰上第一步變性后的RNA容液12.75J5XRTBuffer4MdNTPMixture(各10mM2MRnaseInhibitor(40UZJ)0.25MReverTraAce1M總體積20d反應(yīng)條件：42C,60min;99c,5min;16C,5min。2.cDNA勺純化利用膠回收試劑盒進行（去除多余的dNTPW弓|物）。最后使用20dTE洗脫沉淀。3.cDNA勺加尾純化后的cDNA5.7d5乂末端轉(zhuǎn)移酶緩沖液2d1mmolZldATP2d末端轉(zhuǎn)移酶（30UZ4）0.3d總體積104反應(yīng)條件：37C,60min；70C,10min。反應(yīng)結(jié)束，把cDNA釋1倍作模板進行下游實驗。4.第一輪PCRcDNA1pl10XBuffer1pldNTP(10mmol/L)0.2plOligodT接頭引物(10gol/L