1、 教學(xué)實(shí)習(xí)總結(jié)山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 專 業(yè) 動(dòng)物檢疫 年 級(jí) 班 級(jí) 姓 名 學(xué) 號(hào) 指導(dǎo)教師 趙宇軍 職 稱 副教授 動(dòng)物病原微生物實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)實(shí)習(xí)總結(jié) 實(shí)習(xí)時(shí)間：2012年5月8日至8月13日 實(shí)習(xí)地點(diǎn)：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 指導(dǎo)老師：趙宇軍 實(shí)習(xí)內(nèi)容：時(shí)間過的很快 ，轉(zhuǎn)眼間三年的大學(xué)生活就結(jié)束了，我們動(dòng)物檢疫專業(yè)的同學(xué)從五月份開始了為期3個(gè)多月的教學(xué)實(shí)習(xí)，在眾多輔導(dǎo)老師之中，我有幸跟隨我校動(dòng)物科技學(xué)院預(yù)防系的趙宇軍教授進(jìn)行學(xué)習(xí)。實(shí)習(xí)地點(diǎn)為我校獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室。實(shí)習(xí)內(nèi)容自行選擇。在老師的帶領(lǐng)下我進(jìn)行了大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和食物中金黃葡萄球菌的檢驗(yàn)。下面我們來回顧這次實(shí)驗(yàn)。大腸

2、桿菌的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)一、培養(yǎng)基配置我們一般用LB液體培養(yǎng)基來擴(kuò)大培養(yǎng)大腸桿菌，培養(yǎng)后可在LB固體培養(yǎng)基上劃線分離。以下為本實(shí)驗(yàn)中培養(yǎng)基配置步驟：1稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化鈉0.5g，加水50ml。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加1g瓊脂。2溶化：加熱熔化，用蒸餾水定容到50mL。配置LB固體培養(yǎng)基時(shí)還需加瓊脂，整個(gè)過程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。3調(diào)pH：用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。4滅菌：在兩個(gè)250ml的三角瓶中分別裝入50ml LB液體培養(yǎng)基和50ml LB固體培養(yǎng)基，加上棉塞。將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好，放入滅菌鍋內(nèi)，1k

3、g壓力滅菌15min。5倒平板：滅菌后，待固體培養(yǎng)基冷卻至60左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過程是：將滅過菌的培養(yǎng)皿放在火焰旁，右手拿裝有培養(yǎng)基的三角瓶，左手拔出棉塞；右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通過火焰；用左手將培養(yǎng)皿打開一條稍大于三角瓶口的縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋；待平板冷卻凝固后，將平板倒過來放置。二、滅菌和消毒1無菌技術(shù)：對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行清潔和消毒；將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行滅菌；為避免周圍微生物污染，實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在酒精燈火焰旁進(jìn)行；避免已滅菌處理的材料用具與周圍的物品相接觸。2消毒方法：日常生活經(jīng)常用到的是煮沸消毒法；對(duì)一些不耐

4、高溫的液體，則使用巴氏消毒法；對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑石炭酸或煤酚皂等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用紫外線進(jìn)行物理消毒；實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用酒精進(jìn)行消毒。3滅菌方法：接種環(huán)、接種針、試管口等使用灼燒滅菌法；培養(yǎng)基、無菌水等使用高壓蒸汽滅菌法，所用器械是高壓蒸汽滅菌鍋；表面滅菌和空氣滅菌等使用紫外線滅菌法，所用器械是紫外燈。三、細(xì)菌的分離采用劃線分離法，其操作步驟是：將培養(yǎng)皿底部用拇指和無名指固定成傾斜狀態(tài)，在火焰旁將培養(yǎng)皿稍微打開。在此同時(shí)，用環(huán)狀接種針在火焰旁取少許菌懸液，迅速送入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板培養(yǎng)基的一邊，作第1次平行劃線 35條，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約70°角，用燒過冷卻的接

5、種針，通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，然后再用同樣方法，通過第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線時(shí)，接種針應(yīng)與平板表面成30°角左右。不要使接種針碰到培養(yǎng)皿邊緣，也不要將培養(yǎng)基劃破。劃線完畢后，蓋上皿蓋，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。四、菌落和菌種種類的辨認(rèn)細(xì)菌的菌落表面一般是光滑而濕潤的，有黏稠性，多數(shù)透明或半透明，但也有細(xì)菌的菌落表面是干燥、有褶皺的；放線菌由于有纖細(xì)的菌絲并可產(chǎn)生孢子，所以菌落表面是緊密的絨狀、堅(jiān)實(shí)多皺，長孢子后就成粉末狀，由于菌絲和孢子有多種色素，所以在菌落培養(yǎng)基底部和菌落表面都有不同的顏色，菌落不易用接種環(huán)挑動(dòng)；酵母菌落類

6、似于細(xì)菌菌落，表面光滑而濕潤，有黏稠性但大多呈乳白色，少數(shù)呈紅色。 食品中金黃葡萄球菌的檢測(cè)方法 金黃色葡萄球菌是一種引起人類和動(dòng)物化膿感染的重要致病菌，也是造成人類食物中毒的常見致病菌之一。本菌廣泛分布于自然界，如空氣、土壤、水及其它環(huán)境中。在人類和動(dòng)物的皮膚及外界相通的腔道中，也經(jīng)常有本菌存在。據(jù)報(bào)導(dǎo)，在正常人群中的帶菌率可達(dá)30%80%，其中皮膚帶菌率為822%，鼻腔和咽喉部等上呼吸道的帶菌率在4050%以上，因此其可通過各種途徑和方式，尤其是經(jīng)工作人員的手和上呼吸道而污染食品。由于致病金黃葡萄球菌能產(chǎn)生腸毒素，故一旦細(xì)菌污染食品，并在合適的溫度環(huán)境下，細(xì)菌可以大量繁殖并產(chǎn)生腸毒素，從而

7、引起消費(fèi)者食物中毒。 我國對(duì)金黃色葡萄球菌目前采用的方法是以國家標(biāo)準(zhǔn)GB.4789-10-84及檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN.0172-92作為依據(jù)。整個(gè)檢測(cè)過程獲得最終結(jié)果須時(shí)5天左右，既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，并造成貨物積壓，也影響貨物的及時(shí)出運(yùn)，并使貨主的倉儲(chǔ)成本提高，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。 多年來很多食品微生物實(shí)驗(yàn)室都在探索和尋找一些準(zhǔn)確性高，并快速的檢測(cè)方法，最近我們分別從美國3M公司和法國生物梅里埃公司獲得兩種快速檢測(cè)致病性金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基，其名稱為： Petrifilm RSA. Count Plate（由美國3M公司研制生產(chǎn)），是一種薄膜型快速檢測(cè)金黃色葡萄球菌的計(jì)數(shù)平板。 Baird-p

8、arker + RPF Agar.（由法國生物梅里埃公司研制生產(chǎn)的用Baird-Parker瓊脂加免血漿纖維蛋白原的金黃色葡萄球菌檢測(cè)計(jì)數(shù)平板）。 一、實(shí)驗(yàn)原理 Petrifilm. RSA. 測(cè)試薄膜是由二部分組成。第一部分是由黃金色葡萄球菌培養(yǎng)基片，此培養(yǎng)基中含有經(jīng)修正的Barid-Parker，營養(yǎng)成分加上以冷水可溶解的膠質(zhì)。第二部分是一種耐熱核酸酶（TNase）反應(yīng)片，含有DNA及甲苯胺蘭 ( Toluidine Blue - O )及四唑指示劑 (Tetraeolium)。此指示劑有助于菌落的計(jì)數(shù)及確定葡萄球菌耐熱核酸酶的存在。 耐熱去氧核糖核酸（deoxyribonulcas Dn

9、ase）為產(chǎn)毒金葡菌之典型特征，此酶非常耐熱，在100加熱30min，不易喪失活性，在130之下，其D值為16.6min，此酶之分子量為16800，等電點(diǎn)PH為9.6,耐熱去氧核糖酸與檢測(cè)血漿凝固酶相似，是一種鑒定金黃色葡萄球菌的方法，在Petrifilm. RSA 檢測(cè)片上，耐熱DNA酶反應(yīng)看起來，呈粉紅色環(huán)帶包圍著一個(gè)紅色或蘭色的菌落。 Petrifilm.RSA檢測(cè)片，必須與Peyrifilm耐熱核酸酶反應(yīng)片一起使用，單獨(dú)使用將不會(huì)顯示菌落，因?yàn)榫哂休o助計(jì)數(shù)菌落的指示劑是在反應(yīng)片上，而不是在Petrifilm.RSA檢測(cè)片上。 Baird-parker + RPF agar，這一培養(yǎng)基中

10、含有豐富的營養(yǎng)成分，其中以氯化鋰代替亞碲酸鉀，使菌落顏色呈黑色，RPF補(bǔ)充有兔血漿和牛纖維蛋白原，以便檢測(cè)凝固酶活力，胰酶可以抑制全部或部分圍繞凝固酶陽性菌落周圍沉淀暈環(huán)纖維蛋白的溶解，因此凡存在血漿凝固酶陽性的金黃色葡萄球菌，將在培養(yǎng)基中呈現(xiàn)有暈環(huán)的黑色菌落，即可確認(rèn)，并作計(jì)數(shù)。 二、實(shí)驗(yàn)步驟 材料和方法： 本次實(shí)驗(yàn)采用以下3種試劑： 1. 美國3M公司提供的Petrifilm. Rapid. S. aureus Count Plate. 2. 法國生物梅里埃公司提供的Baird-Parker + RPF agar . 3. 實(shí)驗(yàn)室自配Baird-Park瓊脂（英國Oxoid）及新鮮兔血漿。

11、 菌種來自美國菌種保存中心（America TyP Culture Collection）。金黃色葡萄球菌共10株菌株，其菌號(hào)分別為： ATCC 27661 ATCC 27664 ATCC 13565 ATCC 51704 ATCC(K) 12600 ATCC(R) 65389 ATCC 25923 ATCC 29213 ATCC 8095 ATCC 12598 非金黃色葡萄球菌菌種5株，其菌號(hào)分別為： ATCC 51813 （大腸桿菌）、ATCC 624 （無乳鏈球菌）、ATCC 51816 （陰溝腸桿菌）、ATCC 6051 （枯草桿菌）、ATCC 49214 （腸炎沙門氏菌）、自然食品檢

12、樣，任意購自市場(chǎng)。 本次實(shí)驗(yàn)是以同一測(cè)試樣品經(jīng)均質(zhì)并通過無菌生理鹽水作10倍遞增稀釋后取1至2個(gè)稀釋度同時(shí)接種上述三種培養(yǎng)基作平行實(shí)驗(yàn)，在取得最終結(jié)果后相互進(jìn)行比對(duì)。 上述三種培養(yǎng)基的接種方法是按生產(chǎn)商所提供的使用說明進(jìn)行操作，另外Baird-Parker Agar 培養(yǎng)基是按SN0172-92標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作。 A、 本次實(shí)驗(yàn)共測(cè)試已知標(biāo)準(zhǔn)菌種共15株，其中葡萄球菌10株，其他菌種5株（包括大腸桿菌、陰溝腸桿菌、腸炎沙門氏菌、枯草桿菌和無乳鏈球菌）。 B、 測(cè)試自然食品檢樣共101只（其中包括肉11只、肉類14只、水產(chǎn)品17只、牛奶25只、蔬菜22只、豆制品12只）。 三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果： A、 被檢

13、菌種10株，金黃色葡萄球菌在三種培養(yǎng)基上都能檢出生長情況良好，同一稀釋度的菌液，除個(gè)別菌株外在3種培養(yǎng)基計(jì)數(shù)檢測(cè)結(jié)果基本都在一個(gè)數(shù)量級(jí)上，無顯著差異。而5株非金黃色葡萄球菌的菌株在三種培養(yǎng)基上全部不能生長。 B、 自然食品檢樣共接種101只，每一檢樣同一稀釋濃度分別同時(shí)種三種培養(yǎng)基，最終共檢出金黃色葡萄球菌45只，占全部檢樣的44.5，其中Petrifilm RSA 檢出陽性結(jié)果為42只，占全部陽性檢樣的93.3，Baird-ParkerRPF Agar. 檢出陽性結(jié)果26只，占全部陽性檢樣的57.7。Baird-Parker. Agar 檢出陽性結(jié)果32只，占全部陽性檢樣的71.1。 四、實(shí)

14、驗(yàn)討論 1. 用15株標(biāo)準(zhǔn)菌在3種培養(yǎng)基中的檢測(cè)，10株金黃色葡萄球菌以同一濃度接種，結(jié)果生長良好，其最終計(jì)數(shù)基本一致，定位在同一數(shù)量級(jí)，5株非金黃色葡萄球菌接種上述三種培養(yǎng)基全部不長，說明上述三種培養(yǎng)基對(duì)金黃色葡萄球菌選擇良好。 2. 以101只自然樣品同一均質(zhì)稀釋液，同時(shí)接種三種培養(yǎng)基，從最終結(jié)果來看，對(duì)金黃色葡萄球菌的陽性檢出率為44.5 3. 從檢測(cè)程序來年，Petrifilm. RSA及Baird-ParkerRPF. Agar. 都在樣品接種后2830h觀察結(jié)果，并不必再做證實(shí)試驗(yàn)，而如以Baird-Parker Agar檢測(cè)，須在接種后48h觀察平板，并挑取可疑菌落轉(zhuǎn)種到營養(yǎng)肉湯

15、中，在經(jīng)18-24h后做血漿凝固酶或耐熱DNA酶試驗(yàn)進(jìn)行證實(shí)，最終計(jì)數(shù)，前后約須80h。 4. 從本次試驗(yàn)中觀察，使用上述三種培養(yǎng)基對(duì)食品中金黃色葡萄球菌含量的直接計(jì)數(shù)檢測(cè)，其樣品接種液的含量擬控制在100個(gè)/ml以內(nèi)，比較容易分清并計(jì)數(shù)，如菌量過濃，則將會(huì)影響最后的讀數(shù)，因此對(duì)新送的被檢樣品，如在不了解污染的情況下一般必須要做2個(gè)以上的稀釋度，同時(shí)分別接種，才能獲得較為滿意的結(jié)果。 而在Baird-ParkerRPF Agar及Baird-Parker. Agar接種時(shí)必須將1ml樣液作三只平板涂布（0.3、0.3、0.4ml）這樣就會(huì)造成手續(xù)繁瑣試劑消耗較大，但Baird-Parker.

16、RPF. 培養(yǎng)基也可以1ml樣液作傾注培養(yǎng)，并作計(jì)數(shù)。 5. 在整個(gè)測(cè)試過程中，我們發(fā)現(xiàn)，按使用說明對(duì)Petrifilm. RSA. 及Barid-ParkerRPF. Agar，操作規(guī)定在接種24h后觀察結(jié)果，此時(shí)往往由于菌落長得經(jīng)較小，特征瓜不明顯，但如果繼續(xù)放置一夜以后金葡萄菌落特征明顯，并可能會(huì)經(jīng)第一天觀察數(shù)量有所增加，這樣可以提高檢測(cè)結(jié)果的可信度。 6. 由于對(duì)上述兩種培養(yǎng)基的試用期間我們尚未獲得供應(yīng)商的報(bào)價(jià)，故無法測(cè)算每一樣品的測(cè)試成本價(jià)格。但可以予計(jì)上述兩面種快速檢測(cè)培養(yǎng)基的耗材費(fèi)用要高于常規(guī)經(jīng)典方法（Baird-Parker Agar）的費(fèi)用。 7. 通過本次實(shí)驗(yàn)，我們感到使用美國3M公司生產(chǎn)的Petrifilm. RSA Plate培養(yǎng)基和法國生物梅利埃公司生產(chǎn)的Baird-Parker RPF. Agar培養(yǎng)基檢測(cè)中的金黃色葡萄球菌?？梢员饶壳俺Ｒ?guī)檢測(cè)方法時(shí)間可縮短一半。并可以明顯節(jié)省大量人力。這完全符合實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)的要求，尤其是對(duì)基層較簡陋的實(shí)驗(yàn)室條件中，更顯其使用方便的優(yōu)越性。實(shí)習(xí)總結(jié)：通過這次嚴(yán)謹(jǐn)而有序的實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)，為我們先前在教學(xué)中學(xué)習(xí)到的知識(shí)提供了一個(gè)實(shí)際