1、常規(guī)試劑配制和測(cè)定方法一、 溶液的配制1. Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽溶液（1000 mL）名 稱(chēng)重 量（g）硫酸銨（(NH4)2SO4）14磷酸二氫鉀（KH2PO4）20尿素 （H2NCONH2）3硫酸鎂（MgSO4·7H2O）3氯化鈣（CaCl2·2H2O） 4注：用煮沸10 min后的蒸餾水配制。2. Mandels微量元素溶液（1000 mL）名 稱(chēng)重 量（g）氯化鈷（CoCl2·6H2O）3.7硫酸鋅（ZnSO4·7H2O）1.4硫酸錳（MnSO4·H2O）1.6硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）5.0注：用煮沸10 min后的蒸餾

2、水配制。3. DNS試劑的配制（1000 mL）（1） ?。?,5-二硝基水楊酸 （C7H4N2O7） 7.5 g氫氧化鈉 （NaOH ） 14.0 g 充分溶解于1000 mL 水中（水預(yù)先煮沸10 min）（2） 加入：酒石酸鉀鈉 （C4H4O6KNa·4H2O） 216.0 g 苯酚（在50 水浴中融化） 5.5 mL 偏重亞硫酸鈉 （Na2S2O5） 6.0 g（3） 充分溶解后盛于棕色瓶中，放置5天后便可使用，平時(shí)盛一小瓶(250 mL)使用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。注意：倒入瓶中時(shí)要盡量裝滿！4. 考馬斯亮藍(lán)G-250的配制（1000 mL）稱(chēng)考馬斯亮藍(lán)G-

3、250 100 mg即0.1g溶于50 mL 95%乙醇中，加入100 mL 85 %磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL ，濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01 %（w/v）考馬斯亮藍(lán)G-250，4.7 %（w/v）乙醇，8.5 %（w/v）磷酸。5. 1.0 M檸檬酸緩沖溶液的配制（1000 mL）名 稱(chēng)分 子 量Mn重 量(g)檸檬酸（C6H8O7·H2O）210210NaOH4074.5 準(zhǔn)確稱(chēng)取檸檬酸210 g，溶于約750 mL煮沸（10 min）蒸餾水中，待檸檬酸充分溶解后加入氫氧化鈉74.5 g，完全溶解后將上述溶液轉(zhuǎn)移到1000 mL容量瓶中，冷卻后將容量瓶定容到1000

4、mL（原始pH4.45）。（檢驗(yàn)方法：取1.0 M檸檬酸緩沖溶液稀釋20倍，測(cè)定稀釋液的pH值，pH值應(yīng)為4.8）6. 標(biāo)準(zhǔn)糖溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)方程的測(cè)定（1） 標(biāo)準(zhǔn)糖溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取2.000 g葡萄糖/木糖（葡萄糖/木糖需105 烘干3 h），蒸餾水溶解，全部轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，配制成2 g/L葡萄糖/木糖溶液。取9個(gè)100 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分別吸取2 g/L葡萄糖/木糖溶液10 mL、20 mL、30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL、80 mL、90 mL依次加入容量瓶，蒸餾水定容，搖勻。即為0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L

5、、0.8 g/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取6個(gè)30 mL容量瓶、1支20 mL刻度吸管，分別吸取2 g/L葡萄糖溶液10 mL、12 mL、14 mL、16 mL、18 mL、20 mL依次加入容量瓶，每瓶再加入1.5 mL檸檬酸緩沖液，蒸餾水定容，搖勻。即為1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖。（2） 標(biāo)準(zhǔn)方程的測(cè)定： 葡萄糖/木糖標(biāo)準(zhǔn)方程的測(cè)定取10支25mL刻度管，10支1mL刻度吸管，分別加入0.2 g/L、0.4 g/L、0.6 g/L、0.8 g

6、/L、1.0 g/L、1.2 g/L、1.4 g/L、1.6 g/L、1.8 g/L、2.0 g/L葡萄糖/木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，DNS溶液3 mL。100 煮沸5 min，水浴冷卻后定容至25 mL，搖勻。以蒸餾水作為空白對(duì)照，550 nm測(cè)定吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。（7230型分光光度計(jì)輸出方程為：A = MC + N，723型分光光度計(jì)輸出方程為：C = KA + B） 酶解木糖標(biāo)準(zhǔn)方程測(cè)定（測(cè)定木聚糖酶活力）取6支25 mL刻度管，6支2 mL刻度吸管，分別加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL，

7、DNS溶液3 mL，100 煮沸5 min，水浴冷卻后定容至25 mL，搖勻。以蒸餾水作為空白對(duì)照，550 nm測(cè)定吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。（7230型分光光度計(jì)輸出方程為：A = MC + N，723型分光光度計(jì)輸出方程為：C = KA + B） 酶解葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)方程測(cè)定（測(cè)定濾紙酶活力、CMC酶活力）取6支小試管，6支2 mL刻度吸管，分別加入1.0 g、1.2 g、1.4 g、1.6 g、1.8 g、2.0 g酶解葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.5 mL，DNS溶液3 mL，100 煮沸5 min，水浴冷卻后，量筒定容至50 mL（定容至25 mL，測(cè)定CMC酶活力），搖勻。以

8、蒸餾水作為空白對(duì)照，550 nm測(cè)定吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。（7230型分光光度計(jì)輸出方程為：A = MC + N，723型分光光度計(jì)輸出方程為：C = KA + B）7. 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的配制pH0.1 mol/L檸檬酸/mL0.2 mol/L磷酸氫二鈉/mLpH0.1 mol/L檸檬酸/mL0.2 mol/L磷酸氫二鈉/mL2.219.600.405.29.2810.722.418.761.245.48.8511.152.617.822.185.68.4011.602.816.833.175.87.9112.093.015.894.116.07.3712

9、.633.215.064.946.26.7813.223.414.305.706.46.1513.853.613.566.446.65.4514.553.812.907.106.84.5515.454.012.297.717.03.5316.474.211.728.287.22.6117.394.411.188.827.41.8318.174.610.659.357.61.2718.734.810.149.867.80.8519.155.09.7010.308.00.5519.45注：Na2HPO4，Mr =141.98；0.2 mol/L溶液為28.40 g/LNa2HPO4·2H

10、2O，Mr =178.05；0.2 mol/L溶液為35.61 g/LC6H8O7·H2O，Mr =210.14；0.1 mol/L溶液為21.01 g/L二、 酶活力的測(cè)定1. 濾紙酶活力的測(cè)定纖維素酶的總體酶活力采用國(guó)際理論和應(yīng)用化學(xué)協(xié)會(huì)（IUPAC）推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定Ghose,T.K., et al,Pure & Appl.Chem.,1987,59,257-268，一個(gè)濾紙酶活力的國(guó)際單位（FPIU）等于在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下每分鐘生成1 mol葡萄糖量的酶量。測(cè)定方法如下：取7支試管在其中1#-5#支小試管中加入50 mg卷成筒狀的濾紙條（1 × 6cm），適

11、當(dāng)稀釋酶液，取7支試管按下表操作。（5#有底物無(wú)酶，6#為有酶無(wú)底物空白對(duì)照）項(xiàng) 目1#2#3#4#5#6#7#稀釋酶液（mL）0.20.30.40.500.5酶解葡萄糖標(biāo)樣1.5mL0.05 M檸檬酸緩沖液（mL）1.31.21.11.01.51將上述試管蓋上塑料布，用橡皮筋扎緊后置于恒溫水浴器中，保持在振幅80和溫度50 下保溫60 min后立即取出加入3 mL DNS試劑，在沸水中反應(yīng)5 min，冷卻后加水至50 mL并充分搖勻，待濾紙完全沉淀后，取上層清液于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值。反應(yīng)生成的葡萄糖的量根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖

12、的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，酶量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，從圖中找出生成2 mg葡萄糖的酶量，按下式計(jì)算樣品的濾紙酶活力（FPA）：濾紙酶活力 = 2 mg葡萄糖 60min×0.18(mg/mol)×生成2mg葡萄糖的酶量（mL）一個(gè)濾紙酶活力單位定義為每分鐘生成1mol葡萄糖所需的酶量，單位：IU/mL。備注：當(dāng)加入0.5 mL酶液（指酶液沒(méi)有被稀釋的時(shí)候?。┤詿o(wú)法生成2 mg葡萄糖時(shí)，按下式計(jì)算：濾紙酶活 = 0.185 ×（葡萄糖mg數(shù)）2. -葡萄糖苷酶活力的測(cè)定方法一：葡萄糖氧化酶測(cè)定法按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定Ghose,T.K.,etal,Pure & Appl.

13、Chem.,1987,59,257-268。一個(gè)-葡萄糖苷酶活力國(guó)際單位(IU/mL)等于標(biāo)準(zhǔn)條件下每分鐘轉(zhuǎn)化1 mol底物即生成2 mol葡萄糖的酶量來(lái)表示。預(yù)先用0.05 M的檸檬酸緩沖液配制15 mmol/L的纖維二糖溶液（0.513 g纖維二糖/100 mL0.05 M的檸檬酸緩沖液，現(xiàn)配現(xiàn)用） （1） 每個(gè)樣品應(yīng)做三個(gè)不同酶量估計(jì)-葡萄糖苷酶活力（IU/mL）< 0.10.10.20.3取酶液量（mL）0.5/0.8/1.00.3/0.5/0.80.2/0.3/0.50.1/0.2/0.3（2） 加料：試管中加入酶液、緩沖液和纖維二糖溶液如下：酶液量（mL）0.05 M檸檬酸緩

14、沖液（mL）纖維二糖溶液（mL）樣品適量1酶液1酶液空白110纖維二糖空白011每個(gè)試管共2mL，用塑料紙包扎好。注意：纖維二糖溶液必須用0.05M檸檬酸配制。（3） 酶解反應(yīng)：試管置于50 水浴中，保溫30分鐘，取出，沸水中放置5分鐘使酶失活，冷卻至室溫。（4） 加顯色劑（葡萄糖氧化酶測(cè)定試劑）：取試管中冷卻液30 µL，加入顯色劑3.0 mL，混勻；同時(shí)做一個(gè)葡萄糖標(biāo)樣：取1 g/L葡萄糖標(biāo)樣30 µL，加顯色劑3.0 mL，混勻；置于37 水浴中，保溫15分鐘，取出。（5） 測(cè)吸光度：505 nm，用蒸餾水調(diào)零，測(cè)各試管溶液吸光度A值。1g/L葡萄糖標(biāo)樣的吸光度為0.

15、7左右。（6） 計(jì)算產(chǎn)生的葡萄糖mg數(shù)： 樣 品 吸光度測(cè)得 酶 空 白 所含葡萄糖 = 2 × （mg） 纖維二糖空白 1g/L葡萄糖標(biāo)樣吸光度樣品實(shí)際產(chǎn)生的葡萄糖 = 測(cè)得葡萄糖mg纖維二糖空白葡萄糖mg酶空白葡萄糖mg × 酶液量mL （mg）注：纖維二糖空白所產(chǎn)生的響應(yīng)值，當(dāng)纖維二糖溶液為新鮮配制時(shí)，一般很低。（7） 作圖：以log(酶液量mL)為縱坐標(biāo)，實(shí)際產(chǎn)生的葡萄糖mg為橫坐標(biāo)作圖，求出生成1 mg葡萄糖時(shí)對(duì)應(yīng)的酶液量mL。（8） 計(jì)算-葡萄糖苷酶活力：0.0926-葡萄糖苷酶活力 = （IU/mL）生成1mg葡萄糖對(duì)應(yīng)的酶液量（mL）注：當(dāng)加入1mL酶液仍不

16、能生成1mg葡萄糖時(shí)，-葡萄糖苷酶活力 = 0.0926×（葡萄糖mg數(shù)） 補(bǔ)充：葡萄糖含量測(cè)定采用葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶終點(diǎn)比色法測(cè)定。葡萄糖測(cè)定試劑盒由上海榮盛生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，內(nèi)含R1（緩沖液）和R2（酶試劑），使用時(shí)將R1和R2等量混合。葡萄糖經(jīng)葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫，后者在過(guò)氧化物酶的作用下，將4-氨基安替比林與苯酚偶聯(lián)縮合成可被分光光度計(jì)測(cè)定的醌類(lèi)化合物。測(cè)定該有機(jī)化合物的吸光度便能計(jì)算出葡萄糖的含量。測(cè)定方法如下： 在測(cè)定管中加入30 µL待測(cè)試樣的稀釋液（空白管、標(biāo)準(zhǔn)管分別以蒸餾水及1g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液代替），每一試管中加入由R1和R

17、2等量混合的酶酚混合液3.0mL，將各試管分別搖勻，置于37水浴中保溫15min，冷卻至室溫后，在7230分光光度計(jì)上于505 nm下測(cè)定吸光度A值，用空白管校正吸光度到零點(diǎn)，葡萄糖含量按下式計(jì)算：測(cè)定管吸光度標(biāo)準(zhǔn)管吸光度葡萄糖含量（g/L）= × 稀釋倍數(shù)方法二： 采用pNPG（對(duì)硝基苯酚-D-葡萄糖苷）試劑測(cè)定（1） 試劑的配制 50 mmol/L , pH 4.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的配制（200 mL） 方法：0.1 mol/L檸檬酸 101.4 mL + 0.2 mol/L磷酸氫二鈉 98.6 mL 1 mol/L Na2CO3溶液（250 mL）稱(chēng)?。?6.5 g N

18、a2CO3溶解后定容至250 mL 5 mmol/L pNPG（分子量：301.25）溶液的配制（100 mL）稱(chēng)取0.1506 g pNPG，用50mmol/L，pH4.8檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液溶解后定容至100 mL。 （2） 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)方程的測(cè)定 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱(chēng)取0.0209 g 對(duì)硝基苯酚（分子量：139.11），蒸餾水溶解，全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶?jī)?nèi)，搖勻，配制成1.5 mmol/L對(duì)硝基苯酚溶液。取6個(gè)30 mL容量瓶，分別吸取1.5 mmol/L對(duì)硝基苯酚溶液1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL依次加入容量瓶，蒸餾水定容，搖勻。即

19、為0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L。 對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)方程的測(cè)定取6支15 mL刻度管、6支1 mL刻度吸管，分別加入0.05 mmol/L、0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、0.5 mmol/L對(duì)硝基苯酚溶液1.0mL，再加入2.0 mL 1 mol/L的 Na2CO3溶液和10 mL的蒸餾水，室溫放置5 min后，搖勻。以蒸餾水作為空白對(duì)照，在400 nm下測(cè)定吸光度A。以A為縱坐標(biāo)，C為橫坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。（3） 測(cè)定方法游離酶酶活力的

20、測(cè)定：0.1 mL適當(dāng)稀釋的酶液與0.9 mL 5 mmol/L pNPG溶液（分別預(yù)熱5分鐘）混合后，于50 下保溫10 min。 10 min后立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)后，再加入10 mL的蒸餾水，搖勻。 在400 nm下測(cè)定吸光度。以0.1 mL蒸餾水代替酶液作空白對(duì)照。（要做23個(gè)平行樣，取平均值）固定化酶酶活力的測(cè)定：將游離酶酶活的測(cè)定方法中0.1mL適當(dāng)稀釋的酶液用0.1mL蒸餾水和一定質(zhì)量的固定化酶來(lái)代替，其余步驟相同。（4） 酶活力的計(jì)算一個(gè)-葡萄糖苷酶酶活力單位定義為：每分鐘水解生成1 µmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量。計(jì)算公式如下：

21、 游離酶酶活力的計(jì)算： 生成對(duì)硝基苯酚的量（µmol） -葡萄糖苷酶酶活 = （IU/mL） 10 min×0.1 mL固定化酶活力的計(jì)算： 生成對(duì)硝基苯酚的量（µmol） -葡萄糖苷酶酶活 = （IU/g） 10 min × 稱(chēng)取固定化酶的質(zhì)量（g）3. 羧甲基纖維素（CMC）內(nèi)切葡聚糖酶活力（1） 在25 mL刻度試管中加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液和1.0 mL用0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配制的1 %（w/v）羧甲基纖維素懸浮液。（2） 蓋上塑料布，用橡皮筋扎緊后置于恒溫水浴器中，保持在振幅80和溫度50 下保溫30 min后立即取出加入3

22、mL DNS試劑，在100 沸水中煮沸5 min，冷卻到室溫后，加水定容至25 mL，充分搖勻后于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值。 （3） 反應(yīng)生成的葡萄糖的量根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線求得。按下式計(jì)算CMC酶活力：CMC酶活力 = 生成的葡萄糖的量（mg） 30min×0.18(mg/mol)×0.5mL一個(gè)CMC酶活力單位定義為每分鐘生成1mol葡萄糖所需的酶量，單位：IU/mL。4. 木聚糖酶活力的測(cè)定用0.05 mol/L檸檬酸緩沖液配制的1%（w/v）樺木木聚糖（Sigma公司制造）溶液。適當(dāng)稀釋酶液，取7支25 mL刻度試管按下表操作（5#有底物無(wú)酶、6#為有酶無(wú)底物

23、空白對(duì)照）。項(xiàng) 目1#2#3#4#5#6#7#稀釋酶液（mL）0.20.30.40.500.5酶解木糖標(biāo)樣1.5mL0.05M檸檬酸緩沖液（mL）0.30.20.100.511%樺木木聚糖（mL）111110將上述試管蓋上塑料布，用橡皮筋扎緊后置于恒溫水浴器中，保持在振幅80和溫度50 下保溫30 min后立即取出加入3 mL DNS試劑，在沸水中反應(yīng)5 min，冷卻到室溫后，加水到25 mL，充分搖勻后于550 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A值。根據(jù)木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（用木糖的絕對(duì)量對(duì)吸光度A值作圖），找出反應(yīng)所產(chǎn)生的木糖量（扣除空白值）。以0.2、0.3、0.4、0.5 mL酶量所生成木糖的毫克數(shù)為橫坐標(biāo)，酶量的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，從圖中找出生成2 mg木糖的酶量，按下式計(jì)算木聚糖酶活力：木聚糖酶活力 = 2mg木糖 30 min×0.15(mg/mol)×生成2mg木糖的酶量一個(gè)木聚糖酶活力單位定義為每分鐘生成1mol木糖所需的酶量，單位：IU/mL。三、木聚糖的測(cè)定方法1、準(zhǔn)確吸取5mL攪拌均勻的木聚糖溶液于250 mL三