1、一、關于 NEBM0202T4DNA 連接酶的使用方法和常見問題及解答1、產品特性和使用方法產品說明：該酶催化契合的雙鏈 DNA 或 RNA 的 5-磷酸末端和 3-羥基末端形成磷酸二酯鍵。該酶不僅能夠催化平滑末端或粘性末端 DNA 之間的連接，還可以修復雙鏈 DNA、RNA 或 DNA/RNA 雜交雙鏈中的單鏈切口（1）。來源：源于 E.coliC600pcl857pPLc28lig8（2）。應用：限制性酶切片段的克隆（3）o將 linker 或 adapters 連接到 DNA 片段的平滑末端。反應緩沖液：1XT4DNALigaseBuffer:50mMTris-HCl,10mMMgCl2

2、,10mMDTT,1mMATP,25 心 g/mlBSA,（pH7.525DNA 濃度（0.1-1M的 5末端）。使用注意：ATP 是反應必須的輔因子。這一點與要求 NAD 作輔因子的大腸桿菌 DNA 連接酶不同。如在反應體系中補加 1mM 的 ATP,連接反應還可以在 NEB 提供的四種限制性內切酶緩沖液（NEBuffers）或在 T4DNA多聚核甘酸激酶緩沖液中進行。質量保證：無核酸內、外切酶污染。每批 T4DNA 連接酶均通過模擬克隆實驗進行檢測，該實驗可以檢測出待連接 DNA末端的任何破壞。結果表明99.9%的 DNA 末端未受任何降解。單位定義（粘性末端活性單位）：在 20al 連接

3、反應體系、0.12aM（300g/ml）的 5-末端濃度條件下，16C 反應 30 分鐘，能使 50%的經 Hindm 消化的人 DNA 片段連接所需的酶量定義為一個 NEB 單位。一個粘端連接活性單位=0.015個韋氏（ATP-PP交換）單位（4）。一個韋氏單位=67個粘端連接活性單位。濃度：400,000units/ml 和 2,000,000units/ml。貯存條件：50mMKCl,10mMTris-HCl（pH7.4）,0.1mMEDTA,1mMDTT,200 心 g/mlBSA 和 50%的甘油，-20C 貯存。熱失活條件：65劭口熱 10 分鐘。室溫連接反應：為方便起見，連接反應

4、可以在室溫（20-2500條件下進行。粘性末端連接：在20口反應體系中加入1口T4DNA連接酶，反應10分鐘。平滑末端連接：在20反應體系中加入1口T4DNA連接酶反應2小時，或者加入1高濃度T4DNA連接酶反應10分鐘。另外，NEB 的快速連接試劑盒（QuickLigationKit,NEB#M2200V15 個反應）是獨有的可以在室溫 5 分鐘條件下連接平滑末端和粘性末端的試劑盒。圖 1:在 25C 條件下，用 1unit（1:400 稀釋后取 1 心T4DNA 連接酶連接入 DNA/Hindm 片段（4-堿基木端）不同反應時間的結果。圖 2:在20 心 1 反？心逑抵校？貌煌？康腿 4D

5、NA 連接酶連接平滑末端的人 DNA/Haem 片段。16C 溫育 30分鐘oID1strar圖 2:在 20u 女？u 逑抵校？貌煌？康腿 4DNA 連接酶連接平滑末端的人 DNA/HaeHI 片段。16C 溫育 30 分鐘04040前400400urirturirtT4DNAT4DNA也網、常見問題及解答Q1:有哪些潛在原因可導致用 T4DNA 連接酶連接后轉化失?。緼1:反應體系內無 ATP 或 Mg2+可導致連接失?。菏褂秒S酶提供的 buffer 或向其它兼容的 buffer 中加入 ATP。含 ATP 的Buffer 保存超過 1 年，其內 ATP 可能會降解，導致連接失敗。當補加

6、ATP 時，確定補加的是核糖核酸 ATP,而不是脫氧核糖核酸 ATP,因為后者不起作用。反應體系中鹽濃度過高或 EDTA 含量高都可導致連接失?。杭兓?DNA。去磷酸化步驟完成后，CIP、BAP 或 SAP 失活不徹底：根據廠家推薦的方法去除去磷酸化酶。DNA 濃度過高導致連接后產生的均是線性 DNA:保持總 DNA 濃度在 1-10 心 g/ml 之間。連接末端為單堿基突出末端：使用最高至 5 心得濃度連接酶 16C 過夜連接。插入片段和質粒沒有磷酸化。注意：如果載體已經去磷酸化了，而引物又沒有磷酸化會導致連接失敗，訂購磷酸化的引物或對引物進行磷酸化。加入過多的連接混合物至感受態(tài)細胞：50

7、心感受態(tài)細胞應加入 1-5 心連接混合物。插入片段太大，不能進行環(huán)化：降低插入片段的濃度，并使用高濃度連接酶 16。C 過夜連接。連接酶失活：用 lambdaHindIII 或其它可行的底物進行檢測。連接混合物含有 PEG 且連接反應過夜：長時間地在含有 PEG 的條件下連接可導致轉化效率降低，這可能是由于逐漸產生的大片段線性 DNA 抑制了轉化效率?？焖龠B接試劑盒（NEB#M2200）的 buffer 含有 PEG。電轉化前沒有提純連接混合物：電轉化必須去除 buffer,否則鹽會導致瞬間放電，擊穿細胞?？捎猛肝龌蛑兓姆椒兓B接混合物。雖然快速連接試劑盒（NEB#M2200）buffe

8、r 中含有的 PEG 不會導致?lián)舸┘毎?，但是會抑制電轉化，所以必須去除，可用柱純化方法去除 PEGQ2:解決轉化問題時，還有什么因素需要考慮？A2:感受態(tài)細胞出了問題：設置下面列出的實驗對照，必要時更換新鮮感受態(tài)細胞。細胞不是感受態(tài)：設置下面列出的實驗對照，必要時更換新鮮感受態(tài)細胞。一|大腸桿菌不能很好的接受重組蛋白：試用 pMAL 系統(tǒng)（NEBEE8000S）表達 MBP（麥芽糖結合蛋白）融合蛋白，或者試用其它不需要大腸桿菌的表達系統(tǒng)。連接的 DNA 片段含有反向重復的序列，不能用大腸桿菌篩選：如果可能去除重復序列，或試用其它不需要大腸桿菌的表達系統(tǒng)。插入序列來自哺乳動物、植物或者含有甲基化

9、的胞喀咤，會被很多大腸桿菌菌株降解：使用 mcrA、mcrBC 和 mrr 缺失菌株。重組子太大（10,000bp）不能進行化學轉化：用電轉化。Q3:內切酶酶切反應后，有什么因素可以導致 T4DNA 連接酶連接和后續(xù)的轉化失敗？A3:內切酶酶切不充分：如果酶切位點位于 PCR 產物的末端，識別位點末端側需要加至少 6 個保護堿基。用對照底物檢測內切酶的活性。內切酶沒有完全失活：如果內切酶不能熱失活，用酚/氯仿抽提純化 DNAo內切酶的星號活性消化了載體或插入片段：跑膠檢測 DNA,如果存在多余的條帶，減少內切酶使用量或減短反應時間。DNA 或內切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破壞了 DNA 末端：

10、酚/氯仿抽提純化 DNA。檢查內切酶的質量檢測資料和注意事項，如果連接 QC 不佳或外切酶活性高，減少內切酶量或縮短反應時間。Q4:使用 T4DNA 連接酶，需要設置什么對照來檢測細胞和 DNA。A4:注意：每個對照組都使用相同濃度的 DNA,一般為 0.1-1.0ng/轉化。轉化空載體（未切割的）至感受態(tài)細胞，目的：檢測感受態(tài)細胞的質量以及質粒的抗性。分別涂布于含有和不含有抗生素的平皿上。轉化線性化后的載體，目的：檢測未切開質粒的量，克隆數(shù)應該小于步驟 1 的 1%。酶切再連接質粒，目的：檢測連接酶的活性以及 DNA 末端的完整性?？寺?shù)應該與步驟 1 相近。酶切后去磷酸化再連接質粒，目的：

11、檢測未完全去磷酸化的背景?？寺?shù)應該小于步驟 1 的 1%。Q5:什么情況下選用 T4DNA 連接酶？A5:T4DNA 連接酶應該被用來連接粘性末端（室溫 10 分鐘）或平末端（室溫 2 小時），或者連接反應需要過夜。如果需要熱失活連接酶，選用用 T4DNA 連接酶。高濃度 T4DNA 連接酶被用來連接單堿基突出末端，或連接需要長時間孵育來環(huán)化的大片段，比如 BAC（細菌人造染色體）結構。Q6:T4DNA 連接酶能與快速連接 buffer 兼用嗎？A6:可以，高濃度 T4DNA 連接酶可以直接取代，如果是普通濃度的 T4DNA 連接酶，將孵育時間從 5 分鐘延長到 15分鐘。不要進行熱失活，因

12、為加熱會讓 buffer 內的 PEG 抑制轉化。反應時間延長也會降低轉化效率。Q7:T4DNA 連接酶連接應該加多少 DNA?A7：單位定義用的是 0.12aM（300 心 g/ml）lambdaHind 山高濃度的 DNA 用于 linker 的連接。為了促進環(huán)化（有利于轉化），應該控制總DNA 濃度于較低水平。載體+片段總濃度應為：1-10 心 g/ml。插入片段和載體的摩爾濃度比介于 2-6之間，比例低于 2:1 會降低連接效率，高于 6:1 會促進形成多個插入。如果對 DNA 的濃度不確定，可以做不同比例的多個連接反應。Q8:T4DNA 連接酶可在其它 NEBuffers 中使用嗎？

13、A8:連接可以在內切酶所有 4 個標準 buffer 和 T4 多聚核甘酸激酶的 buffer 中進行， 但需要加終濃度為 1mMATP。 確定補加的是核糖核酸 ATP,而不是脫氧核糖核酸 ATP,因為后者不起作用。當使用 NEBuffer3 時，如果 DNA 中鹽濃度較高可導致連接效率下降。Q9:T4DNA 連接酶可以熱失活嗎？A9:可以，65。（:孵育 20 分鐘可以失活。如果 buffer【快速連接試劑盒（NEB#M2200）內的 buffer中含有 PEG 則不可熱失活，否則會抑制轉化。Q10:Weiss 單位（韋氏單位）與 NEB 粘性末端單位如何換算？A10:一個 NEB 粘性末端

14、單位等于 0.015Weiss 單位，即一個 Weiss 單位等于 67 個 NEB 粘性末端單位。二、關于 NEBM2200T4DNA 快速連接試劑盒的使用方法和常見問題及解答1、產品特性介紹以及使用方法產品說明：本試劑盒可在室溫（25。C）5 分鐘條件下，完成 DNA 片段粘性末端或平滑末端的連接反應。應用：DNA 片段克隆入載體文庫構建TA 克隆Linker 連接線 TDNA 的再環(huán)化快速連接試劑盒的優(yōu)點：快速-粘性末端或平滑末端 DNA 片段的連接只需 5 分鐘即可完成方便-可在室溫條件下進行連接反應靈 7-適合于各種常規(guī)連接反應試劑盒成分：QuickT4DNA 連接酶（重組酶）2XQ

15、uickLigationBuffer貯存條件（連接酶）：50mMKCl,10mMTris-HCl（pH7.4）,0.1mMEDTA,1mMDTT,200 心 g/mlBSA 和 50%甘油。2XQuickLigationBuffer:132mMTris-HCl,20mMMgCl2,2mMATP,15%Polyethyleneglycol（PEG6000）*,pH7.625Co*美國專利號：4,582,802。注意：連接緩沖液用前徹底混勻，避免反復凍融。快速連步驟：混合 50ng 載體和 3 倍摩爾量的插入片段，用蒸播水調整總體積為 10M加入 101112xQuickLigationBuffe

16、r,混勻。加入 1 心 1QuickT4DNA 連接酶，徹底混勻。稍事離心，室溫（25C）作用 5 分鐘。冰上冷卻，然后車化或貯存于-20Co不要熱失活。熱失活會急劇降低轉化效率。轉化步驟：快速連接產物可通過幾種不同的方法進行轉化，NEB 推薦下述轉化方法：冰上融化感受態(tài)細胞。在 1.5ml 微量離心管中，將約 5ng（2 心防連接混合物冷卻。在 DNA 樣品中加入 50 心 1 感受態(tài)細胞，通過反復吹吸溫和混勻樣品。冰上放置 30 分鐘。37C 熱休克 2 分鐘，冰上冷卻 5 分鐘。加入 950 心 1 室溫培養(yǎng)基，37C 溫育 1 小時。取 100 心 1 樣品鋪在適宜的培養(yǎng)基上。37C

17、培養(yǎng)過夜。注意事項：用快速連接試劑盒能使大多數(shù)連接反應在 25。C5 分鐘達到反應終點，超過這個時間效果并不會更好。事實上，連接兩小時后轉化效率便會降低，如果 25。C 反應過夜，則轉化效率會降至 75%o待連接的純化 DNA 片段可以溶解在雙蒸水 （最好是 Milli-Q 超純水） 、 TE 或其它稀釋緩沖液中。 要獲得最適連接， 在加 2XQuickLigationBuffer前，調整載體 DNA 和插入片段的體積到 10 心。1DNA 片段體積大于 10 心的，則相應增加2 乂QuickLigationBuffer 的體積使之占總反應體積的 50%,同樣，DNA 連接酶的量也要加大。為保

18、證有效連接，總的載體 DNA+插入片段的濃度應當在 1-10 心 g 之間。對單插入來說，插入片段：載體比例在 2-6 之間最好，低于 2:1 就會導致低的連接效率，高于 6:1 則會導致產生多個插入。如果 DNA 片段的濃度不能確定，就以不同的比例做幾個連接反應。電轉化可以使轉化效率提高幾個數(shù)量級。在用快速連接反應產物做電轉化以前，一定要降低 PEG 濃度。我們推薦使用柱離心式 DNA 純化方法。連接進程曲線：LITMUS28 載體（NEB#N3628）經 EcoRUI 切割（平滑末端）或 Hindm 切割（粘性末端）后，小牛腸堿性磷酸酶處理、膠回收純化，作為連接載體；插入片段來自X174D

19、NA 的 Haem 消化產物（平滑末端）或入 DNA 的 Hindm 消化產物（粘性末端），分別以 3:1 的插入片段：載體比例按照快速連接程序進行連接。連接產物轉化入化學方法制備的大腸桿菌 DH5a 感受態(tài)細胞，在 LB-amp 平板上 37C 生長過夜。IDa-._._._._._._._|.“gIIII510510ISISTitn,Titn,加力限制性酶切片段的克隆（3）。2、快速連接試劑盒常見問題及解答Q1：在應用快速連接試劑盒時，什么原因可以造成不完全連接或轉化？A1:可能的原因有：快速連接反應被熱失活了?？焖龠B接緩沖液中含有 PEG,熱失活后會抑制轉化?？焖龠B接混合液在電擊之前沒有

20、純化。快速連接緩沖液中含有的 PEG 會阻止電擊反應?？梢詰蒙虡I(yè)化的 DNA 純化柱純化連接產物。過夜孵育進行連接反應。連接時間過長，快速連接緩沖液中存在的 PEG 就會降低轉化效率。連接反應時間超過 30min,也不會獲得更好的效果。反應體系中鹽濃度過高，抑制了連接或轉化反應。可以純化一下 DNAo脫磷之后， 所用的磷酸酶 （CIP,BAP 或 SAP） 沒有完全失活或去除。 可以按照推薦的操作來進行以去除磷酸酶或者選用熱敏磷酸酶 （NEB#M0289） 。因為熱敏磷酸酶在 65c5min 即可完全失活而無需純化 DNA。另外一些影響因素：緩沖液超過一年，其中的 ATP 已經降解。補加新鮮的 ATP 至終濃度為 1mM。DNA 濃度過高，連接產物只有線性分子。建議總 DNA 濃度在 1-10ag/ml 之間。插入片段和載體沒有磷酸基團。一|感受態(tài)細胞中加入的連接反應混合物過多。建議用量：50 心 l 感受態(tài)細胞中加入 1-5 心 l 混合物。二插入片段長度超過 10kb,反應條件無法滿足環(huán)化要求。可以降低插入片段濃度。限制性內切酶切割不完全。當用于 PCR 產物末端的切割時，建議在兩端的酶切位點上加至少 6 個保護堿基。限制性內切酶沒有完全熱失活。如果選用的內切酶不能被熱失活可以用酚/乙醇純化 DNA。內切酶消