1、細(xì)胞培養(yǎng)基及馴化細(xì)胞到無(wú)血清培養(yǎng)基中LI前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì) 胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以 后，再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，一減少到5%, 3%, 1%,直至無(wú)血清培養(yǎng)。在降低過(guò)般要逐步降低血清濃度，從 10%程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否 還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有 細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)之前，要 留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中

2、，以保證細(xì)胞的特性不發(fā) 生變化。為了使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)，關(guān)鍵的是使所培養(yǎng)細(xì)胞：1. 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期2. >90%活細(xì)胞率3. 適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的方法1. 直接適應(yīng)一一細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)中。一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)， 接種細(xì)胞密度應(yīng)該：2. 5X1053. 5X105細(xì)胞/ml。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1X 1063X106 細(xì)胞/ml時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4到7天后達(dá)到2X1064X106細(xì) 胞/ml時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基。每隔站5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 1X1063X106

3、細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在90,時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培 養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。2. 連續(xù)適應(yīng)一一分好兒步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基 (SFM)中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。(1)以2倍 正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基:25,SFM混合培養(yǎng)基 中，傳代培養(yǎng)。(2)當(dāng)細(xì)胞密度5X105細(xì)胞/ml時(shí)，以2X105到3X105細(xì)胞/ml細(xì)胞密度， 在有血清培養(yǎng)基:SFM為50?50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。(3)以2X106到 3X106細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25,有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。(4) 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到I

4、X 106到3X106細(xì)胞/ml (接種后4到6天)，在100, SFM 培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。(5) 每隔3到5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到IX 106到3X106細(xì)胞/ml,細(xì)胞活率在 90,時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。,直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行兒次傳代。在適應(yīng)過(guò)程中，最好不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要 注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界 因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清:許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含

5、FBS 的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基l?l(v?v)的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列 的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)兒代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量1?2, 1?4, 1?16,替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2到3次。和100培養(yǎng)可以直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代 物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，允許進(jìn)行2到3次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以 前的水平。特別需要強(qiáng)調(diào)的是:配制無(wú)血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸鐳器經(jīng)三次蒸憎或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成 分中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量其微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)

6、生致死性損害。這是無(wú)血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)1. 可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。2. 避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。3.避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影 響。4. 有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。5. 可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。缺點(diǎn)：1. 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保 存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。2. 成本較高。3. 針對(duì)性很強(qiáng)，一種無(wú)血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。無(wú)血清培養(yǎng)基一些配方1. 神經(jīng)細(xì)胞，干細(xì)胞，PC12細(xì)胞成份 終濃度 葡萄糖,0. 6%谷氨酰胺,2mMNaHCO3

7、, 3mMHepes , 5mM胰島素,2. 5 U g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白,lOOng/ml孕 酮,20nM丁二胺,60 u M 硒酸鈉,30nM青霉素,oOmg/ml鏈霉素,50mg/ml最后用DF12添加到100ml即可2. 各類小鼠胚胎癌細(xì)胞系培養(yǎng)基DMEM/F12 1:1 混合成 1000ml NaHCO3 2. 4gHEPES(l.oM) 10. Oul 硒酸(5*10-6M) 10. Oug 纖粘連蛋白 lug/cm2(37 度作用 15, 30分鐘)胰島素1000. Oug轉(zhuǎn)鐵蛋白5000. Oug 3. NIH3T3小鼠成纖維細(xì)胞培 養(yǎng)基DMEM/F12 1:1 混合成 1000m

8、lHEPES 15mM大豆胰酶抑制劑0. 1,胰島素10. 0ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白25. 0ug/ml纖粘連蛋口 5. 0ug/ml4. 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM/F12 1:1 混合成 1000mlNaHC03 1.2g/LHEPES lomM胰島素5. Oug/ml氨基乙醇20. OuM硒酸2. 5mM轉(zhuǎn)鐵蛋白35. oug/ml無(wú)蛋口培養(yǎng)基與限定化學(xué)成分培養(yǎng)基即不含有動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基。無(wú)蛋白培養(yǎng)基(protein free midium, PFM):無(wú)血清培養(yǎng)基仍含有較多的動(dòng)物蛋白，如胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛血清白蛋白 等。從生物技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)來(lái)看，不含動(dòng)物蛋白的培養(yǎng)基乂廣泛的應(yīng)用前景，許多

9、利用基因丄程技術(shù)重組的蛋口質(zhì)最終要應(yīng)用于人體，如果再生長(zhǎng)過(guò)程中使用了含有 動(dòng)物蛋口質(zhì)的培養(yǎng)基，純化過(guò)程就比較復(fù)雜，最終要達(dá)到一定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也有一定 的難度。無(wú)蛋白培養(yǎng)基就是為了適應(yīng)這發(fā)展趨勢(shì)而出現(xiàn)的，許多無(wú)蛋白培養(yǎng)基添加 了植物水解物以替代動(dòng)物激素、生長(zhǎng)因子的作用。市場(chǎng)上已有適合多種細(xì)胞生長(zhǎng)的 無(wú)蛋白培養(yǎng)基。限定化學(xué)成分培養(yǎng)基(chemical defined medium, CDM):是指培養(yǎng)基中的素有成 分都是明確的，它同樣不含有動(dòng)物蛋口，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用 了一些已知結(jié)構(gòu)與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養(yǎng)基更有利 于分析細(xì)胞的分泌產(chǎn)物。LI前已經(jīng)有適合于

10、293細(xì)胞、CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng) 的CDM問(wèn)世，上海恒利安生物科技有限公司生產(chǎn)的水解乳蛋口培養(yǎng)基就屬于CDMo干粉培養(yǎng)基的配制注意事項(xiàng)1. 認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)。說(shuō)明書(shū)都注明干粉不包含的成分，常見(jiàn)的有aHC03、谷 氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHC03、谷氨酰 胺，有些根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要決定。2. 配制是要保證充分溶解，N&HC03、谷氨酰胺等物質(zhì)都要等培養(yǎng)基完全溶解 之后才能添加。3. 配制所用的水應(yīng)是三蒸水，離子濃度很低。4. 所用器皿應(yīng)嚴(yán)格消毒。5. 配制好的培養(yǎng)基應(yīng)馬上過(guò)濾，無(wú)菌保存于4度。6. 液體培養(yǎng)基主要是為了科研工作的方便而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，它

11、是一種滅菌后 保證無(wú)菌的溶液，必要時(shí)可制成無(wú)內(nèi)毒素等的溶液，可節(jié)省科研人員的工作量。 配制方法1. 在一個(gè)盡可能接近總體積的容器中加入比預(yù)期培養(yǎng)基總體積少5,的雙蒸水。2. 在室溫（20?到30?）的水中加入干粉培養(yǎng)基，輕輕攪拌，不要加熱。3.水 洗包裝袋的內(nèi)部，轉(zhuǎn)移全部的痕量干粉到容器內(nèi)。4. 加NaHCO3到培養(yǎng)基中。5. 用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過(guò)分?jǐn)嚢琛?.通過(guò)緩 慢攪拌加入IN NaOH或IN HCL調(diào)節(jié)pH值，山于pH值在過(guò)濾時(shí)會(huì)上升0. 1到 0.3,因而調(diào)節(jié)pH值使它比最終想要的pH值低0.2到0.3。培養(yǎng)基在過(guò)濾前要保 持密封。細(xì)胞培養(yǎng)基的保存1. 干粉，買(mǎi)了后一定要保存在4度。有人保存在,20度我認(rèn)為沒(méi)