1、免疫組化結(jié)果判斷免疫組化結(jié)果判斷及常見(jiàn)問(wèn)題分析及常見(jiàn)問(wèn)題分析肝臟：肝臟：CK8理想著色，膽管上皮細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性，理想著色，膽管上皮細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性，肝細(xì)胞呈不同層次陽(yáng)性。肝細(xì)胞呈不同層次陽(yáng)性。 pan CKAE1/AE3） 在肝臟理想的染色，采用了熱修復(fù)。在肝臟理想的染色，采用了熱修復(fù)。 肝細(xì)胞膜、膽管強(qiáng)而清晰的著色。背景干凈。肝細(xì)胞膜、膽管強(qiáng)而清晰的著色。背景干凈。一、特異性染色的判斷一、特異性染色的判斷1.特定的定位特定的定位 細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性根據(jù)靶抗原不同而呈現(xiàn)胞膜型、胞漿型根據(jù)靶抗原不同而呈現(xiàn)胞膜型、胞漿型 或胞核型或胞核型 間質(zhì)陽(yáng)性間質(zhì)陽(yáng)性表現(xiàn)為細(xì)胞外著色，局限性或彌散性表現(xiàn)為細(xì)胞外著色，局限

2、性或彌散性2.染色的不均一性染色的不均一性 陽(yáng)性細(xì)胞的染色分布不均，片狀或點(diǎn)狀散在分布陽(yáng)性細(xì)胞的染色分布不均，片狀或點(diǎn)狀散在分布 染色強(qiáng)弱不等，顏色深淺反映抗原量的多少染色強(qiáng)弱不等，顏色深淺反映抗原量的多少 3.排除人為造成的非特異性染色排除人為造成的非特異性染色 切片的折疊、刀痕，色素沉著，組織細(xì)胞壞死。切片的折疊、刀痕，色素沉著，組織細(xì)胞壞死。4.顆粒性顯色顆粒性顯色 DAB顯色在高倍鏡下呈顆粒狀而非均勻著色。顯色在高倍鏡下呈顆粒狀而非均勻著色。免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化照片免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化照片CK10CD44v6ER合格的免疫組化染色切片合格的免疫組化染色切片是正確判斷染色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提是正確判斷染

3、色結(jié)果的基礎(chǔ)和前提不合格的免疫組化染色切片不合格的免疫組化染色切片容易導(dǎo)致誤判容易導(dǎo)致誤判C-erbB-2優(yōu)優(yōu)良良中中差差4321ER子宮內(nèi)膜子宮內(nèi)膜PR染色，修復(fù)不足染色，修復(fù)不足 子宮內(nèi)膜子宮內(nèi)膜PR染色，修復(fù)良好染色，修復(fù)良好 PR編號(hào)編號(hào)陽(yáng)性片陽(yáng)性片待檢片待檢片陰性對(duì)照陰性對(duì)照結(jié)論結(jié)論12345 操作失誤，抗體失效操作失誤，抗體失效非特異性著色非特異性著色陽(yáng)性片不含靶抗原陽(yáng)性片不含靶抗原待檢片不含定位抗原待檢片不含定位抗原待檢片含定位抗原待檢片含定位抗原二、染色結(jié)果的判斷二、染色結(jié)果的判斷PCNA S-P400S-P4001-day CM4-day CM陽(yáng)性強(qiáng)度陽(yáng)性強(qiáng)度2010視野下，

4、隨機(jī)選視野下，隨機(jī)選取取5個(gè)視野，測(cè)個(gè)視野，測(cè)100個(gè)陽(yáng)性個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度即為此細(xì)胞的平均光密度即為此片的陽(yáng)性強(qiáng)度。片的陽(yáng)性強(qiáng)度。三、結(jié)果分析三、結(jié)果分析P53陽(yáng)性細(xì)胞百分比陽(yáng)性細(xì)胞百分比 計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)100個(gè)瘤細(xì)胞，其中個(gè)瘤細(xì)胞，其中陽(yáng)性細(xì)胞的比例：陽(yáng)性細(xì)胞的比例： 5% （）（） 5%30% （）（） 30%50% （ ） 50% （ ）PCNABarnes法法A：瘤細(xì)胞顯色有無(wú)及深淺：瘤細(xì)胞顯色有無(wú)及深淺 0不著色）不著色） 1淺黃色）淺黃色） 2棕黃色）棕黃色） 3棕褐色）棕褐色）B：顯色細(xì)胞的比例：顯色細(xì)胞的比例 11%10%） 211%50%） 351%80%） 4（80%）評(píng)分

5、評(píng)分=AB 0分：陰性分：陰性 14分：弱陽(yáng)性分：弱陽(yáng)性 4分：強(qiáng)陽(yáng)性分：強(qiáng)陽(yáng)性膠原染色膠原染色陽(yáng)性面積百分比陽(yáng)性面積百分比4010視野，選取視野，選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域面積個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性區(qū)域面積占整個(gè)參考面積的百分率。占整個(gè)參考面積的百分率。CD34Weidner法法MVD計(jì)數(shù)）計(jì)數(shù)）孤立的棕黃色細(xì)胞族代表一條孤立的棕黃色細(xì)胞族代表一條微血管。微血管。低倍鏡下找到組織內(nèi)密度最高低倍鏡下找到組織內(nèi)密度最高區(qū)域。區(qū)域。4010視野下計(jì)數(shù)微血管數(shù)目。視野下計(jì)數(shù)微血管數(shù)目。K-rasVEGF附：定量分析圖象處理系統(tǒng) 1、圖象處理：、圖象處理： 利用儀器按照不同的目的進(jìn)行圖象的修正、變利用儀器按

6、照不同的目的進(jìn)行圖象的修正、變換、特征提取和測(cè)量。換、特征提取和測(cè)量。 1）“狹義指消除圖象的模糊不清部分，校正狹義指消除圖象的模糊不清部分，校正畸變。畸變。 2）“廣義包括對(duì)圖象的結(jié)構(gòu)分析，提取特征廣義包括對(duì)圖象的結(jié)構(gòu)分析，提取特征進(jìn)行測(cè)量。進(jìn)行測(cè)量。 2、圖象處理系統(tǒng)組成、圖象處理系統(tǒng)組成 圖象輸入顯微鏡、掃描儀）圖象輸入顯微鏡、掃描儀） 圖象處理運(yùn)算病理圖文分析軟件）圖象處理運(yùn)算病理圖文分析軟件） 圖象、數(shù)據(jù)輸出圖象、數(shù)據(jù)輸出 3、圖象處理系統(tǒng)功能、圖象處理系統(tǒng)功能 幾何形態(tài)學(xué)定量分析幾何形態(tài)學(xué)定量分析 細(xì)胞核、漿的大小、面積、核漿比；細(xì)胞核、漿的大小、面積、核漿比； 細(xì)胞分布密度、個(gè)數(shù)

7、；細(xì)胞分布密度、個(gè)數(shù)； 血管、血管、腺體的面積、密度；間質(zhì)的面積腺體的面積、密度；間質(zhì)的面積 免疫組織化學(xué)分析免疫組織化學(xué)分析 按著色灰度分類(lèi)，計(jì)算陽(yáng)性、陰性細(xì)胞的面積含量按著色灰度分類(lèi)，計(jì)算陽(yáng)性、陰性細(xì)胞的面積含量 DNA倍體分析倍體分析 計(jì)算正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞計(jì)算正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞DNA 含量，給出倍體參數(shù)、含量，給出倍體參數(shù)、DNA參數(shù)分布參數(shù)分布直方圖直方圖 AgNOR分析分析 顆粒分析：數(shù)目、大小、面積、比例顆粒分析：數(shù)目、大小、面積、比例 四、免疫組化異常著色及對(duì)策四、免疫組化異常著色及對(duì)策1.非特異性著色及其對(duì)策非特異性著色及其對(duì)策非特異性著色原因非特異性著色原因?qū)Σ邔?duì)策操作過(guò)程

8、沖洗不充分操作過(guò)程沖洗不充分每步?jīng)_洗每步?jīng)_洗35min內(nèi)源性過(guò)氧化物酶內(nèi)源性過(guò)氧化物酶3H2O2封閉封閉內(nèi)源性生物素內(nèi)源性生物素使用生物素阻斷試劑盒阻斷使用生物素阻斷試劑盒阻斷電荷吸附電荷吸附非免疫動(dòng)物血清封閉非免疫動(dòng)物血清封閉抗體不純抗體不純采用單克隆抗體采用單克隆抗體切片制片不當(dāng)切片制片不當(dāng)改善取材和制片改善取材和制片加試劑后切片干燥加試劑后切片干燥防止切片干燥防止切片干燥內(nèi)源性生物素內(nèi)源性生物素腎小管腎小管 內(nèi)源性生物素內(nèi)源性生物素淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性甲狀腺腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移性甲狀腺腺癌蛻膜組織部分胞核蛻膜組織部分胞核PR陽(yáng)性，血管內(nèi)紅細(xì)胞過(guò)氧化物酶顯色陽(yáng)性，血管內(nèi)紅細(xì)胞過(guò)氧化物酶顯色 嗜酸性粒細(xì)胞

9、中細(xì)胞色素顯色嗜酸性粒細(xì)胞中細(xì)胞色素顯色 吞噬細(xì)胞內(nèi)吞噬細(xì)胞內(nèi) 含鐵血黃素含鐵血黃素 壞死組織著色：壞死組織著色：AE1/AE3壞死組織著色壞死組織著色 交叉反應(yīng)：乳腺交叉反應(yīng)：乳腺ki-67組織細(xì)胞胞漿著色組織細(xì)胞胞漿著色黑色素瘤，細(xì)胞內(nèi)含黑色素，呈紫黑色，黑色素瘤，細(xì)胞內(nèi)含黑色素，呈紫黑色，HE染色染色 灶狀著色：機(jī)械原因著色灶狀著色：機(jī)械原因著色Cyclin D1 套細(xì)胞淋巴瘤套細(xì)胞淋巴瘤全片著色全片著色全片著色全片著色邊緣著色邊緣著色“陰陽(yáng)臉著陰陽(yáng)臉著色色氣泡氣泡非特異性著色原因非特異性著色原因?qū)Σ邔?duì)策操作過(guò)程沖洗不充分操作過(guò)程沖洗不充分每步?jīng)_洗每步?jīng)_洗35min內(nèi)源性過(guò)氧化物酶內(nèi)源性

10、過(guò)氧化物酶3H2O2封閉封閉內(nèi)源性生物素內(nèi)源性生物素使用生物素阻斷試劑盒阻斷使用生物素阻斷試劑盒阻斷電荷吸附電荷吸附非免疫動(dòng)物血清封閉非免疫動(dòng)物血清封閉抗體不純抗體不純采用單克隆抗體采用單克隆抗體切片制片不當(dāng)切片制片不當(dāng)改善取材和制片改善取材和制片加試劑后切片干燥加試劑后切片干燥防止切片干燥防止切片干燥非特異性著色及其對(duì)策非特異性著色及其對(duì)策無(wú)信號(hào)片無(wú)信號(hào)片CD302. 染色的假陰性及其對(duì)策染色的假陰性及其對(duì)策染色假陰性原因染色假陰性原因?qū)Σ邔?duì)策組織處理不當(dāng)（固定、浸蠟）組織處理不當(dāng)（固定、浸蠟）改善條件，重取材改善條件，重取材一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤一抗與二抗種屬連接錯(cuò)誤確定抗體種屬無(wú)誤確定抗

11、體種屬無(wú)誤抗體失效抗體失效不得使用過(guò)期的試劑盒不得使用過(guò)期的試劑盒顯色系統(tǒng)不相適配顯色系統(tǒng)不相適配更換適配的顯色系統(tǒng)更換適配的顯色系統(tǒng)操作不當(dāng)，遺漏重要步驟操作不當(dāng)，遺漏重要步驟嚴(yán)格遵守操作規(guī)程嚴(yán)格遵守操作規(guī)程無(wú)色或淺色片無(wú)色或淺色片MCL理想的理想的 CD5著色。所有的著色。所有的瘤細(xì)胞都著色很強(qiáng)。散在的瘤細(xì)胞都著色很強(qiáng)。散在的T細(xì)細(xì)胞著色比瘤細(xì)胞深。胞著色比瘤細(xì)胞深。 MCL的的CD5染色不足染色不足 (一抗?jié)庖豢節(jié)舛忍投忍?。 MCL瘤細(xì)胞幾乎都瘤細(xì)胞幾乎都沒(méi)有著色。沒(méi)有著色。3. 染色過(guò)弱原因及其對(duì)策染色過(guò)弱原因及其對(duì)策染色過(guò)弱原因染色過(guò)弱原因?qū)Σ邔?duì)策抗體濃度過(guò)低，孵育時(shí)間過(guò)短抗體濃度