1、rhBMP2m對(duì)射線輻射造血損傷小鼠的治療作者：周柯 施樂 田瓊 時(shí)間：2007-11-22 11:36:00 【摘要】 目的： 探討重組人骨形成蛋白2成熟肽(rhBMP2m)對(duì)射線輻射造血損傷小鼠的影響. 方法： 15只小鼠隨機(jī)分成3組：照射組、BMP治療組和對(duì)照組，每組5只. 照射組和BMP治療組均以60Co射線7.5 Gy照射200 s，對(duì)照組不接受照射. 照射后，照射組和對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL，BMP治療組注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理鹽水稀釋液，各6 d. 照射后1, 3, 5, 7, 9, 11 d以尾靜脈采血觀察3組小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板變化；照

2、射后11 d觀察照射組、BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)形成數(shù)變化. 結(jié)果： 3組間小鼠的外周血白細(xì)胞、血小板數(shù)目隨時(shí)間的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.05). 與對(duì)照組相比，照射組外周血白細(xì)胞如(0.320.11)109 vs (4.051.18)109, 7 d、紅細(xì)胞如(6.731.68)1012 vs (9.091.92)1012, 7 d、血小板計(jì)數(shù)如(26.607.47)109 vs (814.20187.01)109, 7 d顯著下降 (P0.01)；與照射組相比，BMP治療組外周血白細(xì)胞如(1.610.31)109 vs (0.320.11)109, 7 d、血小板計(jì)數(shù)如(142.603

3、5.71)1012 vs (26.607.47)1012, 7 d顯著增高 (P0.05)；BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)形成數(shù)顯著多于照射組(P0.01). 結(jié)論： BMP可提高射線放射損傷小鼠各系的造血細(xì)胞數(shù)目及脾結(jié)節(jié)形成數(shù)，具有促進(jìn)造血功能恢復(fù)的作用. 【關(guān)鍵詞】 人重組骨形成蛋白2 放射損傷 造血功能 脾結(jié)節(jié) 0引言 骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）超家族. 研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠皮下植入重組人骨形成蛋白2成熟肽（rhBMP2m），可引起間質(zhì)細(xì)胞聚集、軟骨形成，隨之出現(xiàn)骨替代、骨髓形成及骨塑性1. 在大量不同的實(shí)驗(yàn)研究中，rhBM

4、P2m 表現(xiàn)出良好的誘骨活性，在臨床上對(duì)于治療骨缺損、骨折、牙本質(zhì)修復(fù)等方面有廣闊的應(yīng)用前景. rhBMP2m可減輕射線輻射所致的急性造血損傷，治療組小鼠的與造血相關(guān)指標(biāo)較照射對(duì)照組和對(duì)照組有顯著性增加(P0.01)，提示rhBMP2m可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的分化、造血干細(xì)胞的形成及骨髓中造血干細(xì)胞的增殖，從而改善造血微環(huán)境，使輻射損傷后造血功能恢復(fù)2-3. 本研究旨在探討rhBMP2m對(duì)射線輻射造血損傷小鼠的治療作用. 1材料和方法 1.1材料二級(jí)Balb/c小鼠15只，雄性，體質(zhì)量1921 g，10周齡（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）；rhBMP2m（第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供）使用前

5、溶于生理鹽水，稀釋濃度為0.5 g/L，60Co射線源（第四軍醫(yī)大學(xué)輻照中心）. 1.2.1小鼠急性放射損傷模型的建立15只小鼠隨機(jī)分成3組：對(duì)照組、照射組和BMP治療組，每組5只. 照射組和BMP治療組均以60Co射線7.5 Gy（劑量率221.09 cGy/min）全身照射200 s，對(duì)照組不接受照射. 1.2.2治療照射后，照射組和對(duì)照組每日腹腔注射生理鹽水1 mL，BMP治療組注射等量0.5 g/L rhBMP2m生理鹽水稀釋液，各6 d. 1.2.3造血指標(biāo)觀察照射后1, 3, 5, 7, 9, 11 d以尾靜脈采血，觀察3組小鼠外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血小板變化；照射后11 d頸椎脫

6、臼法處死小鼠，取照射組和BMP治療組小鼠脾臟，加入Bouin氏液固定24 h，觀察標(biāo)本脾結(jié)節(jié)的情況并計(jì)數(shù). 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理： 數(shù)據(jù)以xs表示，采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)資料的方差分析. 2結(jié)果2m對(duì)放射損傷小鼠外周血白細(xì)胞的影響3組間外周血白細(xì)胞數(shù)目隨時(shí)間的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.01). 與對(duì)照組相比，照射組外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P0.01)，并于第7日降至最低點(diǎn)，第9日開始回升；與照射組相比，BMP治療組外周血白細(xì)胞數(shù)目顯著增高(P0.05). 與對(duì)照組相比，照射組外周血紅細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P0.05, 表1）. 2.3rhBMP2m對(duì)放射

7、損傷小鼠血小板的影響3組間外周血血小板數(shù)目隨時(shí)間的變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.01). 與對(duì)照組相比，照射組外周血血小板數(shù)目顯著減少(P0.01)；與照射組相比，BMP治療組外周血血小板數(shù)目顯著增高(P0.01,表1）. 2.4小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)（32.808.81）， 顯著多于照射組小鼠脾結(jié)節(jié)數(shù)（6.008.81，P0.01，圖1）. 對(duì)照組小鼠因沒有受到輻射損傷，所以沒有脾結(jié)節(jié). 3討論 BMP可誘導(dǎo)胚胎腹側(cè)中胚層的發(fā)生，形成含有血細(xì)胞的“間質(zhì)球”. BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是決定胚胎細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的關(guān)鍵，經(jīng)過剔除編碼BMP的基因而使BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙的小鼠將出現(xiàn)胚胎腹側(cè)

8、中胚層發(fā)生障礙以及造血功能障礙4-5. 把BMP植入成年機(jī)體的肌肉或皮下，在誘導(dǎo)骨的同時(shí)還誘導(dǎo)骨髓的形成. 在軟骨形成后，血管侵入軟骨，小淋巴樣細(xì)胞聚集，圍繞血管出現(xiàn)大量造血干細(xì)胞，這些干細(xì)胞增殖、分化就形成造血性骨髓，這與胚胎發(fā)生時(shí)骨髓形成的過程相仿. 人骨形成蛋白2（human bone marrow morphogenetic protein2，hBMP2）的cDNA全長(zhǎng)1188 bp，編碼396個(gè)氨基酸，定位于20號(hào)染色體p21區(qū)域6. 其被翻譯成前體蛋白后，切去氨基端的信號(hào)肽、前肽，兩個(gè)hBMP2單體再經(jīng)二聚化后分泌到細(xì)胞外. hBMP2成熟肽含有114個(gè)氨基酸，其中包括7個(gè)在TGF

9、家族中位置高度保守的半胱氨酸，6個(gè)半胱氨酸以3對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵形成一個(gè)半胱氨酸結(jié)7；成熟肽N端第117肽存在一個(gè)肝素結(jié)合位點(diǎn)8；前肽、成熟肽、同時(shí)包括BMP家族其它成員均含有一共同的蛋白酶酶切位點(diǎn)RXXR9. 以上結(jié)構(gòu)可能和其所具有的誘骨活性，與胚胎發(fā)生、分化，神經(jīng)系統(tǒng)及造血系統(tǒng)分化、發(fā)育的誘導(dǎo)作用有密切關(guān)系. 利用基因工程技術(shù)，獲得重組人骨形成蛋白2 (rhBMP2). 機(jī)體受到輻射時(shí)產(chǎn)生大量的自由基，引起生物大分子的損傷、DNA鏈斷裂、染色體畸變，引起突變、誘發(fā)腫瘤、造成早衰和壽命縮短等現(xiàn)象；同時(shí)，造血組織對(duì)輻射敏感，機(jī)體受照后造血組織變化的嚴(yán)重程度和照射劑量關(guān)系密切. 電離輻射不僅可以引起骨

10、髓血竇的損傷，也能抑制和破壞造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cells, HSC）10. HSC是產(chǎn)生各系血細(xì)胞的最原始細(xì)胞，是維持機(jī)體正常造血、保證損傷后重建造血的關(guān)鍵細(xì)胞. 骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells, BMSC）又被稱為間質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC），它具有多向分化的潛能，同時(shí)能分泌多種造血生長(zhǎng)因子和多種細(xì)胞黏附分子，對(duì)維持造血也有很重要的作用. BMSC和細(xì)胞外基質(zhì)在體內(nèi)共同構(gòu)成造血微環(huán)境支持并參與調(diào)節(jié)HSC及其子代細(xì)胞的靜止、自我更新，干細(xì)胞的定位、增生、成熟，以及過成熟細(xì)胞的凋亡11. 免

11、疫功能與造血功能密切相關(guān)，輻射能對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持久的影響. 受照后，機(jī)體巨噬細(xì)胞、CD3+/CD8+T細(xì)胞和自然殺傷NK細(xì)胞顯著下降，且與照射劑量呈正相關(guān)，直接導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能的低下和紊亂，而引起感染造成機(jī)體死亡12. 而接受大劑量放療后的腫瘤患者和急性放射病患者的骨髓造血抑制，引起嚴(yán)重感染等并發(fā)癥是病人死亡的主要原因. 對(duì)人體多種造血細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果表明，這些細(xì)胞在正常狀態(tài)下分泌hBMP2，在正常造血組織中也可檢測(cè)到hBMP213，同時(shí)正常骨髓造血干細(xì)胞表面表達(dá)BMPII型受體. 將BMP2植入成年動(dòng)物的肌肉或皮下，在植入局部誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞形成骨、軟骨細(xì)胞和誘生新的造血灶. 本實(shí)驗(yàn)中，三組間小鼠

12、的外周血白細(xì)胞、血小板數(shù)目隨時(shí)間變化的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P0.05). 與對(duì)照組相比，照射組外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板計(jì)數(shù)顯著下降(P0.01)，表明輻射對(duì)小鼠造血功能有損傷作用，其中粒細(xì)胞和血小板減少程度尤其明顯，提示小鼠受到輻射后出現(xiàn)造血干細(xì)胞急劇減少；與照射組相比，BMP治療組的外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)均顯著增高 (P0.05)，可能與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量偏少有關(guān). 脾結(jié)節(jié)測(cè)定法是檢測(cè)小鼠造血干細(xì)胞在脾臟定居和形成集落能力的方法. 照射后，照射組小鼠脾臟有少量脾結(jié)節(jié)形成，提示機(jī)體可能仍有少量造血干細(xì)胞存活；同時(shí)BMP治療組小鼠脾臟有大量脾結(jié)節(jié)形成，其數(shù)目與照射組比較有非常顯著的差異(P0

13、.01)，且BMP治療組小鼠脾結(jié)節(jié)的形態(tài)和大小存在差異，推測(cè)可能是由于不同系造血祖細(xì)胞定居于脾臟而形成的結(jié)果. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明BMP2對(duì)輻射所致造血損傷的修復(fù)或?qū)υ煅拇龠M(jìn)作用是對(duì)全血細(xì)胞性的作用. 無論是輻射或是化療藥物所引起的造血損傷都是一種對(duì)各系造血細(xì)胞全面的損傷. 我們先前的實(shí)驗(yàn)曾經(jīng)證實(shí)BMP促進(jìn)造血損傷的作用優(yōu)于GMCSF，其原因可能為GMCSF只是針對(duì)GM系列的細(xì)胞，而BMP則是對(duì)各系細(xì)胞均有促進(jìn)修復(fù)、增殖的作用可能是因?yàn)锽MP誘導(dǎo)造血因子釋放，或者其本身即為造血因子. rhBMP2通過什么樣的途徑誘導(dǎo)促進(jìn)了造血的修復(fù)？這有待于進(jìn)一步的研究.【參考文獻(xiàn)】 1 Saito N, Oka

14、da T, Horiuchi H, et al. Local bone formation by injection of recombinant human bone morphogenetic protein2 contained in polymer carrier J. Bone,2003,32(4):381-386.2 田瓊，張紹章，蒲勤，等. 重組人骨形成蛋白2成熟肽對(duì)小鼠輻射損傷的治療作用及其機(jī)理的探討J. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)雜志，1998,18(4):253-255.3 田瓊，張紹章，蒲勤，等. 骨形成蛋白對(duì)小鼠造血型急性放射損傷治療作用的研究J.輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào)，200

15、1, 19(3): 199-203.4 Winnier G, Blessing M, Labosky PA, et al. Bone morphogenetic protein4 (BMP4) is required for mesoderm formation and patterning in the mouse J. Genes Dev，1995,9(17):2105-2116.5 Kishimoto Y, Lee KH, Zon L, et al. The molecular nature of zebrafish swirl：BMP2 function is essential du

16、ring early dorsoventral patterning J. Development,1997,124(22):4457-4466.6 Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, et al. Novel regulators of bone formation: Molecular clones and activities J. Science,1988, 242(4885): 1528-1534.7 Scheufler C, Sebald W, Hulsmeyer M. Crystal structure of human bone morphogene

17、tic protein2 at 2.7 resolution J. J Mol Biol，1999,287(1):103-115.8 Ruppert R, Hoffmann E, Sebald W. Human bone morphogenetic protein 2 contains a heparinbinding site which modifies its biological activity J. Eur J Biochem, 1996,237(1):295-302.9 Celeste AJ, Iannazzi JA, Taylor RC, et al. Identificati

18、on of transforming growth factor family members present in boneinductive protein purified from bovine bone J. Proc Natl Acad Sci USA,1990,87(24):9843-9847.10 Dainiak N. Hematologic consequences of exposure to ionizing radiation J. Exp Hematol, 2002,30(6):513-528.11 Lemischka IR. Microenvironmental regulation of hematopoietic stem cells J. Stem Cells, 1997,15(1):63-68.12 Pecaut MJ，Gridley DS，Nelson GA. Longterm effects of lowdose proton radiation on immunity in mice: Shielded vs Longterm effects of lowd