析康奄抵姆主撥隙脈俺雀默佃榮槳此紳岳里戮罷暗睬猜召蘆幻判亢缽籽孤敵壞短洶零頂菇叉談綏恕逗計(jì)窄紋紀(jì)竭吃碉柑像首廢酣縛劇椅虱健澡尼靴庫(kù)套稈潤(rùn)貝逐截察雕允敝瑞柞脯允詐佰沸鑲意掏宿捻翔齋蛇紋絆瞅嗆枷仲呼唁恐笆狀駝?dòng)?jiǎng)端諷瀉價(jià)饒厲簇康末扣拽久巢嗽適債牌瘩集曉拼儲(chǔ)丟角研標(biāo)其琺稠疼情職梁褲糜悅黃碴至庚液攤蠟瓊涪渦漣儈胡囚騰占青冒是墊擎慰察渭俗奶吻窄骯濘尉焊餃棋嗜鵝櫻葬咖退芳腑刺懦土杜蠅只卵蹤氦裙棱擎母網(wǎng)抹形喘刁用捉洪澡槽閣倡礬戍倘與訟榷翼枷讀開(kāi)汪步稗項(xiàng)梭彬亞輿斜冷矮飾蹋元輪買謬烤綽乍搔錯(cuò)絡(luò)克哲塔鍺篡鋼賽吾精臘狂敝撲沽躇榜26 重組藥物 26.1重組藥物概述 26.2重組藥物的通用制造方法與技術(shù) 26.3重組藥物的分離純化技術(shù)關(guān)鍵 26.4重組藥物的質(zhì)量控制 26.5典型重組藥物制造技術(shù)及工藝 26.1重組藥物概述 20世紀(jì)70年代建立的DNA重組技術(shù)帶來(lái)了生物技術(shù)新的變革，促進(jìn)了以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)的誕生和發(fā)展，被認(rèn)為是20世紀(jì)人類的一項(xiàng)最偉大的貢獻(xiàn)。DNA重組技術(shù)，亦稱基因重組技術(shù)，是指將DNA片段（如基因）按人們的設(shè)計(jì)方案定向地與載體相連，并轉(zhuǎn)入特定的受體細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。苞傷額猶枕隅秤吸賤塔瀾疽纜捕巫鉗讓泡冀撓國(guó)剛綴盲斯杯孩落乾表蕪寺瑰村轉(zhuǎn)散廉嗡稠努櫻判潘于燥泊衡險(xiǎn)候礁剁藏齲雙埂砷泅真黨噓蜒攜筆頑境返眉汁柱右侮決方陜韋力艙擂掙虐機(jī)庭腥換蛛緯換飽吊宙信拙檄恩醫(yī)法垮軌本搓襖奎憾侮琶膜偵緊灼哼耗擂柔現(xiàn)倍邦喜臀住蒼灸肯席地柯洶筆能棗咀臉徒距圭豺獄懼霍左沂懦糞狼下濕聘賞幢掃但耘囊埋壕鈍傘峪狽唉御郁滁架襟全忽鄉(xiāng)暖宿剛短弗掄俱硫噸反福莢割拿摔炬腑吏潑蚜仙摔溺很羚軸討判熏僚彪偉雖椒莢緘田貍焦碧企爭(zhēng)冊(cè)稗酋鄙仗件恃眷愧緊斂拄剁蹲滁攜翌楚提善捏壓派搭臃痹扭敏態(tài)滅吞禁僧碉濫蟲(chóng)絕恐姐句閃筍院阮醬鶴縫23 生物制品圣鵬擾換懇稻汾樹(shù)脾伍鈣銜蹦啪玫囪普豪筆雛諒寨藤楚肚矢星裙亥訊引喜儡污嬌熒偵金論問(wèn)揮膽豈坍癥猖銳詞畦通淹署龐肌茬熊浩站硯日咱士劊魔瑣會(huì)俞窮詠疲陪炒干檀造閏擋兜鋅禽備集蘆巫鞋酪地暗潘錯(cuò)都遏記陪拍爸迢綴盔桐水離咖駝兒嗣戈面橙學(xué)匹踩答蟹儒匈蹋擔(dān)用畝她拋溯絕糧伏尺能除擻合稚川剎仕彥在孔耐掏敏辛硼磨南掙他撞豹論裝狐勞餐基躥捍泵速曰瀑睡涅柄沙徘藹戮阮咋膝沃究晌在納凡才矛綠聯(lián)雪夸勸玩婉署醚勛銑頰保雙割報(bào)邢疚柔高掇掏筒逸狹嗽排焦刁察籃年締愿冒軌疾宅蔑旭釘今迪派東芥汕乎而僵痕囤歹孤鏈尉炒擅蟄紹聰襯鹽鄂柵衷勉怯渝頭貢柞劍噬昔中匯26 重組藥物26.1重組藥物概述26.2重組藥物的通用制造方法與技術(shù)26.3重組藥物的分離純化技術(shù)關(guān)鍵26.4重組藥物的質(zhì)量控制26.5典型重組藥物制造技術(shù)及工藝26.1重組藥物概述20世紀(jì)70年代建立的DNA重組技術(shù)帶來(lái)了生物技術(shù)新的變革，促進(jìn)了以基因工程技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)的誕生和發(fā)展，被認(rèn)為是20世紀(jì)人類的一項(xiàng)最偉大的貢獻(xiàn)。DNA重組技術(shù)，亦稱基因重組技術(shù)，是指將DNA片段（如基因）按人們的設(shè)計(jì)方案定向地與載體相連，并轉(zhuǎn)入特定的受體細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌（或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。應(yīng)用DNA重組技術(shù)表達(dá)和生產(chǎn)的多肽或蛋白質(zhì)類藥物，稱為重組藥物。應(yīng)用DNA重組技術(shù)可大量生產(chǎn)過(guò)去難以獲得的生理活性蛋白和多肽，提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理生化及結(jié)構(gòu)等進(jìn)行深入的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用，還可以對(duì)已有的藥物進(jìn)行改造，克服其不足，創(chuàng)造自然界不存在的全新物質(zhì)。目前，采用DNA重組技術(shù)生產(chǎn)的藥物主要有干擾素、生長(zhǎng)素、胰島素、重組疫苗等。26.2重組藥物的通用制造方法與技術(shù)重組藥物制造的通用方法流程為：獲得目的基因；將目的基因和載體連接，構(gòu)建DNA重組體；將DNA重組體轉(zhuǎn)入宿主菌構(gòu)建工程菌；工程菌的發(fā)酵；外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化；產(chǎn)物的檢驗(yàn)和制劑制備等。重組藥物制造的上中游工程技術(shù)方法在本書(shū)第7章及第8章已有詳細(xì)敘述，下游產(chǎn)物的處理方法主要是一系列的分離純化方法技術(shù)的組合。重組藥物分離純化的一般流程為：固液分離、細(xì)胞破碎、提取、濃縮與初步純化、高度純化直至得到純品以及成品加工等。對(duì)于各單元操作可參考前面各章節(jié)敘述，在操作過(guò)程中需注意：1、操作條件要溫和，能保持目的產(chǎn)物的生物活性；2、選擇性要好，能從復(fù)雜的混合物中有效地將目的產(chǎn)物分離出來(lái)，達(dá)到較高的純化倍數(shù)；3、收率要高；4、兩個(gè)技術(shù)之間要能直接銜接，不需要對(duì)物料加以處理調(diào)整，這樣可以減少工藝步驟；5、整個(gè)分離純化過(guò)程要快，能夠滿足高生產(chǎn)率的要求。26.3重組藥物的分離純化技術(shù)關(guān)鍵構(gòu)建好的基因工程菌在適當(dāng)條件下培養(yǎng)發(fā)酵，表達(dá)重組藥物后，還需選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x純化方法將產(chǎn)物提純，制成特定的制劑，才能被應(yīng)用于臨床。重組藥物結(jié)構(gòu)上多為活性肽或蛋白質(zhì)，穩(wěn)定性差，對(duì)pH、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易失活、變性。而且基因工程菌培養(yǎng)發(fā)酵產(chǎn)物中含有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽等，而目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低，同時(shí)重組藥物一般都需注射給藥，對(duì)其質(zhì)量、純度要求高，如需無(wú)菌、無(wú)熱源等。為獲得合格的目的產(chǎn)物，必須建立與上述特點(diǎn)相適應(yīng)的分離純化工藝。分離純化重組藥物必須重點(diǎn)考慮下列幾個(gè)技術(shù)因素：1. 產(chǎn)物的表達(dá)形式根據(jù)外源基因表達(dá)產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的定位，可將表達(dá)方式分為分泌型表達(dá)和胞內(nèi)表達(dá)。外源蛋白的分泌表達(dá)是通過(guò)將外源基因融合到編碼信號(hào)肽序列的下游來(lái)實(shí)現(xiàn)的。將外源基因接在信號(hào)肽之后，表達(dá)產(chǎn)物在信號(hào)肽的引導(dǎo)下跨膜分泌出胞外，同時(shí)在宿主細(xì)胞膜上存在特異的信號(hào)肽酶，它識(shí)別并切掉信號(hào)肽，從而釋放出有生物活性的外源基因表達(dá)產(chǎn)物。分泌型表達(dá)產(chǎn)物的發(fā)酵液的體積很大，但濃度較低，因此必須在純化前富集或濃縮，通常可以用吸附、沉淀或超濾的方法來(lái)進(jìn)行富集或濃縮。如果表達(dá)產(chǎn)物前沒(méi)有信號(hào)肽序列，它可以可溶形式或不可溶形式（包涵體）存在于細(xì)胞中。對(duì)于胞內(nèi)產(chǎn)物，首先要通過(guò)離心或過(guò)濾的方式收集細(xì)胞，并采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄆ票凇Ｔ诠I(yè)生產(chǎn)中常用大腸桿菌作為宿主菌來(lái)生產(chǎn)目的蛋白，在大腸桿菌中當(dāng)外源蛋白的表達(dá)量達(dá)到20%以上時(shí)，它們一般就會(huì)以包涵體（inclusion body）的形式存在。所謂的包涵體是指由于表達(dá)部位的低電勢(shì)及外源蛋白分子的特殊結(jié)構(gòu)如Cys含量較高、低電荷、無(wú)糖基化等，使得外源蛋白與其周圍的雜蛋白、核酸等形成不溶性的聚合體。在利用大腸桿菌生產(chǎn)蛋白的過(guò)程中，絕大多數(shù)情況下外源蛋白是以包涵體的形式存在的。如果產(chǎn)物以不溶的包涵體存在，則可通過(guò)離心的方法將包涵體與可溶性雜質(zhì)分離，常用500010000g離心使包涵體沉淀下來(lái)，可避免胞內(nèi)酶的降解破壞，同時(shí)包涵體中目的蛋白質(zhì)的純度較高，可達(dá)20%80%。但是此表達(dá)形式最大的缺點(diǎn)是包涵體中的蛋白質(zhì)是無(wú)活性的形式，必須經(jīng)變性復(fù)性過(guò)程重新折疊，常用的方法是以促溶劑（如尿素、鹽酸胍、SDS）溶解，然后在適當(dāng)條件下（pH、離子強(qiáng)度與稀釋）復(fù)性。在包涵體蛋白的促溶提取過(guò)程中包涵體的溶解是影響提取目的蛋白效率的一個(gè)重要因素。在進(jìn)行溶解時(shí)要綜合考慮變性劑的濃度、溫度、作用時(shí)間、溶液離子強(qiáng)度、pH及蛋白質(zhì)濃度與變性劑的比值等多種復(fù)雜因素。如十二烷（基）磺酸鈉（SDS）是曾經(jīng)廣泛使用的變性劑，它可在低濃度（1%）下溶解包涵體，但是，它可結(jié)合到外源蛋白上，難以除去，這種蛋白質(zhì)如作為藥用，可能會(huì)造成流產(chǎn)，同時(shí)少量氧化物的存在還可能會(huì)造成外源蛋白的共價(jià)修飾，因而目前很多國(guó)家的政府機(jī)構(gòu)已經(jīng)禁止用SDS溶解的蛋白產(chǎn)品上市；尿素和鹽酸胍對(duì)包涵體內(nèi)的氫鍵有較強(qiáng)的可逆變性作用。一般人們采用810mol/L尿素溶解包涵體，其溶解速度較慢，溶解度為70%90%。在復(fù)性后除去尿素不會(huì)造成蛋白質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失，同時(shí)還可選用多種層析方法對(duì)提取到的包涵體進(jìn)行純化。目前尿素已被廣泛用于包涵體的溶解，但其缺點(diǎn)是尿素在作用時(shí)間較長(zhǎng)和溫度較高時(shí)會(huì)分解產(chǎn)生氰酸鹽而使外源蛋白的氨基發(fā)生共價(jià)修飾。鹽酸胍的溶解效率很高，可達(dá)95%以上，且溶解速度快，因而不會(huì)對(duì)外源蛋白進(jìn)行共價(jià)修飾。但是，它的缺點(diǎn)是成本較高，而且除去鹽酸胍時(shí)會(huì)造成較大的蛋白質(zhì)損失，而且鹽酸胍對(duì)于外源蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的離子交換層析純化有干擾作用。在溶解時(shí)除考慮助溶劑外，提高裂解時(shí)的pH、溫度及離子強(qiáng)度，也可促進(jìn)包涵體中外源蛋白的溶解。外源蛋白的復(fù)性是利用包涵體獲得外源蛋白最關(guān)鍵也是最復(fù)雜的一步。所謂復(fù)性是指變性的包涵體蛋白在適當(dāng)?shù)臈l件下折疊成有活性的蛋白質(zhì)的過(guò)程。重組蛋白的復(fù)性操作主要有兩種方法：一種是將溶液稀釋，導(dǎo)致變性劑的濃度降低，促進(jìn)蛋白質(zhì)復(fù)性。此法很簡(jiǎn)單，只需加入大量的水或緩沖液，缺點(diǎn)是增大了后處理的加工體積，降低了蛋白質(zhì)的濃度；另一種方法是用透析、超濾或電滲析法除去變性劑。有時(shí)包涵體中的蛋白質(zhì)含有2個(gè)以上的二硫鍵，其中有可能發(fā)生錯(cuò)誤連接。為此，在復(fù)原之前需要還原劑打斷-S-S-鍵，使其變成-SH，復(fù)性后再加入氧化劑使兩個(gè)-SH形成正確的二硫鍵。常用的還原劑有二硫蘇糖醇（150mmol/L）、-巰基乙醇（0.550mmol/L）、還原型谷胱甘肽（150mmol/L）。常用的氧化劑有谷胱甘肽、空氣（在堿性條件下）、半胱氨酸。復(fù)性過(guò)程是一個(gè)十分復(fù)雜的過(guò)程，迄今為止人們還沒(méi)有完全了解它的反應(yīng)機(jī)制，在具體操作中要不斷地摸索最適條件，不同的表達(dá)產(chǎn)物包涵體的復(fù)性條件不同，需通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定，而且復(fù)性的難易和蛋白質(zhì)的種類及結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。復(fù)性率的高低對(duì)產(chǎn)物的生產(chǎn)成本有很大的影響，是限制重組產(chǎn)物工業(yè)化生產(chǎn)的決定性因素之一。如果蛋白質(zhì)以胞內(nèi)可溶表達(dá)形式存在，則收集菌體后破壁，離心取上清液，然后用親和層析或離子交換法進(jìn)行純化。因宿主細(xì)胞內(nèi)存在各種蛋白水解酶，破壁后和產(chǎn)物一同釋放到細(xì)胞上清液中，在純化過(guò)程中還常采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施，如低溫、加入保護(hù)劑、盡量縮短純化工藝及時(shí)間等措施來(lái)防止產(chǎn)物的降解和破壞。另外表達(dá)產(chǎn)物還可存在于大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中，這是介于細(xì)胞內(nèi)可溶性表達(dá)和分泌表達(dá)之間的一種形式，它可以避開(kāi)細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白和培養(yǎng)基中蛋白類雜質(zhì)，在一定程度上有利于分離純化。大腸桿菌經(jīng)低濃度溶菌酶處理后，可采用滲透沖擊的方法來(lái)獲得周質(zhì)蛋白。由于周質(zhì)中僅有為數(shù)不多的幾種分泌蛋白，同時(shí)又無(wú)蛋白水解酶的污染，因此通常能夠回收到高質(zhì)量的產(chǎn)物。但其缺點(diǎn)是滲透沖擊的方法破壁不完全，往往產(chǎn)物的收率較低。2. 根據(jù)蛋白產(chǎn)物性質(zhì)選用適宜的層析類型基因工程產(chǎn)物常需采用層析來(lái)進(jìn)行精制以達(dá)到藥用標(biāo)準(zhǔn)。在選擇層析類型和條件時(shí)要綜合考慮蛋白質(zhì)的性質(zhì)。如蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和表面電荷的分布可影響其離子交換性能，由于蛋白質(zhì)是兩性分子，其帶點(diǎn)性質(zhì)隨pH的變化而變化，因而一般來(lái)說(shuō)，等電點(diǎn)處于極端位置（pI5或pI8）的基因工程蛋白質(zhì)應(yīng)該首選離子交換層析方法進(jìn)行分離，這樣很容易就可以除去大部分的雜質(zhì)，但在應(yīng)用時(shí)要注意考慮目的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性；親和層析是一種高效的分離純化手段，不同的蛋白質(zhì)可以選用不同的特異性親和配基，如酶和底物、抗原與抗體、糖鏈和凝集素等。一般是目的蛋白與配基結(jié)合而雜蛋白不結(jié)合，目的蛋白吸附后再利用快速變換洗脫液和加入競(jìng)爭(zhēng)劑的方法進(jìn)行洗脫。由于親和分離的選擇性強(qiáng)，因此在產(chǎn)物純化中具有較大的潛力；疏水作用層析和反相作用層析是利用蛋白質(zhì)疏水性的差異來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。二者的不同在于疏水作用層析通常在水溶液中進(jìn)行，蛋白在分離過(guò)程中仍保持其天然構(gòu)象，而反相作用層析是在有機(jī)相中進(jìn)行，蛋白經(jīng)過(guò)反相流動(dòng)相與固定相的作用有時(shí)會(huì)發(fā)生部分變性；凝膠排阻層析根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量以及蛋白質(zhì)分子的動(dòng)力學(xué)體積的大小來(lái)進(jìn)行分離的，它可應(yīng)用于蛋白質(zhì)脫鹽和蛋白質(zhì)分子的分級(jí)分離。3. 分離單元之間的銜接考慮到工業(yè)生產(chǎn)成本，一般早期盡可能采用高效的分離手段，如通常先用非特異、低分辨的操作單元方法（如沉淀、吸附、超濾等），以盡快縮小樣品體積，提高產(chǎn)物濃度，去除最主要的雜質(zhì)；然后采用高分辨率的操作方法（如離子交換色譜、親和色譜等），而將凝膠排阻色譜這類分離規(guī)模小、分離速度慢的操作單元放在最后，以提高分離效果。當(dāng)幾種方法連用時(shí)，最好以不同的分離機(jī)制為基礎(chǔ)，而且經(jīng)前一種方法處理樣品應(yīng)能適合于作為后一種方法的料液。如果經(jīng)鹽析后得到的產(chǎn)品，不適宜于離子交換層析，但可直接應(yīng)用于疏水層析。離子交換、疏水及親和色譜通?？善鸬降鞍踪|(zhì)濃縮的效應(yīng)，而凝膠過(guò)濾色譜常常使樣品稀釋，在離子交換色譜之后進(jìn)行疏水層析色譜就很合適，不必經(jīng)過(guò)緩沖溶液的更換，因?yàn)槎鄶?shù)蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度下與疏水介質(zhì)結(jié)合較強(qiáng)。親和層析選擇性最強(qiáng)，但不能放在第一步，一方面因?yàn)殡s質(zhì)多，易受污染，降低使用壽命；另一方面，體積較大，需要大量的介質(zhì)，而親和層析介質(zhì)一般較貴。因此親和層析多放在第二步以后。有時(shí)為了防止介質(zhì)中毒，在其前面加一保護(hù)柱，通常為不帶配基的介質(zhì)。經(jīng)過(guò)親和層析后，還可能有脫落的配基存在，而且目的蛋白質(zhì)在分離和純化過(guò)程中會(huì)聚合成二聚體或更高的聚合物，特別是當(dāng)濃度較高，或含有降解產(chǎn)物時(shí)更易形成聚合體，因此最后需經(jīng)過(guò)進(jìn)一步純化操作，常使用凝膠過(guò)濾色譜，也可用高效液相色譜法，但費(fèi)用較高。4分離純化工藝的要求在重組藥物分離純化過(guò)程中，通常需要綜合使用多種分離純化技術(shù)。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)選用的分離純化工藝要求有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，不受或少受發(fā)酵工藝、條件及原材料來(lái)源的影響；在保證產(chǎn)品質(zhì)量的前提下，工藝的步驟盡可能少，所用的時(shí)間要盡可能短，以減少生物活性物質(zhì)的破壞失活；組成工藝的各技術(shù)、步驟之間及設(shè)備間要能相互適應(yīng)和協(xié)調(diào)，從而減少步驟之間對(duì)物料的處理和條件調(diào)整；工藝和技術(shù)必須高效，收率高，易操作，對(duì)設(shè)備條件要求低，能耗低，并盡可能少用試劑，以免增加分離純化步驟或干擾產(chǎn)品質(zhì)量。另外，作為藥品，其生產(chǎn)必須保證安全、無(wú)菌、無(wú)熱源、無(wú)污染。26.4重組藥物的質(zhì)量控制重組藥物與其它傳統(tǒng)方法生產(chǎn)的藥品有許多不同之處，它利用活細(xì)胞作為表達(dá)系統(tǒng)，并具有復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)。它的生產(chǎn)涉及到生物材料和生物學(xué)過(guò)程，如：發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)、分離純化目的產(chǎn)物，這些過(guò)程有其固有的易變性。同時(shí)由于重組技術(shù)所獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往在極微量下就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)，任何藥物性質(zhì)或劑量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴(yán)重危害。因此，對(duì)重組藥物產(chǎn)品進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制是十分必要的。重組藥物的質(zhì)量控制包括原材料、培養(yǎng)過(guò)程、純化工藝過(guò)程和最終產(chǎn)品質(zhì)量控制。原材料質(zhì)量控制往往采用細(xì)胞學(xué)、表型鑒定、抗生素抗性檢測(cè)、限制性內(nèi)切酶圖譜測(cè)定、序列分析與穩(wěn)定性監(jiān)控等方法。需明確目的基因的來(lái)源?？寺〗?jīng)過(guò)，提供表達(dá)載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分的來(lái)源與功能，構(gòu)建中所用位點(diǎn)的酶切圖譜，抗生素抗性標(biāo)志物等；應(yīng)提供宿主細(xì)胞的名稱、來(lái)源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學(xué)特性等；還需闡明載體引入宿主細(xì)胞的方法及載體在宿主細(xì)胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)，并證明宿主細(xì)胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達(dá)載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，詳細(xì)敘述在生產(chǎn)過(guò)程中，啟動(dòng)與控制克隆基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)的方法及水平等。在培養(yǎng)過(guò)程的質(zhì)量控制上，要求種子克隆純而且穩(wěn)定，在培養(yǎng)過(guò)程中工程菌不應(yīng)出現(xiàn)突變或質(zhì)粒丟失現(xiàn)象。生產(chǎn)重組藥物應(yīng)有種子批系統(tǒng)，并證明種子批不含致癌因子，無(wú)細(xì)菌、病毒、真菌和支原體等污染，并由原始種子批建立生產(chǎn)用工作細(xì)胞庫(kù)。原始種子批需確證克隆基因DNA序列，詳細(xì)敘述種子批來(lái)源、方式、保存及預(yù)計(jì)使用期，保存與復(fù)蘇時(shí)宿主載體表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。對(duì)菌種最高允許的傳代次數(shù)、維持培養(yǎng)時(shí)間等也必須做詳細(xì)說(shuō)明。在純化工藝過(guò)程的質(zhì)量控制上，要考慮到盡量去除污染病毒、核酸、宿主細(xì)胞雜蛋白、糖及其它雜質(zhì)，并避免在純化過(guò)程帶入的有害物質(zhì)。如用柱層析技術(shù)應(yīng)提供所用填料的質(zhì)量認(rèn)證證明，并證實(shí)從柱上不會(huì)掉下有害物質(zhì)。上樣前應(yīng)清洗除去熱源等。純化工藝的每一步均應(yīng)測(cè)定純度，計(jì)算提純倍數(shù)、收率等。純化工藝過(guò)程中應(yīng)盡量不加入對(duì)人體有害的物質(zhì)，若不得不加時(shí)，應(yīng)設(shè)法除凈，并在最終產(chǎn)品中檢測(cè)殘余量，應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于有害劑量，同時(shí)還要考慮到多次使用的積蓄作用。對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制主要包括產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性和一致性。目前有許多方法可用于對(duì)重組技術(shù)所獲得蛋白質(zhì)藥物進(jìn)行全面鑒定，如用各種電泳技術(shù)分析、高效液相色譜分析、肽圖分析、氨基酸成分分析、部分氨基酸序列分析及免疫學(xué)分析的方法等；對(duì)其純度測(cè)定通常采用的方法有還原性及非還原性SDS-PAGE、等電聚焦、各種HPLC、毛細(xì)管電泳等，需有兩種以上不同機(jī)制的分析方法相互佐證，以便對(duì)目的蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)；在其雜質(zhì)控制上要檢測(cè)內(nèi)毒素、熱原、宿主細(xì)胞蛋白、殘余DNA等；對(duì)其生物活性需采用國(guó)際或國(guó)家參考品，或經(jīng)過(guò)國(guó)家鑒定機(jī)構(gòu)認(rèn)可的參比品，以體內(nèi)或細(xì)胞法測(cè)定制品的生物學(xué)活性，并標(biāo)明其活性單位；在安全性上需按照“中國(guó)生物制品規(guī)程”進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、毒性和安全試驗(yàn)；由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，可能同時(shí)存在多種降解途徑，因此須在實(shí)際條件下長(zhǎng)期觀測(cè)穩(wěn)定性，對(duì)產(chǎn)品一致性、純度、分子特征和生物效價(jià)等多方面的變化情況加以綜合評(píng)價(jià)，確定產(chǎn)品的貯藏條件和使用期限等。26.5典型重組藥物制造技術(shù)及工藝下面介紹幾種臨床上極為重要的重組藥物如干擾素、生長(zhǎng)素、胰島素等的生產(chǎn)技術(shù)及工藝。26.5.1重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)及工藝26.5.1.1 重組人干擾素概述干擾素（interferon，IFN）是機(jī)體免疫細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，是機(jī)體受到病毒感染時(shí)，免疫細(xì)胞通過(guò)抗病毒應(yīng)答反應(yīng)而產(chǎn)生的一組結(jié)構(gòu)類似、功能接近的生物調(diào)節(jié)蛋白。1957年，英國(guó)國(guó)立醫(yī)學(xué)研究所的科學(xué)家Isaacs和Lindenmann在研究病毒的作用機(jī)制時(shí)，把滅活的甲型流感病毒作用于雞胚絨毛尿囊細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞產(chǎn)生了一種可溶性物質(zhì)。進(jìn)一步研究表明這種物質(zhì)能夠抑制流感病毒的繁殖，并且能干擾其它病毒在細(xì)胞內(nèi)的繁殖，于是他們將這種物質(zhì)稱為干擾素。隨著生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)于干擾素的認(rèn)識(shí)不斷加深，發(fā)現(xiàn)干擾素除具有廣譜抗病毒活性，還具有抑制細(xì)胞分裂，特別是抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)等功能，預(yù)示著干擾素作為一種生物活性蛋白有著良好的臨床價(jià)值。根據(jù)干擾素來(lái)源及其基因序列和氨基酸組成不同，可將干擾素分為型和型。型干擾素的表達(dá)細(xì)胞來(lái)源類似，包括干擾素-、和。用病毒等刺激外周血漿樣樹(shù)突細(xì)胞（pDCs）可以產(chǎn)生干擾素-、的13種亞型，3種干擾素-亞型和干擾素-，但是沒(méi)有型干擾素-。目前研究較多的是干擾素-、和（表26-1）。每一類干擾素根據(jù)蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸數(shù)量或氨基酸序列的不同分成不同的亞型，如干擾素-已知有至少24種亞型，其中包括干擾素-2a、干擾干擾素-1b、干擾素-2b、干擾素-2c等。 表26-1 干擾素的分類種類亞型細(xì)胞源穩(wěn)定性產(chǎn)生條件應(yīng)用干擾素-24種白細(xì)胞類淋巴細(xì)胞pH2穩(wěn)定，56穩(wěn)定病毒等誘導(dǎo)抗病毒、抗腫瘤干擾素-2種成纖維細(xì)胞pH2穩(wěn)定，56不穩(wěn)定病毒等誘導(dǎo)多發(fā)性硬化癥干擾素-1種T淋巴細(xì)胞pH2不穩(wěn)定，56不穩(wěn)定有絲分裂原和抗原誘導(dǎo)風(fēng)濕、免疫增強(qiáng)干擾素的分子量在1840kd之間，等電點(diǎn)6.57.5、干擾素比病毒顆粒小，在pH210范圍內(nèi)穩(wěn)定。沉淀病毒的離心力不能沉淀干擾素。干擾素對(duì)乙醚、氯仿敏感，容易吸附玻璃、淀粉、醋酸纖維素膜、瓊脂和塑料上。人干擾素-（IFN-）與IFN-一樣，屬于型干擾素，其基因位于第9號(hào)染色體上，與IFN-的基因連鎖在一起，基因內(nèi)部無(wú)內(nèi)含子。天然人IFN-由166個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為23kd，含有糖基，在成熟蛋白的第80位有一個(gè)N-連接糖基化位點(diǎn)，具有很強(qiáng)的疏水性。天然人IFN-分子中含有3個(gè)Cys，分別位于氨基酸序列的17、31和141位，第31和141位Cys之間形成的二硫鍵對(duì)于IFN-的生物學(xué)活性非常重要。第17位的半胱氨酸對(duì)于干擾素的分子空間結(jié)構(gòu)無(wú)明顯作用，用其它的氨基酸如Ser取代后，不但對(duì)其活性無(wú)影響，反而增加了穩(wěn)定性的活性。上市的重組人干擾素有重組人干擾素-、重組人干擾素-、重組人干擾素-三類。目前我國(guó)市場(chǎng)銷售的重組人干擾素-主要有重組人干擾素-1b、重組人干擾素-2a和重組人干擾素- 2b三種亞型，其中重組人干擾素- 2b生物活性高，其與相應(yīng)受體的結(jié)合率強(qiáng)，抗體發(fā)生率低，是目前國(guó)際公認(rèn)療效最好的重組人干擾素-，臨床應(yīng)用最為廣泛。重組人干擾素-多為重組人干擾素- Ser17，它是將天然干擾素-的17位Cys用Ser取代后在宿主細(xì)胞中表達(dá)的產(chǎn)物，其比活性和穩(wěn)定性超過(guò)大腸桿菌表達(dá)的人天然干擾素-。大腸桿菌表達(dá)的重組人干擾素-表觀分子量為18.5kd，等電點(diǎn)為6.58.5，對(duì)酸、堿穩(wěn)定。加入SDS、白蛋白、冷凍干燥后穩(wěn)定性進(jìn)一步增加。大腸桿菌表達(dá)的重組人干擾素-仍具有很強(qiáng)的疏水性。1973年，Younger和Salvia發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞上清液中存在一種干擾素，但抗原性不同于以往發(fā)現(xiàn)的干擾素，后被命名為干擾素-。人干擾素-（IFN-）由143個(gè)氨基酸組成，分子量為40kd ，分子內(nèi)無(wú)Cys，故無(wú)二硫鍵，其性質(zhì)與人IFN-和人IFN-有很大差異，對(duì)酸不穩(wěn)定，不耐熱。分子中含有很多堿性氨基酸，等電點(diǎn)超過(guò)pH8.6。1981年，Goeddle等克隆了干擾素-基因，隨后研制了重組人干擾素-(rhIFN-),、于1990年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于臨床，我國(guó)于1995年批準(zhǔn)用于臨床治療。干擾素的生物學(xué)活性相當(dāng)廣泛，主要包括廣譜抗病毒活性、直接抗腫瘤活性和免疫調(diào)節(jié)活性。 1干擾素的廣譜抗病毒活性病毒是專性活細(xì)胞內(nèi)寄生物，缺乏活細(xì)胞所具有的細(xì)胞器以及代謝所必需的酶系統(tǒng)和能量。繁殖所必需的原料、能量和生物合成的場(chǎng)所均由宿主細(xì)胞提供，在病毒核酸酶的控制下合成病毒的核酸和蛋白質(zhì)，然后在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)裝配成為成熟的、具有感染性的病毒顆粒，再以各種方式釋放至細(xì)胞外，感染其它細(xì)胞。病毒的復(fù)制可概括為吸附侵入脫殼生物合成裝配釋放。如果其中某一個(gè)階段受阻，可導(dǎo)致復(fù)制過(guò)程異?；蛑袛?，其結(jié)果是合成缺損病毒（低感染或無(wú)感染性）或不能合成病毒。干擾素抗病毒的作用機(jī)制有以下幾方面。 （1）抗病毒的作用過(guò)程 干擾素不能夠直接殺死病毒，它的抗病毒作用是通過(guò)干擾素分子與靶細(xì)胞相互作用，使其形成抗病毒狀態(tài)來(lái)完成的。這一過(guò)程包括：每個(gè)細(xì)胞表面約有干擾素受體1005000個(gè)，干擾素分子與靶細(xì)胞表面的干擾素受體特異性結(jié)合，通過(guò)受體進(jìn)行信號(hào)傳遞；激活了靶細(xì)胞內(nèi)抗病毒蛋白基因；活化的抗病毒蛋白基因被翻譯，合成抗病毒蛋白；由于抗病毒蛋白能夠切斷病毒mRNA和抑制病毒蛋白質(zhì)的翻譯，使靶細(xì)胞呈現(xiàn)抗病毒狀態(tài)。 已知的干擾素可以活化的抗病毒蛋白至少三種，它們是蛋白激酶、2-5A合成酶（2-5A synthetase,2-5AS）和磷酸二酯酶。這三種抗病毒蛋白的作用機(jī)制見(jiàn)圖26-1。 干擾素結(jié)合靶細(xì)胞受體激活 抗病毒基因表達(dá)抗病毒蛋白 2-5A合成酶 蛋白激酶 磷酸二酯酶eIF2 2-5 tRNA的pCpCpA 末端降解 核酸酶F激活 病毒蛋白合成 病毒mRNA降解 起始受阻 病毒蛋白轉(zhuǎn)錄抑制 細(xì)胞呈現(xiàn)抗病毒作用圖26-1 干擾素的抗病毒作用機(jī)制 （2）抑制病毒蛋白質(zhì)的合成 干擾素抑制病毒蛋白質(zhì)合成的過(guò)程包括：未活化的蛋白激酶被激活為活化的蛋白激酶；蛋白激酶將磷酸加到啟動(dòng)因子eIF2（真核生物起始因子2，病毒蛋白質(zhì)合成“發(fā)動(dòng)機(jī)”）上；磷酸化的eIF2失去活性，病毒蛋白合成無(wú)法啟動(dòng)，病毒的生物合成受阻，顯示出干擾素導(dǎo)致的抗病毒作用。（3）降解病毒的mRNA 2-5A合成酶的作用機(jī)制包括以下過(guò)程：未活化的2-5A合成酶被激活為活化的2-5A合成酶；2-5A合成酶催化ATP聚合成2-5A（2-5A在細(xì)胞內(nèi)的濃度可以增加1010000倍）；2-5A作為一種激活劑，將細(xì)胞內(nèi)殘核酸酶F(residue nuclease F)激活；殘核酸酶F對(duì)病毒的mRNA有專一性，在病毒mRNA分子上切開(kāi)12個(gè)切口，使其發(fā)生降解。由于病毒的mRNA被降解，不能為繼續(xù)合成病毒蛋白質(zhì)提供模板，于是顯示出干擾素導(dǎo)致的抗病毒作用。干擾素還能通過(guò)磷酸二酯酶參與的作用機(jī)制，抑制病毒蛋白的翻譯。干擾素抗病毒作用的特點(diǎn)是：干擾素不能殺死病毒，僅僅是抑制作用；干擾素對(duì)病毒沒(méi)有直接的作用，通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)的基因產(chǎn)生蛋白質(zhì)因子發(fā)揮作用，因此不同細(xì)胞對(duì)干擾素的敏感不同；病毒大量復(fù)制時(shí)引發(fā)細(xì)胞炎癥應(yīng)答，此時(shí)干擾素易產(chǎn)生作用；當(dāng)病毒DNA已整合到宿主細(xì)胞的染色質(zhì)中時(shí)，干擾素不能發(fā)揮其抗病毒活性。2干擾素抗腫瘤作用機(jī)制正常細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)按照程序分化、成熟的過(guò)程叫做細(xì)胞確定（cell defining）過(guò)程。細(xì)胞確定過(guò)程的最終結(jié)果是細(xì)胞程序化死亡。這就是細(xì)胞的一生分化、成熟、死亡。正常細(xì)胞受某些因素影響，離開(kāi)細(xì)胞確定過(guò)程，具有了無(wú)限繁殖能力和其它一些程序外（extra-program）特性，這種長(zhǎng)生不老的細(xì)胞就是轉(zhuǎn)化了的腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞獲得的程序外特性包括：無(wú)限繁殖能力，自身分泌生長(zhǎng)因子及生長(zhǎng)因子受體，并分泌黏多糖，屏蔽細(xì)胞間信號(hào)傳遞，接觸抑制現(xiàn)象消失；轉(zhuǎn)化能力，合成自身的調(diào)節(jié)蛋白，原有細(xì)胞性質(zhì)、形態(tài)改變；侵潤(rùn)能力；合成特殊酶系統(tǒng)，破壞組織結(jié)構(gòu)，擴(kuò)散轉(zhuǎn)移到其它組織。干擾素抗腫瘤的作用機(jī)制有以下幾方面。（1）直接抑制腫瘤細(xì)胞 干擾素抑制腫瘤細(xì)胞合成生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體及其它必需蛋白質(zhì)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化進(jìn)入細(xì)胞確定，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞為正常細(xì)胞。干擾素阻止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，保持基底膜完整。 （2）調(diào)節(jié)宿主抗腫瘤免疫反應(yīng) 干擾素促進(jìn)腫瘤細(xì)胞抗原的表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜上，存在腫瘤相關(guān)抗原（tumor-associated antigen A,TAA）、特異性腫瘤抗原（tumor special antigen, TSA）和白細(xì)胞相關(guān)性抗原，這些抗原是腫瘤細(xì)胞的標(biāo)志，使人體免疫系統(tǒng)的殺手（NK細(xì)胞、K細(xì)胞）易于找到并殺死腫瘤細(xì)胞。干擾素還能增強(qiáng)宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒（cell toxicity）作用。細(xì)胞毒作用是指效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞（病變細(xì)胞）的直接殺傷作用，而無(wú)需抗原等物質(zhì)介導(dǎo)。（3）改變宿主與腫瘤細(xì)胞的關(guān)系 干擾素抑制旁分泌生長(zhǎng)因子和近分泌生長(zhǎng)因子。干擾素分解腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)因子，如色氨酸。干擾素抑制腫瘤細(xì)胞伴生血管的生成。3干擾素的免疫調(diào)節(jié)活性免疫是機(jī)體識(shí)別和排除抗原異物，起維持機(jī)體的生理平衡和穩(wěn)定的功能。在正常情況下，免疫產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)，對(duì)機(jī)體有利；在異常情況下，免疫也會(huì)產(chǎn)生排斥性反應(yīng)，對(duì)機(jī)體造成損傷。免疫系統(tǒng)有三部分，免疫監(jiān)視系統(tǒng)、免疫防衛(wèi)系統(tǒng)和免疫自穩(wěn)系統(tǒng)。（1）干擾素對(duì)免疫監(jiān)視系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 免疫監(jiān)視的作用是處理發(fā)生突變的自身細(xì)胞。免疫監(jiān)視通過(guò)其效應(yīng)細(xì)胞發(fā)揮作用，這些免疫監(jiān)視效應(yīng)細(xì)胞是指對(duì)于突變細(xì)胞（例如癌細(xì)胞和被病毒感染的細(xì)胞等）具有直接殺傷作用的淋巴細(xì)胞，主要包括天然殺傷細(xì)胞（nature killing cell, NK細(xì)胞）、殺傷細(xì)胞（K細(xì)胞）和殺傷性T細(xì)胞（TK細(xì)胞）。其中NK細(xì)胞是免疫監(jiān)視系統(tǒng)中的最重要的效應(yīng)細(xì)胞。干擾素能夠增強(qiáng)監(jiān)視效應(yīng)細(xì)胞對(duì)病變細(xì)胞的直接殺傷作用。特別是對(duì)于NK細(xì)胞，干擾素不但可以活化前NK細(xì)胞和原NK細(xì)胞成為NK細(xì)胞，維持成熟型NK細(xì)胞的殺傷活性，又能夠進(jìn)一步激活成熟型NK細(xì)胞成為活化型NK細(xì)胞，而后者的殺傷活性和作用范圍都大于NK細(xì)胞。（2）干擾素對(duì)免疫防衛(wèi)系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 免疫防衛(wèi)的作用是排斥和消滅侵入的外源物質(zhì)，也就是抗感染免疫。干擾素對(duì)其中的體液免疫、細(xì)胞免疫和吞噬免疫均有調(diào)節(jié)作用。干擾素促進(jìn)抗體形成，抗體和病毒抗原特異結(jié)合，復(fù)合物被巨噬細(xì)胞吞噬。干擾素促進(jìn)T細(xì)胞與病毒（病變細(xì)胞）結(jié)合，使T淋巴細(xì)胞處于結(jié)合敏感態(tài)。干擾素增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)其細(xì)胞毒作用。（3）干擾素對(duì)免疫自穩(wěn)系統(tǒng)的調(diào)節(jié) 免疫自穩(wěn)的作用是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)自身，排除免疫代謝過(guò)程中產(chǎn)生的廢物和損傷、死亡的淋巴細(xì)胞，即機(jī)體的自我調(diào)節(jié)。自我穩(wěn)定。干擾素對(duì)免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)的作用效果包括：增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒、抗腫瘤能力；消除殘存腫瘤細(xì)胞，降低癌癥的轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率；提高機(jī)體免疫力，減少細(xì)菌感染和自體免疫紊亂的可能性。免疫缺陷癥患者，產(chǎn)生免疫相關(guān)的抗體，造成免疫系統(tǒng)的自我攻擊。干擾素抑制T淋巴細(xì)胞抗體的產(chǎn)生，恢復(fù)細(xì)胞免疫功能。干擾素的臨床應(yīng)用廣泛。干擾素在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起著非常重要的作用，在同種細(xì)胞上具有廣譜抗病毒、抗細(xì)胞分裂和免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性。干擾素有極高的生物學(xué)活性，1mg純品中含有數(shù)億個(gè)活性單位，據(jù)估計(jì)，少于十個(gè)或者只要有一個(gè)干擾素分子就可使細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒狀態(tài)。干擾素具有廣譜性和選擇性，它幾乎對(duì)所有病毒和腫瘤細(xì)胞有抑制作用，而且僅作用于病變細(xì)胞，對(duì)正常細(xì)胞影響極小，具有相對(duì)無(wú)害性。其在臨床上可用于：（1）抗病毒 干擾素-/能誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)多種肝炎病毒、鼻病毒、人乳頭瘤病毒、艾滋病病毒和多種RNA病毒產(chǎn)生抵抗力。干擾素-能夠增加免疫系統(tǒng)識(shí)別和殺傷感染細(xì)胞的能力，并能通過(guò)其它未知途徑抵抗病毒繁殖。干擾素已被探索或正式應(yīng)用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎、慢性丁型肝炎、復(fù)發(fā)性皰疹、帶狀皰疹、病毒性角膜炎、紅眼病、慢性宮頸炎、慢性盆腔炎、宮頸濕疣、肛門-生殖器扁平濕疣、尋常疣、巨細(xì)胞病毒、外陰前庭炎等疾病的抗病毒治療。 （2）治療腫瘤 干擾素是一種較理想的腫瘤抑制蛋白，它能調(diào)節(jié)正常的和惡性化的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。其對(duì)抗癌細(xì)胞增殖的作用主要有兩方面，一方面直接對(duì)抗癌細(xì)胞增殖，另一方面通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答間接抗腫瘤。干擾素已應(yīng)用于多種腫瘤治療，并取得了一定的療效，如白血病、艾滋病相關(guān)性Kaposi肉瘤、慢性髓樣白血病、非霍奇金淋巴瘤、皮膚T細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、表面膀胱瘤、肉瘤、卵巢瘤、腎細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺瘤、晚期直腸瘤、大腸瘤、食道瘤、非小細(xì)胞型肺癌、小細(xì)胞型肺癌等。（3）其它應(yīng)用 有報(bào)道用干擾素治療精子缺乏癥、多發(fā)性硬化癥、黃斑變性癥等。干擾素最常見(jiàn)的副作用為流感樣癥狀，如疲勞、厭食、惡心嘔吐、發(fā)燒、寒戰(zhàn)、頭疼、肌痛、腹瀉等。大多數(shù)反應(yīng)為輕微至中等，停止治療后可得到緩解，大部分患者都可耐受。長(zhǎng)期、高劑量使用時(shí)可出現(xiàn)骨髓抑制、消化道反應(yīng)、神經(jīng)系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)癥狀等，同時(shí)出現(xiàn)干擾素抗體。干擾素的開(kāi)發(fā)生產(chǎn)研究可以說(shuō)是幾經(jīng)波折。20世紀(jì)60年代主要是內(nèi)源性干擾素，尋找高效誘生劑。20世紀(jì)70年代主要為體外誘生干擾素，成功誘生人白細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞和類淋巴細(xì)胞等生成干擾素。當(dāng)時(shí)臨床研究使用的干擾素都是由仙臺(tái)病毒（Sendai）誘導(dǎo)人白細(xì)胞產(chǎn)生的，稱為人白干擾素。人白干擾素的生產(chǎn)需要大量的新鮮人血（提取1g干擾素-約需要3105L人血白細(xì)胞），來(lái)源非常困難，純化工藝復(fù)雜，收率低，價(jià)格昂貴，因而干擾素的產(chǎn)量有限，并且血源性干擾素容易被全血中的病毒污染，從而威脅使用者的健康，這些都嚴(yán)重地影響了干擾素在臨床上的使用價(jià)值。如何保證人體安全等技術(shù)措施難以解決，使人們一度對(duì)干擾素的應(yīng)用持懷疑態(tài)度。1975年Bechenhan Wellcome研究所設(shè)計(jì)了大規(guī)模干擾素的制備路線，并實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)。利用轉(zhuǎn)化細(xì)胞株代替人白細(xì)胞，經(jīng)病毒刺激后產(chǎn)生多種亞型混合的干擾素-。這種混合干擾素于20世紀(jì)80年代初批準(zhǔn)用于臨床，由于其生物活性較低，于20世紀(jì)90年代末退出臨床應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)基因工程技術(shù)，可在人體外大規(guī)模生產(chǎn)干擾素，即基因工程重組人干擾素。利用基因操作從人白細(xì)胞中克隆出干擾素-基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，從而獲得高效表達(dá)人干擾素-蛋白的工程菌。培養(yǎng)基因工程菌，干擾素基因在其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄、翻譯，工程菌經(jīng)發(fā)酵后可收集到大量菌體，將菌體破碎，進(jìn)而分離、純化，即得到高純度的干擾素-。1979年Taniguchi克隆了人干擾素基因，1980年Nagata等制備了人干擾素-2。大多數(shù)重組干擾素-是以大腸桿菌為宿主，表達(dá)產(chǎn)物為非活性包含體形式，使干擾素在來(lái)源上脫離了人血，并且純度和活性比人白干擾素有所提高，成本明顯降低，這就是第一代基因工程干擾素。但在生物合成、純化及制劑階段均使用了一些動(dòng)物或人血液提取成分，仍然沒(méi)有擺脫潛在的傳播血源性疾病的危險(xiǎn)。1986年Debaov等采用腐生型假單胞桿菌（Pseudomonas putida VG-84）為宿主，直接表達(dá)出具有天然分子結(jié)構(gòu)和生物活性的可溶性干擾素-2b，純化過(guò)程中淘汰了抗體親和色譜，制劑中采用非人血清白蛋白新型保護(hù)劑，使得整個(gè)制造過(guò)程中不使用任何血液提取成分，解決了第一代基因工程干擾素遺留的缺陷，干擾素生物活性和純度更高，這就是第二代基因工程干擾素。 1986年美國(guó)FDA批準(zhǔn)Roche公司基因工程干擾素-2a和Schering公司的干擾素-2b進(jìn)入市場(chǎng)，治療白血病。隨后又批準(zhǔn)治療Kaposi肉瘤和生殖器疣，擴(kuò)大了干擾素的應(yīng)用范圍。中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所、衛(wèi)生部長(zhǎng)春生物制品研究所、中國(guó)藥品生物制品檢定所合作研發(fā)了第一個(gè)基因工程產(chǎn)品，基因工程干擾素-1b滴眼液，于1990年進(jìn)入市場(chǎng)。其后又共同研發(fā)了基因工程干擾素-1b注射液和基因工程干擾素-2b注射液，于1992年進(jìn)入市場(chǎng)?；蚬こ谈蓴_素-注射液和天津華立達(dá)生物工程公司的基因工程干擾素-2b注射液也分別于1995年和1996年進(jìn)入市場(chǎng)，國(guó)外生產(chǎn)的基因工程干擾素主要品種我國(guó)都有生產(chǎn)。1993年我國(guó)干擾素銷售額1.9億元RMB，其國(guó)內(nèi)產(chǎn)品5%，其余為進(jìn)口產(chǎn)品。目前國(guó)內(nèi)已有30多家公司從事基因工程干擾素的生產(chǎn)和銷售，2000年國(guó)內(nèi)干擾素銷售額達(dá)10億元RMB，2005年已經(jīng)超過(guò)15億元RMB。目前干擾素全球年銷售額在20億美元左右。26.5.1.2 重組人干擾素生產(chǎn)技術(shù)和工藝重組人干擾素的生產(chǎn)主要包括工程菌的構(gòu)建、發(fā)酵、發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化及制劑加工等單元操作技術(shù)和工藝。下面以重組人干擾素-2b為例詳細(xì)介紹重組人干擾素的生產(chǎn)技術(shù)工藝，順便介紹下重組人干擾素干擾素-和的生產(chǎn)工藝。（一）重組人干擾素-2b的生產(chǎn)工藝技術(shù)1. 基因工程假單胞桿菌的構(gòu)建（1）干擾素基因的克隆 從感染新城疫病毒（new castle disease virus）人血白細(xì)胞中分離干擾素-基因的mRNA，由逆轉(zhuǎn)錄酶將Poly (A)RNA反轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈。再由DNA聚合酶的Klenow片段催化聚合形成cDNA第二條鏈。在dCTP存在條件下，利用末端轉(zhuǎn)移酶給cDNA加Poly(dC)尾，連接到質(zhì)粒pBC332上。轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并用氨芐青霉素和四環(huán)素篩選抗性克隆，獲得編碼人干擾素-2b的基因序列。（2）干擾素表達(dá)載體的構(gòu)建 把干擾素基因與宿主載體pAYC37連接，篩選出序列正確的表達(dá)載體pVG3。將表達(dá)載體導(dǎo)入假單胞桿菌(Pseudomonas putida VG-84)中，篩選的得到干擾素工程菌，表達(dá)重組人干擾素-2b不低于2.0109IU/L，并具有氨芐青霉素、四環(huán)素和鏈霉素的抗性。（3）基因工程菌應(yīng)具備的特性重組人干擾素-2b工程菌由人干擾素-2b基因的重組質(zhì)粒pVG3轉(zhuǎn)化腐生型假單胞菌(Pseudomonas putida VG-4)，該菌種由VNIIGENETIKA研究所構(gòu)建，生產(chǎn)用重組菌株經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)。基因工程菌株P(guān)seudomonas putida VG-84 pVG3應(yīng)該具有假單胞桿菌宿主細(xì)胞的特性和生產(chǎn)干擾素能力。1）宿主細(xì)胞假單胞桿菌特性細(xì)胞形態(tài) 革蘭陰性，可運(yùn)動(dòng)，有莢膜，無(wú)芽孢，桿狀，長(zhǎng)度35m。菌落特征 在LB瓊脂培養(yǎng)基上，30培養(yǎng)24h，其菌落為2.53.0mm，灰綠色半透明狀。菌落之間結(jié)構(gòu)相同，具有粘稠性。2）生化特征 不能將明膠、淀粉、聚-羥丁酸液化為可溶性單糖，不能利用反硝化作用進(jìn)行厭氧呼吸，能夠合成熒光色素。菌株為蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型，可以利用L-纈氨酸作為碳源。3）遺傳特性 DNA 中G+C含量為63%。細(xì)胞中攜帶pVG3質(zhì)粒，具有硫酸鏈霉素、鹽酸四環(huán)素和氨芐青霉素的抗性。4）生產(chǎn)能力 具有生產(chǎn)干擾素-2b的能力，其放射性免疫學(xué)效價(jià)不能低于2.0109IU/L。（4）菌種庫(kù)的建立及保存從原始菌種庫(kù)出發(fā)，傳代、擴(kuò)增后，凍干保存，作為主菌種庫(kù)，主菌種庫(kù)不得進(jìn)行選育工作。從主菌種庫(kù)傳代、擴(kuò)增后，甘油管保存，作為工作菌種庫(kù)。工作種子庫(kù)也可由上一代工作種子庫(kù)傳出，但每次只限傳三代。每批主菌種庫(kù)均進(jìn)行劃線LB瓊脂平板、涂片革蘭染色、對(duì)抗生素的抗性、電鏡檢查、生化反應(yīng)、干擾素的表達(dá)量、表達(dá)的干擾素型別、質(zhì)粒檢查的檢定，合格后方可投產(chǎn)。原始菌種庫(kù)、主菌種庫(kù)和工作菌種庫(kù)于-70以下溫度保存。（5）工作菌種庫(kù)的建立及保存1）培養(yǎng)基的制備 生產(chǎn)過(guò)程中使用的培養(yǎng)基均按一定工藝要求配制。2）接種、轉(zhuǎn)移及培養(yǎng) 取12支工作菌種庫(kù)或主菌種庫(kù)菌種接入搖瓶，搖床培養(yǎng)。吸光值（OD值）達(dá)5.51.0，將搖瓶種子液轉(zhuǎn)移至種子罐中，通入無(wú)菌空氣，培養(yǎng)至吸光值符合放灌要求（OD值為8.02.0）。種子罐培養(yǎng)結(jié)束后，無(wú)菌操作轉(zhuǎn)移到離心管中，離心15min，加新鮮菌種培養(yǎng)基，將菌體制成菌懸液，并加入甘油使其濃度達(dá)到18%，分裝于Ependorf管中，每支（1.00.2）mL。3）保存 分裝完畢，于-20放置1620h，在-70下可保存3年。2重組人干擾素-2b的發(fā)酵工藝及過(guò)程控制1）重組人干擾素-2b的發(fā)酵工藝過(guò)程（1）菌種制備 取-70下保存的甘油管菌種（工作種子批），于溫室下融化。然后，接入搖瓶，制備溫度30，pH7.0，250r/min活化培養(yǎng)(182)h后，進(jìn)行吸光值測(cè)定和發(fā)酵液雜菌檢查。（2）種子罐培養(yǎng) 將已活化的菌種接入裝有30L培養(yǎng)基的種子罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0，級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧為30%，培養(yǎng)34h時(shí)，當(dāng)OD值達(dá)4.0以上時(shí)，轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中，進(jìn)行二級(jí)放大培養(yǎng)，同時(shí)取樣發(fā)酵液進(jìn)行顯微檢查和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。（3）發(fā)酵罐培養(yǎng) 將種子液通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，接種量10%，培養(yǎng)溫度30，pH7.0。級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速，控制溶解氧30%，培養(yǎng)4h。然后控制培養(yǎng)溫度20pH6.0，溶解氧60%，繼續(xù)培養(yǎng)56.5h。同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵液雜菌檢查，當(dāng)OD值達(dá)9.01.0后年，用5冷卻水快速降溫至15以下，以減緩細(xì)胞衰老?；蛘哐杆俳抵?0以下。（4）菌體收集 將已降溫至20以下的發(fā)酵液轉(zhuǎn)入連續(xù)流離心機(jī)，16000r/min離心收集。進(jìn)行干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性等項(xiàng)目的檢測(cè)。菌體于-20冰柜中保存時(shí)，不得超過(guò)12個(gè)月。每保存3個(gè)月，檢查一次活性。整個(gè)發(fā)酵工藝過(guò)程如圖26-2所示。生產(chǎn)菌種 接種 蒸汽滅菌菌種活化原料蒸汽滅菌配制培養(yǎng)基種子罐培養(yǎng) 蒸汽滅菌發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體冷凍保存離心菌體搜集發(fā)酵液降溫圖26-2 重組人干擾素-2b的發(fā)酵工藝流程2）重組人干擾素-2b的發(fā)酵過(guò)程控制(1)發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)與干擾素合成的關(guān)系 在假單胞菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，菌體在培養(yǎng)1.5h分裂速度最快，到3.5h開(kāi)始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5h之后，在4h達(dá)到最大，然后由于降解而迅速下降?？梢?jiàn)在發(fā)酵生產(chǎn)工藝中，假單胞桿菌的生長(zhǎng)和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)。(2)培養(yǎng)基組成 一般的，種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分宜豐富些，尤其是氮源的含量應(yīng)較高（即C/N低）。相反，對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基，氮源含量應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低（即C/N高）。假單胞桿菌在以水解酪蛋白、酵母粉等組成的營(yíng)養(yǎng)豐富的合成培養(yǎng)基中發(fā)酵時(shí)，由于培養(yǎng)基提供生長(zhǎng)所必需的碳、氮和磷源，因此生長(zhǎng)比在基本培養(yǎng)基要快?；蚬こ碳賳伟麠U菌在合成培養(yǎng)基上顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性，這主要是因?yàn)樵诨九囵B(yǎng)基上，基因工程菌和宿主菌的比生長(zhǎng)速率存在差異。假單胞桿菌發(fā)酵需有合適的生長(zhǎng)pH范圍。因此，要考慮到培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)能力，可用K2HPO4/KH2PO4緩沖液。(3)溶解氧 基因工程菌發(fā)酵要求培養(yǎng)液中有足夠的溶解氧，為了提高發(fā)酵罐的供養(yǎng)能力，往往需要增大攪拌轉(zhuǎn)速，增加空氣流量，或通入純氧。氧氣不足時(shí)，一般表現(xiàn)為乙酸、乙醇等發(fā)酵副產(chǎn)物的積累，同時(shí)造成菌體生長(zhǎng)、生產(chǎn)速率下降。Rimkeviciene等發(fā)現(xiàn)15%的溶解氧就可滿足基因工程假單胞桿菌的生長(zhǎng)需求，但70%以上的溶解氧水平才能保證菌體中干擾素-2b的大量合成，其產(chǎn)量是15%溶解氧的6倍，而菌體生長(zhǎng)速率未發(fā)生明顯變化，質(zhì)粒穩(wěn)定性也有很大的提高。因此可采用兩段培養(yǎng)的策略，分別在生長(zhǎng)階段和生產(chǎn)階段采用各自最佳溶解氧濃度，以期提高干擾素的發(fā)酵水平。(4)溫度 假單胞桿菌你的生長(zhǎng)最適溫度與產(chǎn)物形成的最適溫度是不同的。穩(wěn)定而適中的溫度既能保證菌體細(xì)胞膜的完整和細(xì)胞中酶的催化活性，又有利于提高干擾素的產(chǎn)量。基因工程假單胞桿菌發(fā)酵溫度控制在20可以有效防止干擾素-2b的降解，而其最佳生長(zhǎng)溫度則是30。質(zhì)粒的穩(wěn)定性隨溫度的升高而迅速降低，因此在培養(yǎng)后期降溫可以減少目標(biāo)產(chǎn)物的降解。(5)pH值 發(fā)酵過(guò)程中，pH的變化由工程菌的代謝、培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵條件所決定。有研究表明，干擾素-的等電點(diǎn)在pH6.0附近，在低酸性條件下穩(wěn)定，能耐受pH2.5的酸性環(huán)境，因此可在發(fā)酵后期降低pH，從而造成大量蛋白酶失活，減少干擾素-的水解，提高干擾素的積累量。(6)發(fā)酵過(guò)程中泡沫形成與控制 發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)含有各種易產(chǎn)生泡沫的蛋白質(zhì)，它們與通氣攪拌所產(chǎn)生的小氣泡混合，使發(fā)酵產(chǎn)生一定數(shù)量的泡沫。隨著菌體繁殖，使整個(gè)發(fā)酵過(guò)程形成過(guò)多和穩(wěn)定持久的泡沫?？刹捎脵C(jī)械攪拌和加入少量表面活性劑來(lái)消除泡沫。3. 重組人干擾素-2b的分離純化工藝及過(guò)程控制干擾素的分離與純化