嬲 目錄 一、中文摘要 中文論著摘要1 英文論著摘要4 二、英文縮略語8 三、論文 前言b oo go od o doqo 9 刖吾9 資料來源與研究方法1 1 研究結(jié)果與討論1 7 結(jié)論與建議2 3 四、本研究創(chuàng)新型自我評價(jià)2 4 五、參考文獻(xiàn)2 5 六、附錄 綜述2 9 在學(xué)期間科研成績4 0 致謝4 1 個(gè)人簡介4 2 內(nèi)a p p 和p r e s e n i l i n1 背景及目的 阿爾茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 是一種進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行 性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為記憶減退、認(rèn)知障礙及人格改變等，常發(fā)生于老年和 老年前期。a d 的主要病理學(xué)特征為淀粉樣前體蛋白( 1 3 - a m y l o i d p r e c u r s o r p r o t e i n ， a p p ) 裂解生成的淀粉樣蛋白( p a m y l o i dp e p t i d e ，a p ) 沉積于腦內(nèi)形成的老年斑 ( s e n i l ep l a q u e ，s p ) 、腦血管內(nèi)淀粉樣沉淀和大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)( n e u r o f i b r i l l a r y t a n g l e s ，n f t ) 并伴隨神經(jīng)元數(shù)量減少，大多學(xué)者認(rèn)為a d 與腦內(nèi)a b 的沉積有密 切聯(lián)系，但詳細(xì)發(fā)病機(jī)制仍不清楚。a d 有家族性和散發(fā)性兩種，到目前為止已確 定與a d 有關(guān)的基因共有4 個(gè)，分別是載脂蛋白e ( a p o l i p o p r o t e i ne ，a p o e ) 、淀 粉樣前體蛋白( a p p ) 、早老素l ( p r e s e n i l i n1 ，p s l ) 和早老素2 ( p r e s e n i l i n2 ， p s 2 ) 基因，其中a p p 和p s l 是目前認(rèn)為與a b 產(chǎn)生直接相關(guān)的兩個(gè)蛋白，a p p 是a p 產(chǎn)生的“原材料 ，p s l 是組成切割a p p 的丫分泌酶的核心活性成分。近年 來，有學(xué)者經(jīng)臨床病例及動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)a d 患者都存在a p p 和p s l 的過表達(dá)， 并且對敲除p s l 基因的小鼠進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其腦內(nèi)丫分泌酶活性降低8 0 ，a p 含量大大降低。 目前，臨床上廣泛使用中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿酯酶抑制劑對a d 患者進(jìn)行治療以 延緩患者因腦中大量膽堿能神經(jīng)元缺失而出現(xiàn)的各種癥狀，但這只是一種治標(biāo)不 治本的療法。所以，研究人員根據(jù)a p 在a d 發(fā)生過程中的主軸作用及a p 的產(chǎn)生 過程提出在對a d 的預(yù)防與治療方面，應(yīng)以干預(yù)a p 的產(chǎn)生為根本目的，因而提出 了包括抑制a b 的聚集及毒性，加速a 1 3 的代謝，抑制a p p 的表達(dá)，調(diào)節(jié)a p p 的 酶解通路以減少a p 形成( 如上調(diào)a 分泌酶活性，降低丫分泌酶活性) 等多種方 案，從已有的研究結(jié)果看，下調(diào)a p p 的表達(dá)和降低y 分泌酶活性是當(dāng)前研究的熱 點(diǎn)也最具治療應(yīng)用前景，但相關(guān)抑制劑的過度抑制也一直困擾著研究人員，所以 尋找適度的抑制劑成了主要的任務(wù)。 尼古丁( n i c o t i n e ) ，又名煙堿，是煙草中的主要生物堿，流行病學(xué)家發(fā)現(xiàn)吸 煙人群中a d 的發(fā)生率顯著低于正常人群，尼古丁是降低a d 發(fā)病率的主要成份， 并且已有研究還發(fā)現(xiàn)尼古丁暴露可以降低a p p 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)和腦血管a b 的沉 積。因此，本研究建立在尼古丁暴露小鼠動物模型的基礎(chǔ)之上來研究尼古丁暴露 對小鼠腦內(nèi)a p p 和p s l 表達(dá)是否有抑制作用。 材料和方法 一、動物分組與尼古丁暴露小鼠模型的制備 s p f 級雄性成年昆明種小鼠6 0 只，體重3 0 - a ：5 9 ，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中 心提供，隨機(jī)分為對照( c o n ) ，生理鹽水( s a l ) 、實(shí)驗(yàn)一( t e s l ) ，實(shí)驗(yàn)二( t e s 2 ) 和實(shí)驗(yàn)三( t e s 3 ) 5 組，中國醫(yī)科大學(xué)發(fā)育生物學(xué)教研室s p f 級動物房飼養(yǎng)。實(shí) 驗(yàn)組每天背部皮下注射生理鹽水稀釋的尼古丁溶液0 1 m l ( s i g m a ) ，尼古丁注射總 量為3 m g k g ，c o n 正常飼養(yǎng)，s a l 組每日同時(shí)注射等量生理鹽水，t l 給藥1 0 天， t 2 給藥2 0 天，t 3 給藥4 0 天，建立尼古丁暴露模型。實(shí)驗(yàn)各組及生理鹽水組分 別在給藥結(jié)束當(dāng)天處死6 只取腦，無菌0 0 1 mp b s 沖洗后7 0 。c 凍存；另外6 只經(jīng) 灌流后取腦，經(jīng)固定、脫水、透化后石蠟包埋并連續(xù)切片。 二、檢測成年昆明小鼠大腦內(nèi)a p p 和p s l 表達(dá)的變化 1 、r t - p c r 方法檢測小鼠大腦內(nèi)a p p 和p s lm r n a 表達(dá)情況。 2 、蛋白質(zhì)免疫印跡( w e s t e r n - b l o t ) 方法檢測小鼠大腦內(nèi)a p p 和p s l 表達(dá)情況。 3 、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法檢i 貝i j p s l 在小鼠大腦內(nèi)分布的部位。 結(jié)果 一、r t p c r 方法檢測結(jié)果 t e s l 組、t e s 2 組、t e s 3 組中p s lm r n a 表達(dá)水平與對照組相比顯著降低 ( p 0 0 5 ) ；t e s l 組、t e s 2 組、t e s 3 組中a p pm r n a 的表達(dá)水平與對照組相比未見 2 顯著差異。 二、w e s t e r nb l o t 方法檢測結(jié)果 t e s l 組、t e s 2 組、t e s 3 組中p s i 表達(dá)水平與對照組相比明顯降低( p 0 0 5 ) ； t e s l 組、t e s 2 組、t e s 3 組中a p p 的表達(dá)水平與對照組相比未見顯著差異。 三、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 在對照組中可見大量p s i 陽性細(xì)胞分布于大腦皮層、海馬齒狀回內(nèi)板和齒狀回 多形層及兩者之間的神經(jīng)纖維也有成團(tuán)塊狀的陽性物分布、海馬的細(xì)胞層也可見 有呈棕褐色著色的陽性細(xì)胞分布，第三腦室周圍的下丘腦弓狀核、結(jié)節(jié)乳頭體腹 側(cè)核、乳頭體外側(cè)核、乳頭體前核和乳頭體內(nèi)核也有許多陽性細(xì)胞分布；實(shí)驗(yàn)組 僅見第三腦室周圍的下丘腦弓狀核、結(jié)節(jié)乳頭體腹側(cè)核、乳頭體外側(cè)核、乳頭體 前核和乳頭體內(nèi)核部位有p s l 陽性細(xì)胞分布。 結(jié)論 1 、尼古丁暴露對成年昆明小鼠大腦內(nèi)a p p 的表達(dá)未見有影響。 2 、尼古丁暴露可以抑制成年昆明小鼠大腦皮層、海馬細(xì)胞層、海馬齒狀回內(nèi) 板和齒狀回多形層及兩者之間纖維區(qū)域中p s l 的表達(dá)。 3 、尼古丁暴露對第三腦室周圍的下丘腦弓狀核、結(jié)節(jié)乳頭體腹側(cè)核、乳頭體 外側(cè)核、乳頭體前核和乳頭體內(nèi)核等部位p s i 的表達(dá)未見有影響。 關(guān)鍵詞 尼古丁大腦a p pp r e s e n i l i n1 小鼠 3 英文論著摘要 t h ee f f e c to fn i c o t i n ee x p o s u r et ot h ee x p r e s s i o no f a p pa n dp r e s e n i l i n1i nt h ec e r e b r u m o fa d u l t k u n m i n gm i c e b a c k g r o u n d a n d p u r p o s e a l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d ) i st h ep r o g r e s s i v ed e g e n e r a t i v ed i s e a s eo fc e n t r a l n e r v o u ss y s t e m ，w h o s em a i nc l i n i c a lm a n i f e s t a t i o n si sm e m o r yi m p a i r m e n t ，c o g n i t i v e i m p a i r m e n ta n dp e r s o n a l i t yc h a n g e se t c i to f t e no c c u r si nt h ep r e a g e do rd d e f ly t h e m a i np a t h o l o g i c a lf e a t u r e so fa da r et h ef o r m a t i o no ft h e s e n i l ep l a q u ew h i c hi s c o n s t i t u t e db yt h ed e p o s i t i o no f1 3 - a m y l o i dp e p t i d ei nt h eb r a i nw h i c hi sd e r i v e df r o m t h ec l e a v a g eo ft h ea m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，t h ea m y l o i dd e p o s i t i o ni nt h ec e r e b r a l v e s s e l sa n dt h ed e c r e a s eo ft h en u m b e ro fn e u r o n sw h i c h d u et ot o om u c h n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e sf o r m e di nt h en e u r o n s t h em e c h a n i s mo ft h ep a t h o g e n e s yi sn o t v e r yc l e a rs of a r m o s to ft h ei n v e s t i g a t o r st h i n kt h a ti ti sc o r r e l a t e dw i t ht h ed e p o s i t i o n o fa 3c l o s e l y t h e r ea r et w ok i n d sa l z h e i m e r sd i s e a s e ，f a m i l i a la n ds p o r a d i c ，t h e ya l l c o r r e l a t ew i t ht h eg e n e t i c s s of a r , w eh a v ec o n f i r m e d4g e n e sw h i c ha r ec o r r e l a t e d w i t ha d t h e ya r et h ea p o l i p o p r o t e i ne ( a p oe ) ， 3 - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ( a p p ) ， p r e s e n i l i n i ( p s l ) a n dp r e s e n i l i n2 ( p s 2 ) g e n e sr e s p e c t i v e l y t h e r e a r ed i r e c t c o r r e l a t i o n sb e t w e e na p p , p s1a n dt h ea d a p pi st h er a wm a t e r i a lo fa 1 3 ，a n dt h ep si i st h ec o r ec o m p o n e to ft h e 丫- s e c r e t a s ew h o s em a i nf u n c t i o ni st oc u ta p pa n dg e n e r a t e t h ea p r e c e n t l y , s o m er e s e a r c h e rd e e mt h a tt h e r ei so v e r e x p r e s s i o no ft h ea p pa n d p s1i nt h ea dv i at h er e s e a r c ho ft h ec l i n i c a lc a s e sa n dt h ee x p e r i m e n t a la n i m a ls t u d y , m o r e o v e r , t h e r ei se n z y m i ca c t i v i t yd e c r e a s eo ft h e7 - s e c r e t a s eb y8 0 a n dam a g n i t u d e d e c r e a s eo f t h ea m o u n to f a l bi nt h eb r a i no f t h ep s lg e n ek n o c k - o u tm i c e s ot h e r ei sa p o p u l a rv i e ww h i c hc o n s i d e rt h a ta dm a yb er e l a t e dt ot h ea b n o r m a le x p r e s s i o no f 4 a g g r e g a t i o na n dt o x i c i t y , t os p e e du pt h em e t a b o l i s mo fa 1 3 ，t oi n h i b i tt h ee x p r e s s i o no f a p pa n dt h er e g u l a t i o no fa p p e n z y m a t i cp a t h w a y si no r d e rt or e d u c ea bf o r m a t i o n ( s u c ha sr a i s i n gt h e0 【一s e c r e t o r ya c t i v i t y , a n dr e d u c e da c t i v i t yo f7 一s e c r e t a s e ) e t c f r o m t h er e s e a r c hr e s u l t s ，r e d u c i n gt h ee x p r e s s i o no fa p pa n dr e d u c i n gy - s e c r e t a s ea c t i v i t yi s t h em o s td i r e c ta n de f f e c t i v ew a ya n da l s oi st h eh o t s p o ti nt h ec u r r e n ts t u d y , b u tt h e e x c e s s i v ei n h i b i t i o no ft h ei n h i b i t o r sh a sp e r p l e x e dr e s e a r c h e r s ，f i n d i n ga na p p r o p r i a t e i n h i b i t o r sh a v eb e c o m et h em a i nt a s k n i c o t i n ei st h em a j o ra l k a l o i di nt o b a c c o ，e p i d e m i o l o g i s t sf o u n dt h a ts m o k e r si n t h ei n c i d e n c eo fa dw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h en o r m a lp o p u l a t i o n ，a n dt h e n i c o t i n ei st h em a i nf u n c t i o n a lm a t e r i a lt or e d u c et h ei n c i d e n c eo f a d a n o t h e rs t u d y h a sf o u n dt h a tn i c o t i n ee x p o s u r ec a nr e d u c et h ea pd e p o s i t i o ni nt h eb r a i na n dc e r e b r a l v a s c u l a ri nt h ea p pt r a n s g e n i cm o u s e ，b u ti t sd e t a i lm e c h a n i s m sa r es t i l lu n c l e a r s o ， t h i ss t u d yb a s e so nt h em i c e m o d e l so fn i c o t i n ee x p o s u r et oi n v e s t i g a t ew h e t h e rt h e r ei s e f f e c to fn i c o t i n et or e d u c et h ee x p r e s s i o no f a p pa n dp s1 m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 1 a n i m a l sg r o u pa n dt h ep r e p a r a t i o no f m i c em o d e l so fn i c o t i n ee x p o s u r e 6 0s p fl e v e lm a l ea d u l tk u n m i n g m i c e ，w e i g h t3 04 - 5 9 ，s u p p l yb yt h el a b r o t o r y a n i m a lc e n t e ro fc h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y , d i v i d e di n t oc o n t r o l ( c o n ) ，s a l i n e ( s a l ) ， e x p e r i m e n t1 ( t e s1 ) ，e x p e r i m e n t2 ( t e s 2 ) a n de x p e r i m e n t3 ( t e s 3 ) 5g r o u p sr a n d o m l y , t h e ya r eb r e e d e di nt h es p fl e v e la n i m a lb r e e d i n gr o o mo fd e p a r t m e n to f d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y , c h i n am e d i c a lu n i v e r s i t y e x p e r i m e n t a lg r o u p sw e r ei n j e c t e d o fn i c o t i n es o l u t i o n0 1m l ( s i g m a ) ，t o t a lv o l u m ed o s ei s3 m g k gw h i c hw a sd i l u t e dw i t h n o r m a ls a l i n ed a i l y c o n t r o lw a sn o r m a l l y f e e d i n g ，s a l i n eg r o u pw e r ed a i l yi n j e c t e dt h e s a m ev o l u m eo fn o r m a ls a l i n e ，t1a d m i n i s t e r e df o r10d a y s ，t 2a d m i n i s t e r e df o r2 0 d a y sa n dt 3a d m i n i s t e r e d4 0d a y st oe s t a b l i s hm o d e l so fn i c o t i n ee x p o s u r e s i xm i c eo f t h ee x p e r i m e n t a lg r o u p sa n ds a l i n eg r o u pw e r es a c r i f i c e di nt h ee n do ft h e a d m i n i s t r a t i o nd a y , c e r e b r u m sw e r er e m o v e da n da f t e rw a s h e dw i t ht h es t e r i l e0 01m p b sa n d - 7 0 c r y o p r e s e r v a t i o n ；a n o t h e rs i xw e r e p e r f u s e dw i t h4 p a r a f o r m a l d e h y d e ，c e r e b r u mw a sr e m o v e da f t e rf i x a t i o n ，d e h y d r a t i o n ，b u r i e dw i t h p a r a f f i nt h o r o u g h l ya n dc o n s e c u t i v es l i c e s 2 d e t e c t i o nt h ee x p r e s s i o nc h a n g e so ft h ea p pa n dp s1i n k u n m i n gm i c e ( 1 ) r t - p c rt od e t e c tt h em r n ae x p r e s s i o no f a p pa n dp si ( 2 ) w e s t e r nb l o tw a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f a p pa n dp s1 ( 3 ) i m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gt oo b s e r v et h ee x p r e s s i o no fp s1i nm o u s e c e r e b r u md i s t r i b u t i o n r e s u l t s 1 w i t ht h em e t h o do f r t - p c r ，t h em r n ao f p s li sd e c r e a s e 0 0 5 ) i nt h et 1 ， t 2a n dt 3c o n t r a s tt ot h ec o n t r o l ，a n dt h e r ei sn od i f f e r e n c eo ft h ee x p r e s s i o no fa p p m r n a 2 t h ee x p r e s s i o no fp s1i sr e d u c t i o nq 0 0 5 ) i nt h et 1 ，t 2a n dt 3c o n t r a s tt ot h e c o n t r o l ，a n dt h e r ei sn od i f f e r e n c eo ft h ee x p r e s s i o no f a p pb yw e s t e mb l o t 3 i nt h ec o n t r o l ，t h e r ei sal o to fp s1p o s i t i v es u b s t a n c ed i s t r i b u t i n gi nt h ec o d e x ， i b1 ，p o d ga n dt h ed o m a i nb e t w e e ni b1a n dp o d gw h i c hp o s s i b l yl o c a t ei nt h en e r v e f i b e r s ，c e l ll a y e ro ft h eh i p p o c a m p u sa n dt h ed o m a i no fa r c m p , v t m ，l m ，p m da n d m li nt h ep e r i p h e r yo ft h em i r dv e n t r i c l e ；w h e r e a st h e r ei sp s 1p o s i t i v ec e l l si nt h e d o m a i no fa r c m p , v t m ，l m ，p m da n dm li nt h ep e r i p h e r yo ft h et m r dv e n t r i c l ei n t h et e s tg r o u p so n l y 6 c o n c l u s i o n 1 t h e r ei sn oe f f e c to ft h en i c o t i n ee x p o s u r et ot h ee x p r e s s i o no fa p pi nt h e c e r e b r u mo ft h ea d u l tk u n m i n gm i c e 2 t h ee f f e c to ft h ee x p o s u r eo fn i c o t i n ei n h i b i t st h ee x p r e s s i o no fp s1i nt h e c o r t e x ，i b1 ，p o d ga n dt h ed o m a i nb e t w e e ni b1a n dp o d ga n dt h ec e l ll a y e ro ft h e h i p p o c a m p u ss e l e c t i v e l y 3 t h e r ei sn oe f f e c to ft h ee x p o s u r eo fn i c o t i n et ot h ee x p r e s s i o no fp s1i nt h e d o m a i no fa r c m p ，v t m ，l m ，p m da n dm li nt h ep e r i p h e r yo ft h et h i r dv e n t r i c l e k e y w o r d s n i c o t i n e ，m o u s e ，c e r e b r u m ，p r e s e n i l i n1 ，a p p 7 英文縮略語 英文縮寫英文全稱中文全稱 a d a l z h e i m c r sd i s e a s e阿爾茨海默病 a p p 1 3 - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n淀粉樣蛋白前體蛋白 a p1 3 - a m y l o i dp e p t i d ep 淀粉樣蛋白 s ps e n i l ep l a q u e老年斑 n f t n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s神經(jīng)原纖維纏結(jié) a o p ea p o l i p o p r o t e i ne載脂蛋白e p s lp r e s e n i l i nl早老素1 p s 2p r e s e n i l i n2早老素2 8 性疾病，常發(fā)生于老年和老年前期。a d 的主要病理學(xué)特征為淀粉樣前體蛋白 ( p - a m y l o i dp r e c u r s o rp r o t e i n ，a p p ) 裂解生成的淀粉樣蛋白( p a m y l o i dp e p t i d e ， a s ) 沉積腦內(nèi)形成的老年斑( s e n i l ep l a q u e ，s p ) ，腦血管內(nèi)淀粉樣沉淀和大量神 經(jīng)原纖維纏結(jié)( n e u r o f i b r i l l a r yt a n g l e s ，n f t ) 并伴隨神經(jīng)元數(shù)量減少【1 1 。a d 有家 族性和散發(fā)性兩種，到目前為止已確定與a d 有關(guān)的基因有4 個(gè)，分別是載脂蛋 白e ( a p o e ) 、淀粉樣蛋白前體( a p p ) 、早老素1 ( p r e s e n i l i n1 ) 和早老素2 ( p r e s e n i l i n 2 ) 基因，其中a p p 和p s l 是目前認(rèn)為與a p 直接相關(guān)的兩個(gè)蛋白，a p p 是a d 產(chǎn)生的“原材料”，p s l 是組成切割a p p 的y 分泌酶的核心活性成分1 2 , 3 】。近年來 經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)【4 ，5 1 及r t - p c r 方法【6 7 】的研究發(fā)現(xiàn)a d 患者都存在著a p p 和p s i 基因 的過表達(dá)，敲除編碼p s l 基因的小鼠腦內(nèi)丫分泌酶的活性降低約8 0 ，a p 含量 大大降低【引。 目前，臨床上廣泛使用中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿酯酶抑制劑對a d 患者進(jìn)行治療【9 】 以延緩a d 患者因腦內(nèi)大量膽堿能神經(jīng)元缺失而出現(xiàn)的各種癥狀，但這只是一種 治標(biāo)不治本的療法。研究人員根據(jù)a s 在a d 發(fā)生過程中的作用及a s 產(chǎn)生過程提 出，在對a d 的預(yù)防與治療方面應(yīng)該以干預(yù)a s 的產(chǎn)生為根本目的，因而提出了包 括抑制a s 的聚集及毒性，加速a s 的代謝，抑制a p p 的表達(dá)，調(diào)節(jié)a p p 的酶解 通路以減少a s 形成( 如上調(diào)洳分泌酶活性，降低丫分泌酶活性) 等多種方案， 從已有的研究結(jié)果看，下調(diào)a p p 的表達(dá)和降低丫- 分泌酶活性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)也 最具治療應(yīng)用前景【1 仉15 1 ，但y 分泌酶作為一種具有廣泛作用的天冬氨酰蛋白酶被 完全抑制后必將導(dǎo)致嚴(yán)重后果，尋找適度的1 分泌酶抑制劑成了目前研究a d 防 9 治方法的主要任務(wù)之一【1 6 】。 尼古丁( n i c o t i n e ) ，又名煙堿，是煙草中的主要生物堿，流行病學(xué)家發(fā)現(xiàn)吸煙 人群中a d 的發(fā)病率顯著低于i f 常人群【1 7 】，因?yàn)槟峁哦∫彩且环N中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽 堿能神經(jīng)激活劑，對延緩a d 癥狀有一定作用【1 8 】，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)尼古丁暴露可 以降低a p p 轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)和腦血管a d 的沉積【19 1 。尼古丁暴露是否會對與a d 密切相關(guān)的a p p 和p s l 的表達(dá)產(chǎn)生影響尚未見報(bào)道，為此，本研究建立在尼古丁 暴露小鼠動物模型的基礎(chǔ)之上，應(yīng)用r t - p c r 、蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組織化學(xué)染 色的方法來研究尼古丁暴露是否對小鼠大腦內(nèi)a p p 和p s l 表達(dá)有抑制作用，以闡 明尼古丁在抗a d 過程中的作用機(jī)制，為將來的藥物研制提供新思路。 資料來源與研究方法 一、資料來源 ( 一) 實(shí)驗(yàn)動物來源及分組 s p f 級雄性昆明種小鼠6 0 只，體重3 0 a ：5 9 ，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提 供，隨機(jī)分為對照( c o n ) ，生理鹽水( s a l ) 、實(shí)驗(yàn)一( t e s l ) ，實(shí)驗(yàn)二( t e s2 ) 和 實(shí)驗(yàn)三( t e s3 ) 5 組，中國醫(yī)科大學(xué)發(fā)育生物學(xué)教研室s p f 級動物房飼養(yǎng)。 ( 二) 主要試劑 尼古丁( s i g m a ) 羊抗 i - a c t i n 多克隆抗體( s a n t ac r u z ) 兔抗p s l 多克隆抗體( 武漢博士德) ； 羊抗兔i g g 二抗，兔抗羊i g g 二抗( 北京中杉金橋) ； s a b c 免疫組化染色試劑盒( 北京中杉金橋) ； d a b 顯色試劑盒( 武漢博士德) ； t r i z o l ( i v i t r o g e n ) p m s f ( s i g m a ) r t - p c r 試劑盒( p r o m e g a ) ； r t a q 酶( t a k a r a ) ； 預(yù)染蛋白m a r k e r ( p r o m e g a ) ： 1 0 d n am a r k e r ( t a k a r a ) ； e c l 試劑盒( p i e r c e ) ； 引物( 南京金斯特) 其它常規(guī)試劑購自沈陽化學(xué)試劑采購供應(yīng)站。 ( 三) 主要儀器設(shè)備 小型臺式離心機(jī)( s i g m a1 1 3 ) 低溫高速離心機(jī)( s i g m a3 k 3 0 ) 7 2 2 可見光分光光度計(jì) 7 0 。c 超低溫冰箱( s a n y o ) 電子分析天平( s a r t o r i u s ) 水平搖床( 北京) 紫外分光光度計(jì)( 上海) 光學(xué)顯微鏡( o l y m p u s ) 石蠟切片機(jī)( l e i c a ) 電熱恒溫水浴箱( 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠) 垂直電泳槽( b i o r a d ) 瓊脂糖凝膠電泳裝置( 北京六一儀器廠) 凝膠成像分析系統(tǒng)( a l p h ai m a g e3 4 0 0 ) 層析冷柜( 北京六一儀器廠) 紫外分光光度計(jì)( b i o r a d ) 超純水裝置( m i l l p o r e ) 制冰機(jī)( z i g e r a ) p h 計(jì)( w t w h l f 0l a b ) 半干轉(zhuǎn)印儀( b i o r a d ) 磁力攪拌器( 中國d s h k 4 ) 渦旋振蕩器( v o r t e x 2 g e n e ) p c r 儀( b i o m e t r atg r a d i e n t ) 二、研究方法 0 1 m l ( 尼 鹽水，t 1 驗(yàn)各組分 情況 頸椎脫臼法處死小鼠，在冰上迅速切開皮膚剪開頭骨取出整個(gè)大腦，置于 7 0 冰箱凍存?zhèn)溆谩?取半個(gè)鼠腦放入高壓過的2 m l 離心管中，在加入l m lt r i z o l 后勻漿機(jī)中勻 漿l m i n ； 室溫靜置3 m i n 后加入氯仿2 0 0 1 并劇烈震蕩1 5 s ； 室溫靜置1 0 r a i n 后，1 2 0 0 0r p m4 。c 離心15 m i n ； 吸取水相入新管中，加入5 0 0 1 異丙醇； 室溫放置1 0 m i n 后，1 2 0 0 0 0 r p m4 。c 離心1 0 m i n ； 棄上清，加入7 5 7 , 醇，1 2 0 0 0 r p m4 。c 離心1 0 m i n ； 棄上清，室溫干燥5 m i n ，用適量高壓后d d h 2 0 溶解沉淀，紫外分光光度計(jì) 測定o d 2 6 0 值后定量分裝，于7 0 。c 保存。 2 、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系組成： 10 x r tb u f f e r 2 1 d n t pm i x t u r e ( 1 0 m m ) 1 2 5 1 r n a 酶抑制劑( 5 0 u i ) 0 5 1 隨機(jī)引物 2 1 總r n a 2 g m m l 、，逆轉(zhuǎn)錄酶 1 2 5 山 d d h ：2 0 使總體積為2 5 1 1 2 r n a 樣品和隨機(jī)引物混勻后7 0 。c 反應(yīng)5 m i n ，立即冰上孵育5 m i n ，再加入剩 余成份后2 5 c 保持1 0 m i n ，3 7 c 反應(yīng)l h ，4 c 終止反應(yīng)，2 0 保存。 3 、p c r 反應(yīng) 引物序列： a p p上游5 一g c c a t g t r c t g t g g t a aa 3 下游5 - c a a c t a g g c a a c g g t a a g 3 ( 2 5 6 b p ) p s1上游5 a g c c a a g a a c g g c a g c a g c a g c a t g a c a g g c a g a g 一3 下游5 - t a c t g a a a t c a c a g c c a a g a t g a g c c a t g c 一3 ( 6 7 2 b p ) g a p d h上游5 a c c a c a g t c c a t g c c a t c a c 3 下游5 一t c c a c c a c c c t g t t g c t g t a - 3 ( 4 5 2 b p ) p c r 反應(yīng)體系( 2 5 1 a i 體系) io x p c rb u f f e r 2 5 i t l d n t pm i x t u r e ( 10 m m ) 0 5 1 x l 上游引物1 1 d 下游引物 1r t l 模板( 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物) 2 山 t a q 酶o 5 1 a l 滅菌d d h 2 0 1 7 5 肛l p c r 條件：9 4 。c 預(yù)變性3 m i n ；9 4 c 變性3 0 s ，6 0 * c 退火3 0 s ，7 2 。c 延伸l m i n ， 2 9 個(gè)循環(huán)后7 2 延伸1 0 m i n ，4 c 終止。 每個(gè)反應(yīng)取1 0 1 d 樣品，進(jìn)行1 的瓊脂糖凝膠電泳，g a p d h 作為內(nèi)參照。目 的基因的r t - p c r 產(chǎn)物電泳帶亮度用b a n ds c a n 軟件分析，與g a p d h 表達(dá)水平相 比較作直方圖。 ( 三) w e s t e r nb l o t 檢測大腦內(nèi)a p p 和p r e s e n i l i n l 蛋白表達(dá)情況 1 、取材及樣品蛋白質(zhì)提取 頸椎脫臼法處死小鼠，剪開皮膚，打開顱骨，取出大腦，用預(yù)冷的o 0 1 mp b s 洗凈后取出放入2 m l 離心管中，并加入r i p a b u f f e r ( 1 n p 4 0 ，0 5 脫氧膽酸鈉， 1 3 0 1 s d s ，o 1 p m s f ) ，勻漿機(jī)勻漿l m i n ，置于冰上孵育3 0 m i n ，以1 2 0 0 0 r p m 離心1 0 m i n ，冰上取上清重復(fù)離心一次，分離上清。 2 、考馬斯亮藍(lán)蛋白質(zhì)定量 按照每管加入考馬斯亮藍(lán)g 2 5 0 染液( o 4 9 考馬斯亮蘭g 2 5 0 ，l o o m l9 5 e t h a n o l ，2 0 0 m l8 5 h 3 p 0 4 加去離子水至2 0 0 0 m l ，過濾后用已知濃度的b s a 計(jì)算 標(biāo)準(zhǔn)曲線，4 c 保存?zhèn)溆? 3 m l 、2 山樣品( 標(biāo)準(zhǔn)對照組為r i p a b u f f e r ) 、9 8 i ，l 1d d h 2 0 配置液體；在7 2 2 分光光度計(jì)上測定o d 5 9 5 值，根據(jù)測量結(jié)果以及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算 出樣品蛋白含量； 3 、灌制分離膠及濃縮膠 按常規(guī)方法灌制聚丙烯酰胺凝膠，分離膠濃度為1 1 ，濃縮膠為4 ； 4 、樣品制備及電泳 按照1 0 1 x l 體系、2 0 p g 總蛋白，終濃度1 x r e d u c i n gs a m p l eb u f f e r 5 x r e d u c i n g s a m p l eb u f f e r ：0 3 1 2 m i r i s _ h c l ( p h 6 8 ) ，1 0 s d s ，2 5 1 3 - 巰基乙醇，0 2 5 溴 酚藍(lán)，5 0 甘油 制備電泳樣品，不足體積用0 0 1 mp b s 補(bǔ)足，混勻后短暫離心， 沸水浴中保持5 m i n ，1 0 0 0 0 r p m 離心5 m i n ，微量加樣器逐個(gè)加樣1 0 r t l ，空白泳道 加入1 x r e d u c i n gs a m p l eb u f f e r1 0 i t l ，8 0 v 穩(wěn)壓電泳，當(dāng)溴酚蘭指示劑離開濃縮膠 后，加大電壓至1 1 0 v ，根據(jù)蛋白m a r k e r 的移動情況，盡量拉長目的蛋白所在的 區(qū)域，當(dāng)達(dá)到理想的分離效果后結(jié)束電泳。 5 、轉(zhuǎn)膜 將電泳后的膠取出，切去無用的部分，用t r a n s f e r b u f f e r ( t r i s3 0 3 9 ，甘氨酸 1 4 4 9 ，加去離子水8 5 0 m l ，再加1 5 0 m l 甲醇) 浸泡，置搖床平衡3 0 m i n ；戴手套 裁取p v d f 膜和轉(zhuǎn)膜濾紙，使之與膠的大小相同。將p v d f 膜依次浸入甲醇、0 0 1 m p b s 后，于t r a n s f e rb u f f e r 中平衡5 m i n ；在轉(zhuǎn)印前用t r a n s f e rb u f f e r 浸透濾紙，在 濕轉(zhuǎn)的底層電極板上依次鋪上濾紙、膠、p v d f 膜、濾紙；接通電源，1 0 0 v 轉(zhuǎn)印 l o o m i n ； 6 、封閉 1 4 入封 封閉 雜交 一抗 冷柜 中