實(shí)驗(yàn)四 DNA片段的序列測(cè)定,現(xiàn)代分子生物學(xué)大實(shí)驗(yàn),了解Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法基本原理 掌握Sanger雙脫氧終止法的原理 學(xué)習(xí)測(cè)定重組質(zhì)粒中外源DNA片段序列的基本原理和技術(shù)方法 學(xué)習(xí)使用毛細(xì)管序列測(cè)定儀進(jìn)行DNA序列測(cè)定的方法,實(shí)驗(yàn)?zāi)康?實(shí)驗(yàn)原理,DNA電泳 聚丙烯酰胺凝膠 瓊脂糖凝膠 Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法 Sanger 酶學(xué)法（雙脫氧鏈終止法）,Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法 1977年， A.M. Maxam 和 W. Gilbert 首先建立了 DNA 片段序列的測(cè)定方法。 將DNA 片段的 5端磷酸基作放射性標(biāo)記，再分別采用不同的化學(xué)方法修飾和裂解特定堿基，從而產(chǎn)生一系列長(zhǎng)度不一而 5 端被標(biāo)記的 DNA 片段，這些以特定堿基結(jié)尾的片段群通過(guò)凝膠電泳分離，再經(jīng)放射線自顯影，確定各片段末端堿基，從而得出目的 DNA 的堿基序列。,實(shí)驗(yàn)原理,Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法測(cè)序原理,Maxam-Gilbert化學(xué)降解法測(cè)序的常用化學(xué)試劑,實(shí)驗(yàn)原理,多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction) 簡(jiǎn)稱(chēng)PCR技術(shù) 體外擴(kuò)增特異DNA片段 操作簡(jiǎn)便，短時(shí)間, 數(shù)百萬(wàn)個(gè)特異的目的DNA序列的拷貝 PCR反應(yīng)成分 模板DNA(template) 引物(primer) 脫氧核苷酸(dNTP) DNA聚合酶(Taq) PCR反應(yīng)步驟 變性（denaturation） 退火（annealing） 延伸（extension ）,實(shí)驗(yàn)原理,變性（解鏈） 退火 延伸,DNA模板 引物 Taq酶 單核苷酸（dNTP),在高溫（93-95）下，DNA雙鏈?zhǔn)軣嶙冃猿蔀閮蓷l單鏈DNA模板；而后在低溫（3765）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補(bǔ)的單鏈DNA模板結(jié)合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點(diǎn)，以單核苷酸（dNTP)為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。 每一雙鏈的DNA模板，經(jīng)過(guò)一次變性（解鏈）、退火、延伸三個(gè)步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。 每一次循環(huán)所產(chǎn)生的DNA成為下一次循環(huán)的模板，PCR產(chǎn)物得以2n的指數(shù)形式迅速擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)2530個(gè)循環(huán)后，理論上可使基因擴(kuò)增109倍以上，實(shí)際上一般可達(dá)106107倍。,脫氧核糖核酸（dNTPs）,Sanger 雙脫氧鏈終止法 引入了雙脫氧核苷三磷酸（2,3-ddNTP）作為鏈終止劑 2,3-ddNTP與普通的dNTP不同之處在于前者的脫氧核糖的3位又少了個(gè)羥基。它可以在DNA聚合酶的作用下和多核苷酸鏈的3羥基形成磷酸二酯鍵，但卻不能再與下一個(gè)核苷酸縮合，結(jié)果使得多核苷酸鏈的延伸終止。 在DNA的合成反應(yīng)中，除了加入4種正常的dNTP外，再加入一種少量的ddNTP，反應(yīng)產(chǎn)物是一系列的長(zhǎng)短不一的核苷酸鏈。在4組獨(dú)立的DNA合成反應(yīng)中，分別加入4種不同的ddNTP，結(jié)果將生成4組核苷酸鏈，它們將分別終止于每一個(gè)A，每一個(gè)G，每一個(gè)C，每一個(gè)T的位置上。對(duì)這4組核苷酸鏈進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，就可讀出序列。,實(shí)驗(yàn)原理,Dr Fred Sanger, double Nobel laureate and developer of the dideoxy sequencing method, first published in December 1977,化學(xué)，1958年：測(cè)定胰島素分子的結(jié)構(gòu) 化學(xué)，1980年：核酸DNA序列的確定方法,DNA測(cè)序,毛細(xì)管自動(dòng)測(cè)序儀,測(cè)序儀的重大改進(jìn) 熒光染料代替了放射性核素 聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作自動(dòng)化 應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行收集和分析，測(cè)序之后可以直接從機(jī)器上讀出目的片段的序列。 從每次一個(gè)樣品（單毛細(xì)管）到96個(gè)或384個(gè)樣品（多組毛細(xì)管） 精確、規(guī)模、快速,毛細(xì)管自動(dòng)測(cè)序儀,同手工測(cè)序一樣，DNA聚合酶延伸反應(yīng)結(jié)束后，樣品經(jīng)簡(jiǎn)單變性處理就可以在測(cè)序凝膠中開(kāi)始電泳。 熒光自動(dòng)測(cè)序系統(tǒng)是以種熒光素分別標(biāo)記種ddNTP，PCR延伸反應(yīng)后產(chǎn)生的是4組由不同雙脫氧核苷酸終止的DNA片段，這四種熒光染料在激光激發(fā)下發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光，因而每一種熒光代表一種堿基，這使得它們都具有“特征的顏色”。 當(dāng)不同熒光標(biāo)記的DNA片段電泳經(jīng)過(guò)檢測(cè)窗口時(shí)，被激光激發(fā)出不同波長(zhǎng)的光線，CCD相機(jī)記錄結(jié)果，可對(duì)多個(gè)樣品同時(shí)檢測(cè)。,MegaBACE 毛細(xì)管自動(dòng)測(cè)序儀,實(shí)驗(yàn)設(shè)備,PCR儀 Megabase毛細(xì)管自動(dòng)測(cè)序儀 離心機(jī),Dye Terminator Cycle Sequencing（熒光染料標(biāo)記末端循環(huán)測(cè)序） 四種雙脫氧末端都分別用染料標(biāo)記作為供體染料的熒光素和作為受體染料的四種不同的熒光染料。,實(shí)驗(yàn)設(shè)備,測(cè)序儀,光源：波長(zhǎng)488nm的氬離子激光,雙脫氧末端,熒光素 + 四種不同的熒光染料 （供體染料） (受體染料),實(shí)驗(yàn)試劑,測(cè)序反應(yīng)試劑（DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit） 酶、dNTP、ddNTP混合物 Loading buffer（70% formamide,1 mM EDTA) 測(cè)序反應(yīng)緩沖液 測(cè)序膠 無(wú)菌水 測(cè)序引物：根據(jù)T-載體上的引物序列合成 7.5 mol/L NH4AC 無(wú)水乙醇 75%乙醇,實(shí)驗(yàn)步驟,測(cè)序PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系 H2O up till 10.0 L 10buffer 0.9 L DNA 200ng-1g primer(5M ) 1.0L 酶、dNTP 、ddNTP混合物 0.4 L 反應(yīng)條件 95 20sec 50 20sec 60 1min30sec 30個(gè)循環(huán),測(cè)序PCR反應(yīng)后處理（純化、濃縮、緩沖液置換） PCR產(chǎn)物中加入1L的4 mol/L NH4AC ，混勻，加入27.5L的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置min。 12000rpm，4，離心15 min 。 棄上清，70%乙醇洗一次，12000rpm，4，離心5 min 。 棄上清，室溫干燥30 min 。 加入10L Loading buffer，充分混勻，即可進(jìn)行序列測(cè)定。,實(shí)驗(yàn)步驟,實(shí)驗(yàn)步驟,按照操作手冊(cè)，利用毛細(xì)管自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行序列的測(cè)定 開(kāi)氮?dú)夤?，打開(kāi)測(cè)序儀，打開(kāi)電腦。 設(shè)定參數(shù)。 沖洗毛細(xì)管。 灌膠，預(yù)電泳。 上樣，電泳。 電泳后處理分析數(shù)據(jù)。 沖洗毛細(xì)管，關(guān)機(jī)。,注意事項(xiàng),準(zhǔn)確估計(jì)PCR反應(yīng)過(guò)程中質(zhì)粒模板的濃度，濃度過(guò)低，測(cè)序信號(hào)弱，得不到好的測(cè)序結(jié)果；濃度過(guò)高，引物峰出現(xiàn)晚，影響測(cè)定的序列長(zhǎng)度。 PCR反應(yīng)后的處理過(guò)程應(yīng)小心，不要丟棄沉淀。 NH4AC的加入是助沉作用，與PCR反應(yīng)產(chǎn)物混勻后再加入室溫的無(wú)水乙醇，室溫放置片刻等PCR反應(yīng)產(chǎn)物完全沉淀后再離心。 使用測(cè)序