DB51四川省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB51/T3245—2025前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14基本要求 15大熊貓組織庫構(gòu)建技術(shù) 26大熊貓精子庫構(gòu)建技術(shù) 27大熊貓?bào)w細(xì)胞庫構(gòu)建技術(shù) 3附錄A （資料性）大熊貓資源保存登記表5附錄B（資料性）大熊貓精液與體細(xì)胞資源保存相關(guān)試劑配制 8DB51/T3245—2025本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由四川省林業(yè)和草原局提出、歸口、解釋并組織實(shí)施。本文件起草單位：成都大熊貓繁育研究基地。本文件主要起草人：侯蓉、劉玉良、安俊輝、王東輝、陳依嬌、陳佳松、蔡志剛、王海瑞、李媛。DB51/T3245—20251大熊貓基因資源庫構(gòu)建技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了大熊貓組織、精液及體細(xì)胞的采集與保存技術(shù)要求。本文件適用于大熊貓基因資源庫的構(gòu)建。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T5458液氮生物容器GB/T40365細(xì)胞無菌檢測通則GB/T42398細(xì)胞培養(yǎng)潔凈室設(shè)計(jì)技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4基本要求4.1器具準(zhǔn)備及高溫滅菌4.1.1玻璃器皿玻璃器皿使用前宜放入5%稀鹽酸中浸泡12h，再用手工或超聲波清洗器在加有洗滌劑的溫?zé)崴羞M(jìn)行刷拭。洗凈的玻璃器皿用牛皮紙封口后進(jìn)行高壓濕熱滅菌（120。C，20min），干燥后待用。4.1.2金屬制品使用之前進(jìn)行高壓濕熱滅菌（120。C，20min），干燥后待用。4.1.3塑料制品槍頭高壓濕熱滅菌（120。C，20min），干燥后待用。4.1.4其他制品毛巾及紗布清潔后進(jìn)行高壓濕熱滅菌（120。C，20min），干燥后待用。膠塞、吸管膠頭、移液槍用75%酒精擦拭消毒，待酒精揮發(fā)盡后使用。4.2細(xì)胞分離培養(yǎng)工作區(qū)條件DB51/T3245—20252細(xì)胞分離培養(yǎng)工作區(qū)一般由緩沖間與無菌室組成。其中，緩沖間應(yīng)設(shè)有更衣柜和紫外燈，無菌室符合GB/T42398的要求，宜為萬級以上的層流室，應(yīng)配備超凈工作臺(tái)和紫外燈。紫外燈的強(qiáng)度為不少于1.5W/m3，紫外線燈管距地面不應(yīng)超過2.5m，使用前照射20min～30min。5大熊貓組織庫構(gòu)建技術(shù)5.1組織采集大熊貓死亡后，盡快獲取其各類組織樣本，宜優(yōu)先保存臟器組織（如心、肝、脾、肺、腎、卵巢、睪丸），用鑷子夾著組織在PBS、生理鹽水或無菌水中迅速漂洗樣本3次～5次，確保組織無明顯的血漬和污物。所有器械、器皿及溶液宜預(yù)先用DEPC處理，以避免RNA酶污染。5.2組織凍存將組織用眼科剪或手術(shù)剪剪成0.2cm3～0.5cm3大小的組織塊，裝入2mL凍存管中（管壁應(yīng)標(biāo)注樣本主要信息）。樣本宜在-80。C超低溫冰箱或液氮中冷凍保存。填寫大熊貓組織資源保存登記表（參見表A.1）。6大熊貓精子庫構(gòu)建技術(shù)6.1精液采集清理大熊貓直腸內(nèi)的糞便，對于位置較深而難以清理的糞便，用溫?zé)嵘睇}水灌腸清理殘余糞便。再用接近體溫的生理鹽水沖洗大熊貓的陰莖及包皮。電極棒加涂石蠟油后插入距直腸末端約1/3處并確保電極區(qū)抵住直腸上壁。調(diào)節(jié)電刺激采精儀，電壓2V～6V，一般采用1個(gè)～3個(gè)刺激系列，電刺激強(qiáng)度由低到高，每個(gè)刺激系列之間需間隔1min～5min，出現(xiàn)射精立刻停止刺激，將精液收集到集精杯中。6.2精液評估6.2.1精液采集后，對采精量、pH值、精子密度、精子活力、精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)及精子畸形率進(jìn)行檢測，并填寫大熊貓精液資源保存登記表（參見表A.2）。6.2.2采精量：使用移液槍量取獲得的精液總量。6.2.3pH值：使用精密pH試紙（測量區(qū)間為pH=6.4～9.7）測量精液的pH值。6.2.4精子密度：取5μL精液，添加995μL3%NaCl溶液，混合均勻后取10μL加入血球計(jì)數(shù)板（25×16型），在200×相差顯微鏡下計(jì)數(shù)。精子密度的計(jì)算公式為：密度=A×107個(gè)/mL，其中：A為5個(gè)中方格內(nèi)精子總數(shù)。6.2.5精子活力：取5μL精液于載玻片上，加蓋蓋玻片后在37。C恒溫裝置的相差顯微鏡上，可采用目測評定法或計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)分析法對精子活力進(jìn)行評估。每個(gè)樣品至少觀察三個(gè)視野（每個(gè)視野中精子數(shù)≥200個(gè)）。直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子為100％者評為1.0級；90％者評定為0.9級；如此類推。6.2.6精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)：精子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)評估與活力評估的操作相同，精子向前運(yùn)動(dòng)的狀態(tài)劃分為0級～5級，0指不運(yùn)動(dòng)，5級指快速向前運(yùn)動(dòng)。6.2.7精子畸形率：用戊二醛固定法或巴氏染色法檢測精子畸形率。在200×相差顯微鏡下統(tǒng)計(jì)畸形精子（包括頭部畸形、頸部和中段畸形、主段畸形和過多的胞漿殘余體）的比率，每個(gè)樣品觀察精子總數(shù)≥200個(gè)。DB51/T3245—202536.3精液冷凍及保存6.3.1稀釋：15mL離心管收集精液，稀釋液采用37。C水浴精液冷凍液（參見附錄B），根據(jù)精液密度計(jì)算添加冷凍液體積，最終稀釋后精液密度為4×108個(gè)/mL。6.3.2平衡：15mL離心管收集稀釋后的精液，將離心管置于250mL燒杯（盛有200mL～220mL的37。C水）的中部，4。C冰箱中隔水緩慢降溫平6.3.3裝管：采用0.25mL凍精細(xì)管進(jìn)行灌裝并封口，管壁標(biāo)記譜系號(hào)及采精日期等。6.3.4冷凍：采用兩步法進(jìn)行精液冷凍。第1步：將細(xì)管放置在冷凍架距離液氮面約7.5cm（溫度約為-110。C）處1min；第2步：用止血鉗將細(xì)管放置在冷凍架距離液氮面約2.5cm處1min（溫度約為-180。C），然后將細(xì)管放入液氮長期保存。6.3.5登記：對照大熊貓精液資源保存登記表（參見表A.2）進(jìn)行準(zhǔn)確填寫，對入庫細(xì)管的數(shù)量、冷凍日期以及存放位置進(jìn)行登記。7大熊貓?bào)w細(xì)胞庫構(gòu)建技術(shù)7.1樣本采集按下列要求盡快采集樣本并填寫大熊貓?bào)w細(xì)胞資源保存登記表（參見表A.3），每只大熊貓個(gè)體至少保存1種細(xì)胞，宜來源于以下組織：——臍帶：大熊貓幼仔的臍帶組織，長度為不小于2cm；——皮膚：死亡大熊貓的皮膚組織，面積不小于2cm2；——肌肉：死亡大熊貓的肌肉組織，體積不小于2cm3；樣本均放置于4。C采樣液中，應(yīng)及時(shí)運(yùn)往實(shí)驗(yàn)室。臍帶的運(yùn)輸時(shí)間不宜超過24h，皮膚的運(yùn)輸時(shí)間不宜超過48h，肌肉的運(yùn)輸時(shí)間組織不宜超過7d。7.2細(xì)胞分離7.2.1臍帶來源細(xì)胞：將收集的臍帶樣本清洗干凈，盡可能剪碎一些，37。C下先后用1mg/mLIV型膠原酶與0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化10min～15min，800×g離心5min收集細(xì)胞。7.2.2皮膚來源細(xì)胞：將皮膚組織樣本用眼科剪剪碎，37。C下先用1mg/mLI型膠原酶消化30min~45min，再用0.25%胰蛋白酶消化20min～30min，800×g離心5min收集細(xì)胞。7.2.3肌肉來源細(xì)胞：將肌肉組織樣本用眼科剪剪碎，37。C下先用2mg/mLI型膠原酶消化30min~45min，再用0.25%胰蛋白酶消化20min～30min，800×g離心5min收集細(xì)胞。7.3細(xì)胞培養(yǎng)對于分離的細(xì)胞加入對應(yīng)的培養(yǎng)基（見附錄B）重懸后接種于培養(yǎng)皿，放置于37。C、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，記為原代細(xì)胞（P0）。當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%～90%時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代：棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗2次，0.25%胰蛋白酶消化2min～5min后終止消化，800×g離心5min收集細(xì)胞并使用對應(yīng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為P1。P1細(xì)胞匯合度達(dá)70%～90%時(shí)再次傳代，此時(shí)記為P2，依次類推。7.4細(xì)胞冷凍7.4.1細(xì)胞計(jì)數(shù)與活率檢測：細(xì)胞消化、離心后用2mL培養(yǎng)基重懸，宜用細(xì)胞技術(shù)儀或細(xì)胞計(jì)數(shù)板檢測細(xì)胞總數(shù)與細(xì)胞活率。7.4.2微生物檢測：入庫細(xì)胞要求無細(xì)菌、真菌、支原體污染，檢測技術(shù)按照GB/T40365執(zhí)行。DB51/T3245—202547.4.3細(xì)胞冷凍：用凍存液重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/mL，按0.5mL/管分裝至2mL凍存管中，將待冷凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)入梯度降溫盒中，-80。C冰箱過夜后轉(zhuǎn)入液氮進(jìn)行長期保存。凍存管在使用前需對大熊貓譜系號(hào)、細(xì)胞類型及凍存日期進(jìn)行標(biāo)注。對于每個(gè)樣本需要至少保存5管細(xì)胞，凍前活率應(yīng)不低于90%。7.4.4入庫登記：填寫大熊貓?bào)w細(xì)胞資源保存登記表（參見表A.3），登記表與凍存管的信息應(yīng)保持8樣品庫安全管理本標(biāo)準(zhǔn)涉及樣品的液氮保存，液氮生物容器的安全管理按照GB/T5458執(zhí)行。DB51/T3245—20255大熊貓資源保存登記表表A.1至表A.3給出了大熊貓組織、精液及體細(xì)胞資源保存登記表。表A.1大熊貓組織資源保存登記表呼名譜系號(hào)組織類型)/格子號(hào)DB51/T3245—20256表A.2大熊貓精液資源保存登記表備注呼名號(hào)置DB51/T3245—20257表A.3大熊貓?bào)w細(xì)胞資源保存登記表號(hào)間次率量格子號(hào))DB51/T3245—20258大熊貓精液與體細(xì)胞資源保存相關(guān)試劑配制表B.1給出了精液冷凍液的配方。表B.1精液冷凍液試劑用量蒸餾水蔗糖無菌卵黃20mL甘油青霉素-鏈霉素-谷氨酰胺(100×)總體積表B.2給出了采樣液的配方。表B.2采樣液試劑用量PBS溶液95mL真菌-抗生素（100×)總體積表B.3給出了臍帶來源細(xì)胞培養(yǎng)基的配方。表B.3臍帶來源細(xì)胞培養(yǎng)基試劑用量低糖DME