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一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌檢驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

本文件適用于一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌的定性檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6882-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法

GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

GB/T19495.2-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

3術(shù)語(yǔ)和定義

3.1術(shù)語(yǔ)和定義

本標(biāo)準(zhǔn)采樣下列定義。

一次性一次性使用衛(wèi)生用品

使用一次后即丟棄的、與人體直接或間接接觸的、并為達(dá)到人體生理衛(wèi)生或衛(wèi)生保健（抗菌或抑菌）

目的而使用的各種日常生活用品，產(chǎn)品形狀可以是固體或液體。例如，一次性使用手套或指套（不包括

醫(yī)用手套或指套）、紙巾、濕巾、衛(wèi)生濕巾、電話膜、帽子、口罩、婦女經(jīng)期衛(wèi)生用品（包括衛(wèi)生護(hù)墊）、

尿布等排泄物衛(wèi)生用品（不包括廁所用紙）等。

3.2略縮語(yǔ)

DNA(deoxyribonuleicacid)：脫氧核糖核酸

ska(streptokinasegene)：鏈激酶基因

PCR(polymerasechainreaction)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

4原理

一次性使用衛(wèi)生用品樣品經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后，提取增菌液中DNA，以提取的DNA為模板，以溶血性鏈

球菌中（ska）基因中相對(duì)保守且高度特異的引物和探針進(jìn)行目標(biāo)物的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值判

斷樣品中是否含有溶血性鏈球菌。

5試劑和材料

試劑的配制及試驗(yàn)中的操作規(guī)范應(yīng)按GB/T27403的規(guī)定執(zhí)行。

除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑均用無(wú)DNA

酶污染的容器分裝。

1

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4.1試劑

5.1.1葡萄糖肉湯培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A.1。

5.1.2PCR擴(kuò)增引物序列：見(jiàn)附錄B.1。

5.1.3熒光探針序列見(jiàn)附錄B.1。

5.1.42X熒光定量PCR預(yù)混液。

5.1.5商品化DNA抽提試劑盒。

5.1.6溶血性鏈球菌和大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：來(lái)源自國(guó)家認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)。

4.2耗材

5.1.1離心管：200μL、1.5ml、5mL、10mL。

5.1.2PCR反應(yīng)管：?jiǎn)喂?、八?lián)管或96孔PCR微孔板。

6儀器和設(shè)備

6.1分析天平：感量0.01g。

6.2微量可調(diào)移液器：?jiǎn)蔚?1~10μL、10~100μL、1~1000μL。

6.3恒溫水浴鍋。

6.4渦旋儀。

6.5冷凍高速離心機(jī)。

6.6高壓滅菌鍋。

6.7超凈工作臺(tái)。

6.8二級(jí)生物安全柜。

6.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

6.10恒溫培養(yǎng)箱：35±1℃。

6.11核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。

6.12普通冰箱：4℃，-20℃。

7實(shí)驗(yàn)操作步驟

7.1取樣

在100級(jí)凈化條件下用無(wú)菌方法打開(kāi)用于檢測(cè)的至少3個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確稱取10±1g

樣品。剪碎后加入200mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個(gè)生理鹽水樣液。液體產(chǎn)品直接用原液

作為樣液。

7.2增菌

取樣液（7.1）5mL，加入到50mL葡萄糖肉湯培養(yǎng)液中，充分混勻，置于35℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

24h。

7.3模板DNA的提取與制備

7.3.1從樣品增菌液（7.2）表層吸取1mL增菌液。離心收集細(xì)菌（4000rpm/min，10min），去上清液。

加入600μL核酸裂解液，重懸浮細(xì)菌。100℃水浴5min后冷卻至室溫。12000rpm/min離心3min，將

上清液移至干凈的1.5mL離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，置于4℃冰箱靜置1h，12000rpm/min離

2

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心2min，去上清液。加入200μL70%乙醇輕柔倒置洗滌2~3次，，12000rpm/min離心2min去上清，

風(fēng)干10~15min，加入100μL無(wú)菌雙蒸水重懸后于4℃保存，如不能即時(shí)檢驗(yàn)，提取后DNA放置于-20℃

冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

7.3.2試劑盒法。從樣品增菌液（7.2）表層吸取1mL增菌液，離心收集細(xì)菌（4000rpm/min，10min），

按照商品化細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，如不能即時(shí)檢驗(yàn)，提取后DNA

放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

7.4DNA濃度和純度測(cè)定

取適量DNA原液加無(wú)菌雙蒸水稀釋至一定倍數(shù)后，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)定

260nm和280nm處吸光度，按照式（1）計(jì)算DNA的濃度。

0······························································(1)

式中：?=?260×?×5

—DNA濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

A260—260nm處的吸光值；

Nρ—核酸稀釋倍數(shù)；

50—吸光值A(chǔ)260為1時(shí)，相對(duì)應(yīng)雙鏈的DNA濃度常數(shù)；

當(dāng)比值在1.8~2.0之間時(shí)，適用于熒光PCR擴(kuò)增。

260

實(shí)?時(shí)熒光檢測(cè)

7.5?28P0CR

7.5.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

試劑成分體積（μL）

2X熒光定量PCR反應(yīng)預(yù)混液12.5

DNA模板1

上游引物（10μM）0.6

下游引物（10μM）0.6

探針（5μM）0.3

ddH2O補(bǔ)齊至25μL

7.5.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)

預(yù)變性：95℃、5min，1個(gè)循環(huán)；變性：95℃、15s，退火：60℃、30s，同時(shí)收集FAM熒光，延

伸：72℃、30s，44個(gè)循環(huán)。

7.5.3實(shí)驗(yàn)對(duì)照及平行

檢驗(yàn)過(guò)程中分別設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照為溶血性鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，

陰性對(duì)照為大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA，用等體積的無(wú)菌雙蒸水作為空白對(duì)照。每個(gè)待檢樣品提取DNA

溶液進(jìn)行2個(gè)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。

8結(jié)果分析及表述

8.1質(zhì)量控制

以下條件有一條不滿足時(shí)，實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

a)空白對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，相應(yīng)的Ct值＞40.0；

b)陰性對(duì)照：無(wú)熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，相應(yīng)的Ct值＞40.0；

c)陽(yáng)性對(duì)照：有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，相應(yīng)的Ct值＜35.0。

8.2結(jié)果分析

在符合8.1情況下，被檢樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)：

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檢驗(yàn)樣本Ct值≤35.0時(shí)，則判定被檢樣品為陽(yáng)性

檢驗(yàn)樣本Ct值≥40.0時(shí)，則判定被檢樣品為陰性

如35.0＜Ct值＜40.0，判為結(jié)果可疑，需要重新檢測(cè)。重新檢測(cè)結(jié)果Ct值≥40.0，則判定被檢樣品為

陰性，反之判定為陽(yáng)性。

8.3結(jié)果表述

結(jié)果為陽(yáng)性者，該樣品檢驗(yàn)結(jié)果為溶血性鏈球菌初篩陽(yáng)性，對(duì)樣品增菌液進(jìn)一步按照GB15979-2002

中B5.1的規(guī)定進(jìn)行確證，確證為陽(yáng)性時(shí)，報(bào)告檢出溶血性鏈球菌，確證為陰性時(shí)，報(bào)告未檢出溶血性

鏈球菌。

結(jié)果為陰性者，表述為被檢樣品未檢出溶血性鏈球菌。

9預(yù)防污染措施

檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403中的規(guī)定執(zhí)行。

4

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

培養(yǎng)基和試劑配制

A.1葡萄糖肉湯培養(yǎng)基

A.1.1成分

蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化鈉5g

葡萄糖10g

蒸餾水1000mL

A.1.2制法

將上述成分溶于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值為7.2~7.4，加熱溶解，分裝，121℃15min高壓滅菌后備用。

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附錄B

（規(guī)范性附錄）

一次性衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用引物及擴(kuò)增片段系列

B.1實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)所用上下游引物及熒光探針系列

溶血性鏈球菌基因引物序列探針序列

ska（耐熱核酸酶）F:5'-CACCTGAAACAAAGCATCCTAAA-3'5'-FAM-TGCTTCAGGGCCATATTTCTCTACACC-BHQ1-3'

R:5'-CGCTAAGCCACGTCCATATT-3'

ska基因的擴(kuò)增片段

1atgaaaaattacttatcttttgggatgtttgcactgctgtttgcattaacatttggaaca

61gtcaagcctgtccaagctattgctggacctgaatggctgctaggccgtccacctgtcaac

121aacagccaattagttgttagtatggccggtatcgttgaaggtaccgataaaaaagttttt

181ataaatttttttgaaatcgatctaacatcacaacctgctcacggaggaaagacagagcag

241ggcttaagtccaaaatcaaaaccatttgctacagataatggcgcaatgccacataaactt

301gaaaaagctgacttattaaaggctattcaagaacggctgatcgctaacgttcacagtaac

361gacggctactttgaggtcattgattttgcaagcgatgcaaccattactgaccgcgacgat

421aacatatactttgctaatcaagatggctcggtaaccttgcccacccagcctatccaacaa

481tttttgttaaggggacatgtgcgcgttagaccatataaagaaaaaccaatacaaactcca

541gcaaaatctgttgatataagatatactgtacagtttactcctttaaaccctgatgatgat

601ttcaaaccagttctcaaagatactaaactattgaaaacattagctatcggcgacaccatc

661acatcccaagaattactagctcaagcacaaagcattttaaacgaaagccatccagattat

721acgatttatgaacgtgattcctcaatcgtcactcatgacaatgacattttccgtacgatt

781ttaccaatagatcaaaagtttacttaccgtgtcaaaaatcgggaacaagcttataaggcc

841aattctaaaacagatattaaagaaaaaacgaacaacaccgaccttatctctgagaaatat

901tacatccttaaaaaaggggaaaagccgtatgatccctttgatcgcagtcacttgaaactg

961ttcaccatcaaatacgttgatgtcgataccaacgaattgctaaaaagtgagcagctctta

1021acagctagcgaacgtaacttagacttcagagatttatacgatcctcgtgataaggctaaa

1081ctactctacaacaatcttgatgcttttgatatcatggactataccttaactggaaaagta

1141gaggataatcacgataagaataatcgtgtcgtcacagtttatatgggtaagcgccctaaa

1201ggggcaaagggtagctatcatttagcttatgataaagatctctataccgaagaagaacga

1261gaagtttacagctacctgcgtgatacagggacacctatacctgataaccctaaagacaaa

1321taa

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ICS07.100.99

C51

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

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一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌檢驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光PCR法

DeterminationofStreptococcuspyogenesindisposablesanitaryproducts—

RealtimePCRmethod

xxxx-xx-xx發(fā)布xxxx-xx-xx實(shí)施

寧夏化學(xué)分析測(cè)試協(xié)會(huì)發(fā)布

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一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌檢驗(yàn)

實(shí)時(shí)熒光PCR法

1范圍

本文件規(guī)定了一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。

本文件適用于一次性使用衛(wèi)生用品中溶血性鏈球菌的定性檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6882-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)則和試驗(yàn)方法

GB/T27403-2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

GB/T19495.2-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

GB15979-2002一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)

3術(shù)語(yǔ)和定義

3.1術(shù)語(yǔ)和定義

本標(biāo)準(zhǔn)采樣下列定義。

一次性一次性使用衛(wèi)生用品

使用一次后即丟棄的、與人體直接或間接接觸的、并為達(dá)到人體生理衛(wèi)生或衛(wèi)生保?。咕蛞志?/p>

目的而使用的各種日常生活用品，產(chǎn)品形狀可以是固體或液體。例如，一次性使用手套或指套（不包括

醫(yī)用手套或指套）、紙巾、濕巾、衛(wèi)生濕巾、電話膜、帽子、口罩、婦女經(jīng)期衛(wèi)生用品（包括衛(wèi)生護(hù)墊）、

尿布等排泄物衛(wèi)生用品（不包括廁所用紙）等。

3.2略縮語(yǔ)

DNA(deoxyribonuleicacid)：脫氧核糖核酸

ska(streptokinasegene)：鏈激酶基因

PCR(polymerasechainreaction)：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

Ct值：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)

4原理

一次性使用衛(wèi)生用品樣品經(jīng)擴(kuò)增培養(yǎng)后，提取增菌液中DNA，以提取的DNA為模板，以溶血性鏈

球菌中（ska）基因中相對(duì)保守且高度特異的引物和探針進(jìn)行目標(biāo)物的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，根據(jù)Ct值判

斷樣品中是否含有溶血性鏈球菌。

5試劑和材料

試劑的配制及試驗(yàn)中的操作規(guī)范應(yīng)按GB/T27403的規(guī)定執(zhí)行。

除非另有說(shuō)明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑均用無(wú)DNA

酶污染的容器分裝。

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4.1試劑

5.1.1葡萄糖肉湯培養(yǎng)基：見(jiàn)附錄A.1。

5.1.2PCR擴(kuò)增引物序列：見(jiàn)附錄B.1。

5.1.3熒光探針序列見(jiàn)附錄B.1。

5.1.42X熒光定量PCR預(yù)混液。

5.1.5商品化DNA抽提試劑盒。

5.1.6溶血性鏈球菌和大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株：來(lái)源自國(guó)家認(rèn)可的菌種保藏機(jī)構(gòu)。

4.2耗材

5.1.1離心管：200μL、1.5ml、5mL、10mL。

5.1.2PCR反應(yīng)管：?jiǎn)喂?、八?lián)管或96孔PCR微孔板。

6儀器和設(shè)備

6.1分析天平：感量0.01g。

6.2微量可調(diào)移液器：?jiǎn)蔚?1~10μL、10~100μL、1~1000μL。

6.3恒溫水浴鍋。

6.4渦旋儀。

6.5冷凍高速離心機(jī)。

6.6高壓滅菌鍋。

6.7超凈工作臺(tái)。

6.8二級(jí)生物安全柜。

6.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

6.10恒溫培養(yǎng)箱：35±1℃。

6.11核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)。

6.12普通冰箱：4℃，-20℃。

7實(shí)驗(yàn)操作步驟

7.1取樣

在100級(jí)凈化條件下用無(wú)菌方法打開(kāi)用于檢測(cè)的至少3個(gè)包裝，從每個(gè)包裝中取樣，準(zhǔn)確稱取10±1g

樣品。剪碎后加入200mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻，得到一個(gè)生理鹽水樣液。液體產(chǎn)品直接用原液

作為樣液。

7.2增菌

取樣液（7.1）5mL，加入到50mL葡萄糖肉湯培養(yǎng)液中，充分混勻，置于35℃±1℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

24h。

7.3模板DNA的提取與制備

7.3.1從樣品增菌液（7.2）表層吸取1mL增菌液。離心收集細(xì)菌（4000rpm/min，10min），去上清液。

加入600μL核酸裂解液，重懸浮細(xì)菌。100℃水浴5min后冷卻至室溫。12000rpm/min離心3min，將

上清液移至干凈的1.5mL離心管中，加入0.8倍體積異丙醇，置于4℃冰箱靜置1h，12000rpm/min離

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心2min，去上清液。加入200μL70%乙醇輕柔倒置洗滌2~3次，，12000rpm/min離心2min去上清，

風(fēng)干10~15min，加入100μL無(wú)菌雙蒸水重懸后于4℃保存，如不能即時(shí)檢驗(yàn)，提取后DNA放置于-20℃

冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

7.3.2試劑盒法。從樣品增菌液（7.2）表層吸取1mL增菌液，離心收集細(xì)菌（4000rpm/min，10min），

按照商品化細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取，如不能即時(shí)檢驗(yàn)，提取后DNA

放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

7.4DNA濃度和純度測(cè)定

取適量DNA原液加無(wú)菌雙蒸水稀釋至一定倍數(shù)后，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計(jì)測(cè)定

260nm和280nm處吸光度，按照式（1）計(jì)算DNA的濃度。

0······························································(1)

式中：