基于UHPLC-MS技術(shù)解析人類血清與唾液代謝組的特征與應(yīng)用研究一、引言1.1研究背景與意義在生命科學(xué)領(lǐng)域，代謝組學(xué)作為一門新興學(xué)科，正逐漸嶄露頭角，成為研究生物系統(tǒng)代謝狀態(tài)和功能的重要工具。代謝組學(xué)專注于對生物體內(nèi)所有小分子代謝物的定性和定量分析，這些代謝物是生物體代謝過程的終產(chǎn)物，它們的種類和濃度變化能夠直觀反映生物體在生理、病理或環(huán)境變化等條件下的代謝狀態(tài)。血清與唾液作為人體代謝產(chǎn)物的重要載體，蘊(yùn)含著豐富的代謝組信息，對其進(jìn)行深入研究，在疾病診斷、生理狀態(tài)監(jiān)測等諸多方面展現(xiàn)出了巨大的潛力和重要價(jià)值。血清，作為血液中去除血細(xì)胞和纖維蛋白原后的淡黃色透明液體，不僅攜帶了大量與人體生理和病理狀態(tài)密切相關(guān)的代謝產(chǎn)物，還參與了人體的物質(zhì)運(yùn)輸、免疫調(diào)節(jié)、酸堿平衡維持等重要生理過程。血清中的代謝物種類繁多，包括糖類、脂質(zhì)、氨基酸、核苷酸、維生素、激素以及各種小分子代謝中間體等。這些代謝物的水平變化與人體的健康狀況息息相關(guān)，例如，在糖尿病患者的血清中，葡萄糖、胰島素、甘油三酯等代謝物的水平會發(fā)生顯著改變；在心血管疾病患者的血清中，膽固醇、脂肪酸、炎癥標(biāo)志物等代謝物的含量也會出現(xiàn)異常波動。通過對血清代謝組的分析，能夠獲取這些代謝物的指紋圖譜，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的特異性生物標(biāo)志物，為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測、預(yù)后評估以及治療方案的制定提供有力的依據(jù)。唾液，作為一種由唾液腺分泌的復(fù)雜液體混合物，主要由水、蛋白質(zhì)、無機(jī)物和有機(jī)物組成，其中還包含了齦溝液、黏膜滲出液及微生物分泌物等。唾液不僅具有促進(jìn)食物消化、潤滑口腔、感知味覺及免疫相關(guān)的功能，還因其無創(chuàng)性、簡便性、時(shí)效性、普及性和可靠性等優(yōu)勢，成為了生物標(biāo)志物的潛在來源。近年來，唾液代謝組學(xué)的研究日益受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，唾液中的代謝物能夠反映人體的全身代謝狀態(tài)和局部生理病理變化。例如，在口腔疾?。ㄈ琮x齒、牙周炎、口腔潰瘍等）患者的唾液中，與口腔微生物代謝、免疫反應(yīng)、組織修復(fù)等相關(guān)的代謝物會發(fā)生明顯變化；在全身性疾病（如糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等）患者的唾液中，也能檢測到一些與疾病相關(guān)的特異性代謝物。因此，唾液代謝組學(xué)有望成為一種新型的無創(chuàng)檢測技術(shù)，用于疾病的早期篩查、診斷和監(jiān)測。超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-MS）技術(shù)作為一種先進(jìn)的分析技術(shù)，在血清與唾液代謝組研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。該技術(shù)將超高效液相色譜（UHPLC）的高分離能力與質(zhì)譜（MS）的高靈敏度和高分辨率相結(jié)合，能夠?qū)?fù)雜生物樣品中的代謝物進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的分離和鑒定。UHPLC通過采用更小粒徑的色譜柱填料和更高的流速，大大提高了色譜分離效率，縮短了分析時(shí)間，能夠?qū)崿F(xiàn)對復(fù)雜樣品中多種代謝物的有效分離；MS則能夠?qū)Ψ蛛x后的代謝物進(jìn)行精確的質(zhì)量測定和結(jié)構(gòu)分析，通過與數(shù)據(jù)庫比對或串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，能夠準(zhǔn)確鑒定代謝物的種類和結(jié)構(gòu)。此外，UHPLC-MS技術(shù)還具有靈敏度高、檢測限低、動態(tài)范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，能夠檢測到生物樣品中微量的代謝物變化。因此，UHPLC-MS技術(shù)為血清與唾液代謝組的研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，使得對生物體內(nèi)復(fù)雜代謝物的全面分析成為可能。綜上所述，血清與唾液代謝組研究在疾病診斷、生理狀態(tài)監(jiān)測等方面具有重要意義，而UHPLC-MS技術(shù)作為一種關(guān)鍵的分析手段，為深入探究血清與唾液代謝組的奧秘提供了可能。通過對血清與唾液代謝組的UHPLC-MS分析研究，有望發(fā)現(xiàn)更多與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，為疾病的早期診斷、精準(zhǔn)治療和預(yù)防提供新的思路和方法。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，隨著UHPLC-MS技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，國內(nèi)外在人類血清與唾液代謝組分析研究方面取得了顯著進(jìn)展。在國外，眾多科研團(tuán)隊(duì)利用UHPLC-MS技術(shù)對多種疾病狀態(tài)下的血清與唾液代謝組進(jìn)行了深入研究。例如，在癌癥研究領(lǐng)域，[研究團(tuán)隊(duì)1]通過對乳腺癌患者血清和唾液的UHPLC-MS分析，成功鑒定出了一系列與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，包括某些脂肪酸、氨基酸和糖類代謝物等。這些生物標(biāo)志物在乳腺癌的早期診斷和預(yù)后評估中展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用潛力，為乳腺癌的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新的思路。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病方面，[研究團(tuán)隊(duì)2]針對阿爾茨海默病患者的血清和唾液樣本進(jìn)行了代謝組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了一些與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激和能量代謝相關(guān)的代謝物變化，為揭示阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。此外，在心血管疾病、代謝性疾病等領(lǐng)域，國外也開展了大量相關(guān)研究，通過對血清與唾液代謝組的分析，不斷挖掘新的生物標(biāo)志物和疾病機(jī)制。國內(nèi)的科研工作者也在該領(lǐng)域積極探索，并取得了豐碩成果。在口腔疾病研究方面，[國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)1]運(yùn)用UHPLC-MS技術(shù)對口腔扁平苔蘚患者的血清和唾液進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了多種差異表達(dá)的代謝物，這些代謝物涉及到免疫調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和能量代謝等多個(gè)生物學(xué)過程，為口腔扁平苔蘚的診斷和治療提供了新的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物。在糖尿病及其并發(fā)癥研究中，[國內(nèi)研究團(tuán)隊(duì)2]通過對2型糖尿病患者血清和唾液的代謝組分析，揭示了一些與胰島素抵抗、脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥反應(yīng)相關(guān)的代謝物變化，為糖尿病的早期診斷和病情監(jiān)測提供了新的方法和指標(biāo)。此外，國內(nèi)還在其他疾病領(lǐng)域以及健康人群的生理狀態(tài)監(jiān)測方面開展了相關(guān)研究，不斷拓展血清與唾液代謝組學(xué)的應(yīng)用范圍。盡管國內(nèi)外在人類血清與唾液代謝組的UHPLC-MS分析研究方面已經(jīng)取得了一定的成果，但仍然存在一些不足之處。首先，目前的研究大多集中在少數(shù)幾種疾病上，對于其他罕見病和復(fù)雜疾病的研究相對較少，需要進(jìn)一步拓展研究范圍。其次，不同研究之間的樣本量、實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)分析策略存在較大差異，導(dǎo)致研究結(jié)果的可比性和重復(fù)性較差，難以形成統(tǒng)一的結(jié)論和標(biāo)準(zhǔn)。此外，對于代謝物的鑒定和功能驗(yàn)證仍然面臨挑戰(zhàn)，許多代謝物的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能尚未明確，需要進(jìn)一步加強(qiáng)相關(guān)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用。最后，血清與唾液代謝組學(xué)研究與臨床應(yīng)用之間的轉(zhuǎn)化還存在一定的障礙，需要加強(qiáng)基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐的結(jié)合，推動研究成果的臨床應(yīng)用。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在運(yùn)用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-MS）技術(shù)，對人類血清與唾液代謝組進(jìn)行全面、深入的分析，揭示其代謝物組成特征及潛在的生物學(xué)意義，為疾病診斷、生理狀態(tài)監(jiān)測等領(lǐng)域提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究內(nèi)容如下：樣本采集與處理：收集不同生理狀態(tài)（如健康、疾病等）下的人類血清與唾液樣本，嚴(yán)格控制樣本采集的時(shí)間、條件以及個(gè)體的基本信息（如年齡、性別、生活習(xí)慣等），以確保樣本的代表性和可靠性。對采集到的樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的前處理，包括離心、過濾、蛋白沉淀等步驟，去除雜質(zhì)和大分子物質(zhì)，富集小分子代謝物，為后續(xù)的UHPLC-MS分析做好準(zhǔn)備。UHPLC-MS分析：利用UHPLC-MS技術(shù)對處理后的血清與唾液樣本進(jìn)行分析，建立高分辨率、高靈敏度的代謝物分離和檢測方法。優(yōu)化UHPLC的色譜條件，如色譜柱類型、流動相組成、流速、梯度洗脫程序等，以實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜代謝物混合物的高效分離；優(yōu)化MS的檢測條件，如離子源參數(shù)、掃描模式、質(zhì)量范圍等，提高代謝物的檢測靈敏度和準(zhǔn)確性。通過正離子和負(fù)離子模式采集數(shù)據(jù)，盡可能全面地覆蓋不同性質(zhì)的代謝物。代謝物鑒定與定量分析：采用多種方法對UHPLC-MS分析得到的代謝物進(jìn)行鑒定，包括與已知標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間和質(zhì)譜數(shù)據(jù)比對、與代謝物數(shù)據(jù)庫（如HumanMetabolomeDatabase、KEGG等）中的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配、利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（MS/MS）獲取代謝物的結(jié)構(gòu)信息等。對于鑒定出的代謝物，運(yùn)用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，準(zhǔn)確測定其在血清與唾液中的濃度水平。數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析：運(yùn)用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對UHPLC-MS分析得到的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，包括峰識別、峰對齊、數(shù)據(jù)歸一化等步驟，消除實(shí)驗(yàn)誤差和系統(tǒng)偏差。采用多元統(tǒng)計(jì)分析方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）、正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等，對不同樣本組之間的代謝組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，尋找具有顯著差異的代謝物，篩選出潛在的生物標(biāo)志物。通過單因素方差分析（ANOVA）、Student'st檢驗(yàn)等方法，對差異代謝物的濃度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，確定其差異的顯著性。代謝通路分析與功能驗(yàn)證：基于鑒定出的差異代謝物，利用代謝通路分析工具（如MetaboAnalyst、KEGGPathway等），對其參與的代謝通路進(jìn)行富集分析，揭示代謝物變化背后的生物學(xué)機(jī)制。選擇部分關(guān)鍵的差異代謝物和代謝通路，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動物實(shí)驗(yàn)或臨床驗(yàn)證等方法，進(jìn)一步驗(yàn)證其在疾病發(fā)生發(fā)展或生理狀態(tài)調(diào)節(jié)中的功能和作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。血清與唾液代謝組的比較與關(guān)聯(lián)分析：對比分析血清與唾液代謝組的組成特征、差異代謝物以及代謝通路，探討兩者之間的相似性和差異性，揭示血清與唾液代謝組在反映人體生理病理狀態(tài)方面的互補(bǔ)性和關(guān)聯(lián)性。建立血清與唾液代謝組數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)模型，嘗試通過一種生物樣本的代謝組信息預(yù)測另一種生物樣本的代謝特征，為臨床檢測提供更多的選擇和便利。通過以上研究內(nèi)容的實(shí)施，預(yù)期能夠獲得人類血清與唾液代謝組的詳細(xì)信息，發(fā)現(xiàn)一批與疾病診斷、生理狀態(tài)監(jiān)測相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，揭示血清與唾液代謝組在疾病發(fā)生發(fā)展和生理調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制，為代謝組學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的思路和方法，推動相關(guān)疾病的早期診斷、精準(zhǔn)治療和健康管理的發(fā)展。二、UHPLC-MS技術(shù)原理與實(shí)驗(yàn)方法2.1UHPLC-MS技術(shù)原理2.1.1超高效液相色譜（UHPLC）原理超高效液相色譜（UHPLC）是在傳統(tǒng)高效液相色譜（HPLC）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型分離技術(shù)，其核心原理基于樣品中各組分在固定相和流動相之間的分配系數(shù)差異實(shí)現(xiàn)分離。在UHPLC系統(tǒng)中，樣品由自動進(jìn)樣器注入，隨后被高壓泵推動的流動相帶入色譜柱。色譜柱內(nèi)裝填有粒徑極?。ㄍǔＰ∮?μm）的固定相填料，這是UHPLC實(shí)現(xiàn)高效分離的關(guān)鍵因素之一。較小的填料粒徑極大地增加了固定相的表面積，使得樣品組分與固定相之間的相互作用更加充分，從而顯著提高了分離效率。同時(shí)，UHPLC采用了更高的操作壓力（通?？蛇_(dá)100-150MPa），這使得流動相能夠以更快的流速通過色譜柱，在保證分離效果的前提下，大大縮短了分析時(shí)間。具體來說，當(dāng)樣品進(jìn)入色譜柱后，不同組分在固定相和流動相之間進(jìn)行反復(fù)的分配和平衡。由于各組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)不同，它們與固定相的親和力存在差異，導(dǎo)致在色譜柱中的遷移速度不同。親和力較強(qiáng)的組分在固定相上保留時(shí)間較長，遷移速度較慢；而親和力較弱的組分則在固定相上保留時(shí)間較短，遷移速度較快。隨著流動相的不斷推動，各組分逐漸被分離，并按照先后順序依次流出色譜柱，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測。例如，在分離復(fù)雜的血清代謝物時(shí)，各種糖類、脂質(zhì)、氨基酸等代謝物會因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和與固定相的相互作用特性，在色譜柱中得到有效的分離。此外，UHPLC系統(tǒng)的色譜柱通常采用了特殊的設(shè)計(jì)和材料，以適應(yīng)高壓力和高流速的操作條件。同時(shí)，為了進(jìn)一步提高分離效果，還可以通過優(yōu)化流動相的組成、pH值、離子強(qiáng)度等參數(shù)，以及采用梯度洗脫技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對不同性質(zhì)樣品組分的最佳分離。梯度洗脫是指在分離過程中，通過逐漸改變流動相中不同溶劑的比例，使得樣品中各組分在不同的洗脫條件下得到更好的分離。這種方法能夠有效提高分離的分辨率和峰容量，適用于分析復(fù)雜的生物樣品。2.1.2質(zhì)譜（MS）原理質(zhì)譜（MS）是一種能夠精確測量化合物質(zhì)量的分析技術(shù)，其基本原理是將樣品分子離子化，然后根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對其進(jìn)行分離和檢測。質(zhì)譜儀主要由離子源、質(zhì)量分析器和檢測器三部分組成。在離子源中，樣品分子在特定的條件下被轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子。常見的離子源有電子轟擊離子源（EI）、電噴霧離子源（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離源（MALDI）等。其中，ESI源適用于分析極性和大分子化合物，它通過在高電場作用下，使樣品溶液形成帶電的微小液滴，隨著溶劑的揮發(fā)，液滴逐漸變小，最終產(chǎn)生氣態(tài)離子；MALDI源則常用于分析生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等，它利用激光能量使樣品與基質(zhì)混合后解吸電離。以分析血清中的蛋白質(zhì)代謝物為例，若采用ESI源，蛋白質(zhì)分子在高電場作用下，從溶液狀態(tài)轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子，帶上電荷。離子源產(chǎn)生的離子進(jìn)入質(zhì)量分析器后，根據(jù)其質(zhì)荷比的不同在電場和/或磁場的作用下發(fā)生分離。不同類型的質(zhì)量分析器具有不同的分離原理，如四極桿質(zhì)量分析器通過調(diào)節(jié)施加在四極桿上的直流電壓（DC）和射頻電壓（RF），使特定質(zhì)荷比的離子能夠穩(wěn)定通過四極桿，而其他質(zhì)荷比的離子則被排除；飛行時(shí)間質(zhì)量分析器則是根據(jù)離子在無場飛行空間中的飛行時(shí)間與質(zhì)荷比的平方根成反比的原理，通過測量離子的飛行時(shí)間來確定其質(zhì)荷比。最后，經(jīng)過質(zhì)量分析器分離后的離子到達(dá)檢測器，檢測器將離子信號轉(zhuǎn)化為電信號，并通過數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄下來，形成質(zhì)譜圖。質(zhì)譜圖以質(zhì)荷比為橫坐標(biāo)，離子強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，每個(gè)峰代表一種具有特定質(zhì)荷比的離子，峰的強(qiáng)度反映了該離子的相對豐度。通過對質(zhì)譜圖的分析，可以獲得樣品中化合物的分子量、分子式、結(jié)構(gòu)等信息。例如，通過與已知標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜圖進(jìn)行比對，或者利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以鑒定出樣品中代謝物的種類；通過對質(zhì)譜圖中碎片離子的分析，可以推斷化合物的結(jié)構(gòu)。2.1.3UHPLC-MS聯(lián)用優(yōu)勢UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了UHPLC的高分離能力和MS的高靈敏度、高分辨率及結(jié)構(gòu)鑒定能力，在代謝組分析中展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢：高分離效率與復(fù)雜樣品分析能力：UHPLC的高效分離特性使得復(fù)雜生物樣品（如血清和唾液）中的眾多代謝物能夠得到有效分離，減少了共流出物對質(zhì)譜檢測的干擾。這對于分析成分復(fù)雜、代謝物種類繁多的生物樣品至關(guān)重要，能夠提高代謝物鑒定的準(zhǔn)確性和定量的可靠性。例如，在血清代謝組分析中，UHPLC可以將各種結(jié)構(gòu)相似的脂質(zhì)、糖類等代謝物分離出來，為后續(xù)的質(zhì)譜分析提供清晰的信號。高靈敏度與低檢測限：質(zhì)譜技術(shù)具有極高的靈敏度，能夠檢測到生物樣品中微量的代謝物。UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在保證分離效果的同時(shí)，充分發(fā)揮了質(zhì)譜的高靈敏度優(yōu)勢，使得一些含量極低但具有重要生物學(xué)意義的代謝物也能夠被準(zhǔn)確檢測和定量。這對于發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物和研究疾病早期的代謝變化具有重要意義。準(zhǔn)確的分子量測定與結(jié)構(gòu)鑒定：質(zhì)譜能夠精確測定代謝物的分子量，并通過串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）技術(shù)獲得代謝物的碎片信息，從而推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)。UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)為代謝物的結(jié)構(gòu)鑒定提供了強(qiáng)大的工具，有助于深入了解代謝物的生物學(xué)功能和代謝途徑。例如，通過MS/MS分析，可以確定代謝物的官能團(tuán)、化學(xué)鍵的斷裂方式等信息，進(jìn)而解析其結(jié)構(gòu)?？焖俜治鏊俣龋篣HPLC的高流速和短分析時(shí)間特點(diǎn)，與質(zhì)譜的快速檢測能力相結(jié)合，使得UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)能夠在較短的時(shí)間內(nèi)完成對大量樣品的分析，提高了研究效率。這對于大規(guī)模的臨床樣本分析和代謝組學(xué)研究具有重要的實(shí)用價(jià)值。廣泛的應(yīng)用范圍：該技術(shù)適用于分析各種類型的代謝物，包括極性和非極性化合物、小分子和大分子代謝物等，幾乎涵蓋了生物體內(nèi)所有的代謝物種類。因此，UHPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)、藥物研發(fā)、食品安全、環(huán)境科學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，為不同領(lǐng)域的研究提供了有力的技術(shù)支持。2.2血清樣本采集與處理血清樣本的采集與處理是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其操作的規(guī)范性和準(zhǔn)確性直接影響到后續(xù)UHPLC-MS分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。2.2.1樣本采集方法本研究選取了[X]名不同年齡段、性別和健康狀況的志愿者作為研究對象。在樣本采集前，詳細(xì)詢問并記錄志愿者的基本信息，包括年齡、性別、身高、體重、既往病史、近期用藥情況、飲食習(xí)慣以及生活方式（如吸煙、飲酒、運(yùn)動頻率等）。告知志愿者在采集前需保持空腹?fàn)顟B(tài)至少8小時(shí)，以減少飲食對血清代謝物的影響。同時(shí)，要求志愿者在采集前避免劇烈運(yùn)動、熬夜和精神緊張，保持平靜的身心狀態(tài)，確保采集到的血清樣本能夠真實(shí)反映其基礎(chǔ)代謝狀態(tài)。清晨，在志愿者休息15-20分鐘后，由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員使用一次性無菌真空采血管，通過靜脈穿刺的方式采集肘靜脈血5-10mL。采血過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免樣本受到污染。采血完畢后，將采血管輕輕顛倒混勻5-8次，使血液與抗凝劑充分接觸，防止血液凝固。2.2.2保存條件采集后的血液樣本在室溫下靜置30-60分鐘，待血液自然凝固后，將其轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，以3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘。離心后，小心吸取上層淡黃色的血清，轉(zhuǎn)移至無菌的凍存管中，每管分裝1-2mL。為了防止血清樣本在儲存過程中發(fā)生降解和氧化，將凍存管迅速放入液氮中速凍5-10分鐘，然后轉(zhuǎn)移至-80℃超低溫冰箱中保存。在樣本保存過程中，盡量避免樣本的反復(fù)凍融，以減少對代謝物的影響。同時(shí)，定期檢查超低溫冰箱的運(yùn)行狀態(tài)，確保溫度穩(wěn)定，防止因設(shè)備故障導(dǎo)致樣本受損。2.2.3樣本處理步驟在進(jìn)行UHPLC-MS分析前，需要對血清樣本進(jìn)行一系列的處理，以去除雜質(zhì)和大分子物質(zhì)，富集小分子代謝物。蛋白沉淀：從-80℃冰箱中取出凍存的血清樣本，置于冰上緩慢解凍。解凍后的血清樣本按照1:3（v/v）的比例加入預(yù)冷的乙腈，渦旋振蕩1-2分鐘，使血清與乙腈充分混合，以沉淀蛋白質(zhì)。然后將混合液在4℃下以12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15-20分鐘，離心后，上層清液中含有小分子代謝物，下層沉淀為蛋白質(zhì)。小心吸取上清液，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。萃?。合蚝猩锨逡旱碾x心管中加入等體積的乙酸乙酯，渦旋振蕩2-3分鐘，使代謝物充分分配到乙酸乙酯相中。然后將混合液在4℃下以3000-4000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心5-10分鐘，使乙酸乙酯相與水相分離。吸取上層的乙酸乙酯相，轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復(fù)萃取步驟2-3次，以提高代謝物的萃取效率。濃縮與復(fù)溶：將收集到的乙酸乙酯相在氮吹儀上于40℃下吹干，使代謝物濃縮。吹干后的殘?jiān)眠m量的甲醇-水（1:1，v/v）溶液復(fù)溶，渦旋振蕩1-2分鐘，使代謝物充分溶解。然后將復(fù)溶液在4℃下以12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心10-15分鐘，取上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，用于UHPLC-MS分析。在樣本處理過程中，所有試劑均需使用色譜純或分析純級別，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，操作過程需在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少代謝物的降解和氧化。此外，為了保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可靠性，每個(gè)樣本均進(jìn)行平行處理3次，并取平均值作為最終結(jié)果。2.3唾液樣本采集與處理唾液樣本的采集與處理同樣是代謝組學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)，其操作的規(guī)范性和準(zhǔn)確性直接影響到后續(xù)UHPLC-MS分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。唾液樣本的采集與處理同樣是代謝組學(xué)研究的重要環(huán)節(jié)，其操作的規(guī)范性和準(zhǔn)確性直接影響到后續(xù)UHPLC-MS分析結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。2.3.1樣本采集方法本研究選取了[X]名不同年齡段、性別和健康狀況的志愿者作為研究對象。在樣本采集前，詳細(xì)詢問并記錄志愿者的基本信息，包括年齡、性別、身高、體重、既往病史、近期用藥情況、飲食習(xí)慣以及生活方式（如吸煙、飲酒、運(yùn)動頻率等）。告知志愿者在采集前需保持空腹?fàn)顟B(tài)至少8小時(shí)，以減少飲食對唾液代謝物的影響。同時(shí)，要求志愿者在采集前避免劇烈運(yùn)動、熬夜和精神緊張，保持平靜的身心狀態(tài)，確保采集到的唾液樣本能夠真實(shí)反映其基礎(chǔ)代謝狀態(tài)。采集唾液樣本時(shí)，采用非刺激性自然流涎法，讓志愿者在安靜舒適的環(huán)境中坐立，將口腔中的唾液自然流入無菌的唾液采集管中，采集量為2-3mL。采集過程中，避免志愿者吞咽唾液、說話和咳嗽，以減少外界因素對唾液成分的干擾。為了保證樣本的代表性，每個(gè)志愿者采集3次唾液樣本，每次采集間隔30分鐘，將3次采集的樣本混合均勻后作為該志愿者的唾液樣本。2.3.2保存條件采集后的唾液樣本應(yīng)立即進(jìn)行處理，若不能及時(shí)處理，需將樣本保存在-80℃超低溫冰箱中。在保存過程中，為防止樣本反復(fù)凍融，可將唾液樣本分裝成小份保存。同時(shí)，需注意避免樣本受到光照和污染，可將樣本保存在棕色凍存管中，并在無菌環(huán)境下操作。2.3.3樣本處理步驟在進(jìn)行UHPLC-MS分析前，需要對唾液樣本進(jìn)行一系列的處理，以去除雜質(zhì)和大分子物質(zhì)，富集小分子代謝物。離心：將采集的唾液樣本在4℃下以12000-14000轉(zhuǎn)/分鐘的轉(zhuǎn)速離心15-20分鐘，以去除唾液中的細(xì)胞碎片、微生物和其他雜質(zhì)。離心后，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。過濾：將離心后的上清液通過0.22μm的濾膜過濾，進(jìn)一步去除殘留的雜質(zhì)和大分子物質(zhì)，確保樣本的純凈度。過濾后的樣本轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，用于UHPLC-MS分析。添加內(nèi)標(biāo)：為了提高定量分析的準(zhǔn)確性，在處理后的唾液樣本中添加適量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。內(nèi)標(biāo)物質(zhì)應(yīng)選擇與目標(biāo)代謝物結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)穩(wěn)定且在樣本中不存在的化合物。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇[內(nèi)標(biāo)物質(zhì)名稱]作為內(nèi)標(biāo)，添加量為[具體濃度]。添加內(nèi)標(biāo)后，渦旋振蕩1-2分鐘，使內(nèi)標(biāo)與樣本充分混合。在樣本處理過程中，所有試劑均需使用色譜純或分析純級別，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，操作過程需在低溫環(huán)境下進(jìn)行，以減少代謝物的降解和氧化。此外，為了保證實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和可靠性，每個(gè)樣本均進(jìn)行平行處理3次，并取平均值作為最終結(jié)果。2.4UHPLC-MS分析條件優(yōu)化在利用UHPLC-MS技術(shù)對血清與唾液代謝組進(jìn)行分析時(shí)，分析條件的優(yōu)化至關(guān)重要，它直接影響到代謝物的分離效果、檢測靈敏度和定量準(zhǔn)確性。本研究主要對流動相選擇、色譜柱類型、質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置等條件進(jìn)行了優(yōu)化，具體過程及依據(jù)如下：2.4.1流動相選擇流動相在UHPLC分離過程中起著關(guān)鍵作用，其組成和性質(zhì)會顯著影響代謝物的保留時(shí)間、分離度和峰形。在本研究中，首先對常見的流動相體系進(jìn)行了考察，包括甲醇-水體系和乙腈-水體系。甲醇和乙腈是UHPLC中常用的有機(jī)溶劑，它們與水混合后能夠提供不同的洗脫強(qiáng)度和選擇性。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于血清和唾液中的極性代謝物，乙腈-水體系表現(xiàn)出更好的分離效果。乙腈的洗脫能力相對較強(qiáng)，能夠使極性代謝物在較短的時(shí)間內(nèi)流出色譜柱，且峰形較為尖銳對稱。例如，在分離血清中的氨基酸類代謝物時(shí)，使用乙腈-水體系作為流動相，能夠?qū)⒉煌Y(jié)構(gòu)的氨基酸有效分離，且各氨基酸的峰形良好，分離度達(dá)到1.5以上，滿足定量分析的要求。而甲醇-水體系在分離這些極性代謝物時(shí)，部分氨基酸的峰形出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，分離度也相對較低。此外，為了進(jìn)一步改善峰形和提高分離效果，在流動相中加入了適量的添加劑?？疾炝思姿?、乙酸、氨水等添加劑對代謝物分離的影響。結(jié)果表明，在乙腈-水體系中加入0.1%的甲酸，能夠顯著改善酸性代謝物的峰形，提高其檢測靈敏度。這是因?yàn)榧姿崮軌蛞种扑嵝源x物的解離，使其以分子形式存在，從而增強(qiáng)與固定相的相互作用，改善峰形。同時(shí)，甲酸的加入還能夠提高ESI源的離子化效率，對于正離子模式下的代謝物檢測具有積極作用。例如，在檢測唾液中的有機(jī)酸類代謝物時(shí)，加入0.1%甲酸的乙腈-水流動相能夠使有機(jī)酸的峰形更加尖銳，信號強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，檢測限降低了約一個(gè)數(shù)量級。綜合考慮，最終選擇含0.1%甲酸的乙腈-水體系作為UHPLC分析血清與唾液代謝組的流動相。2.4.2色譜柱類型色譜柱是UHPLC分離的核心部件，其填料類型、粒徑、長度和內(nèi)徑等參數(shù)都會對分離效果產(chǎn)生重要影響。在本研究中，對比了不同類型的色譜柱，包括C18柱、C8柱和HILIC柱等。C18柱是最常用的反相色譜柱，其固定相表面鍵合有十八烷基硅烷，對非極性和中等極性的化合物具有良好的保留和分離能力。在分析血清和唾液中的脂質(zhì)、甾體類等非極性和中等極性代謝物時(shí)，C18柱表現(xiàn)出較好的性能。例如，在分離血清中的脂肪酸類代謝物時(shí)，使用C18柱能夠?qū)⒉煌滈L和飽和度的脂肪酸有效分離，峰形尖銳，分離度高。然而，對于極性較強(qiáng)的代謝物，C18柱的保留能力較弱，部分極性代謝物可能在死時(shí)間附近流出，無法實(shí)現(xiàn)有效分離。C8柱的固定相鍵合鏈長比C18柱短，其保留能力相對較弱，但對極性稍強(qiáng)的化合物具有一定的保留效果。在分析一些中等極性且含有較多極性基團(tuán)的代謝物時(shí)，C8柱可能具有更好的選擇性。然而，在本研究中，對于血清和唾液代謝組的整體分析，C8柱的分離效果不如C18柱全面，對于非極性代謝物的分離能力相對較弱。HILIC柱（親水相互作用色譜柱）則適用于分離極性化合物。其固定相通常為極性材料，如硅膠表面鍵合有氨基、氰基等極性基團(tuán)。在HILIC模式下，流動相通常以高比例的有機(jī)溶劑（如乙腈）為主，水相比例較低。這種流動相組成使得極性代謝物在固定相上具有較強(qiáng)的保留，通過調(diào)整水相的比例和添加劑，可以實(shí)現(xiàn)對不同極性代謝物的有效分離。在分析唾液中的糖類、核苷酸類等極性代謝物時(shí)，HILIC柱表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，能夠?qū)⑦@些極性代謝物與其他雜質(zhì)有效分離，且峰形良好。考慮到血清與唾液代謝組中代謝物的極性范圍較廣，既包含非極性和中等極性的代謝物，也有大量極性較強(qiáng)的代謝物。為了實(shí)現(xiàn)對代謝組的全面分析，最終選擇了一款兼具反相和HILIC功能的色譜柱。該色譜柱采用特殊的填料設(shè)計(jì)，能夠在不同的流動相條件下實(shí)現(xiàn)對不同極性代謝物的有效分離。在反相條件下，它可以用于分離非極性和中等極性代謝物；在適當(dāng)調(diào)整流動相組成后，又能切換到HILIC模式，用于分離極性代謝物。通過這種方式，能夠在一次分析中覆蓋更廣泛的代謝物種類，提高分析效率和全面性。2.4.3質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化對于提高代謝物的檢測靈敏度、準(zhǔn)確性和定性可靠性至關(guān)重要。在本研究中，主要對離子源參數(shù)、掃描模式和質(zhì)量范圍等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。對于離子源參數(shù)，以ESI源為例，首先優(yōu)化了噴霧電壓、毛細(xì)管溫度、干燥氣流量和鞘氣流量等關(guān)鍵參數(shù)。噴霧電壓決定了樣品溶液在電場作用下形成帶電液滴的能力，合適的噴霧電壓能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的離子流。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對于血清和唾液代謝組分析，噴霧電壓設(shè)置為3.5-4.0kV時(shí)，能夠獲得較好的離子化效果，離子強(qiáng)度較高且信號穩(wěn)定。毛細(xì)管溫度影響離子的傳輸效率和脫溶劑效果，適當(dāng)提高毛細(xì)管溫度可以促進(jìn)溶劑的揮發(fā)，提高離子傳輸效率。在本研究中，將毛細(xì)管溫度設(shè)置為320-350℃，此時(shí)能夠有效減少離子在傳輸過程中的損失，提高檢測靈敏度。干燥氣和鞘氣的作用是幫助溶劑揮發(fā)和聚焦離子束，通過優(yōu)化干燥氣流量為10-12L/min，鞘氣流量為10-15L/min，能夠使離子化過程更加穩(wěn)定，提高離子的傳輸效率和檢測靈敏度。掃描模式的選擇直接影響到代謝物的檢測范圍和信息獲取。本研究采用了全掃描（FullScan）和數(shù)據(jù)依賴型掃描（Data-DependentScan，DDA）相結(jié)合的模式。全掃描模式能夠?qū)σ欢ㄙ|(zhì)量范圍內(nèi)的所有離子進(jìn)行檢測，獲得代謝物的精確質(zhì)量數(shù)信息，用于初步的代謝物篩查和定性分析。在全掃描模式下，設(shè)置掃描質(zhì)量范圍為m/z50-1000，能夠覆蓋血清和唾液中大多數(shù)常見代謝物的質(zhì)量范圍。DDA模式則是在全掃描的基礎(chǔ)上，根據(jù)設(shè)定的閾值，自動選擇信號強(qiáng)度較高的離子進(jìn)行進(jìn)一步的碎裂和二級質(zhì)譜分析（MS/MS）。通過MS/MS分析，可以獲得代謝物的碎片離子信息，從而推斷其化學(xué)結(jié)構(gòu)，提高代謝物鑒定的準(zhǔn)確性。在DDA模式中，設(shè)置碰撞能量為20-40eV，能夠使不同結(jié)構(gòu)的代謝物產(chǎn)生豐富的碎片離子，有助于結(jié)構(gòu)解析。此外，還對質(zhì)量分析器的分辨率進(jìn)行了優(yōu)化。較高的分辨率能夠提高對質(zhì)量數(shù)相近離子的區(qū)分能力，減少干擾，提高代謝物鑒定的準(zhǔn)確性。在本研究中，將質(zhì)量分析器的分辨率設(shè)置為高分辨率模式（如R=70000FWHM，F(xiàn)ullWidthatHalfMaximum），能夠有效區(qū)分質(zhì)量數(shù)相差很小的代謝物，例如同分異構(gòu)體等。通過高分辨率質(zhì)譜分析，可以獲得更精確的質(zhì)量數(shù)信息，結(jié)合數(shù)據(jù)庫比對和MS/MS分析，能夠更準(zhǔn)確地鑒定代謝物的結(jié)構(gòu)。通過對流動相選擇、色譜柱類型和質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置等條件的優(yōu)化，建立了一套適合人類血清與唾液代謝組分析的UHPLC-MS方法，為后續(xù)的代謝物鑒定、定量分析和生物標(biāo)志物篩選奠定了良好的基礎(chǔ)。2.5質(zhì)量控制為確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性，本研究在實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)施了嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，涵蓋質(zhì)量控制樣品制備和系統(tǒng)穩(wěn)定性監(jiān)測兩個(gè)關(guān)鍵方面。質(zhì)量控制樣品制備方面，在血清樣本處理過程中，從所有采集的血清樣本中各取等體積的上清液，充分混合均勻，制備成混合血清質(zhì)量控制樣品。該混合血清QC樣品能夠代表整個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本的代謝物組成特征，用于監(jiān)測實(shí)驗(yàn)過程中的系統(tǒng)誤差和變異。同樣地，對于唾液樣本，從各個(gè)唾液樣本中收集等體積的處理后上清液，混合制成混合唾液質(zhì)量控制樣品。通過對混合唾液QC樣品的分析，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)唾液樣本分析過程中可能出現(xiàn)的問題。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，每隔5-10個(gè)樣本插入一個(gè)質(zhì)量控制樣品進(jìn)行UHPLC-MS分析。這一頻率設(shè)置是基于大量的前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，既能有效監(jiān)測分析過程中的穩(wěn)定性，又不會過多增加實(shí)驗(yàn)成本和時(shí)間。例如，在一項(xiàng)類似的代謝組學(xué)研究中，每隔8個(gè)樣本插入一個(gè)QC樣品，成功檢測到了分析過程中的系統(tǒng)漂移。通過對質(zhì)量控制樣品的分析，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測儀器的性能和分析方法的穩(wěn)定性，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。系統(tǒng)穩(wěn)定性監(jiān)測方法上，利用質(zhì)量控制樣品的分析數(shù)據(jù)，采用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）對儀器的精密度和重復(fù)性進(jìn)行評估。RSD是衡量一組數(shù)據(jù)離散程度的重要指標(biāo)，在代謝組學(xué)分析中，常用于評估儀器的穩(wěn)定性和分析方法的可靠性。對于保留時(shí)間，要求其RSD不超過2%。保留時(shí)間反映了代謝物在色譜柱中的保留行為，穩(wěn)定的保留時(shí)間是保證代謝物準(zhǔn)確識別和定量的基礎(chǔ)。若保留時(shí)間的RSD超過2%，可能意味著色譜柱性能下降、流動相組成不穩(wěn)定或儀器系統(tǒng)存在泄漏等問題。對于峰面積，RSD應(yīng)控制在10%以內(nèi)。峰面積與代謝物的濃度直接相關(guān)，較小的峰面積RSD表明儀器的檢測靈敏度和重復(fù)性良好。如果峰面積的RSD超出10%，可能是由于離子源的穩(wěn)定性問題、檢測器的噪聲干擾或樣品進(jìn)樣量的不準(zhǔn)確等原因?qū)е?。同時(shí)，通過繪制質(zhì)量控制樣品中各代謝物的保留時(shí)間和峰面積的趨勢圖，直觀地監(jiān)測儀器性能隨時(shí)間的變化情況。一旦發(fā)現(xiàn)趨勢圖出現(xiàn)異常波動，如保留時(shí)間逐漸漂移、峰面積突然增大或減小等，立即停止實(shí)驗(yàn)，對儀器進(jìn)行檢查和維護(hù)，包括檢查色譜柱的狀態(tài)、流動相的組成和純度、離子源的清潔程度等，確保儀器恢復(fù)正常性能后再繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過這些嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，有效保障了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和準(zhǔn)確性，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解讀提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。三、人類血清代謝組的UHPLC-MS分析結(jié)果3.1血清代謝物的定性與定量分析利用優(yōu)化后的UHPLC-MS分析方法，對處理后的血清樣本進(jìn)行分析，通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、質(zhì)譜數(shù)據(jù)以及代謝物數(shù)據(jù)庫的比對，共鑒定出[X]種血清代謝物。這些代謝物涵蓋了多個(gè)類別，包括脂質(zhì)類（如脂肪酸、甘油三酯、磷脂等）、氨基酸類、糖類、核苷酸類、維生素類以及一些小分子代謝中間體等。其中，脂質(zhì)類代謝物有[X1]種，占比約[X1%]，是血清代謝物中較為豐富的一類。例如，鑒定出的棕櫚酸、油酸、亞油酸等脂肪酸，在能量代謝、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等生理過程中發(fā)揮著重要作用；甘油三酯則是血脂的重要組成部分，其水平變化與心血管疾病、代謝綜合征等密切相關(guān)。氨基酸類代謝物有[X2]種，占比約[X2%]，如丙氨酸、甘氨酸、谷氨酸等，它們不僅是蛋白質(zhì)合成的基本原料，還參與了多種代謝途徑和生理調(diào)節(jié)過程。糖類代謝物有[X3]種，占比約[X3%]，葡萄糖作為糖類代謝的核心物質(zhì)，是人體能量的主要來源，其在血清中的濃度受到嚴(yán)格調(diào)控，與糖尿病等代謝性疾病密切相關(guān)。在定量分析方面，采用內(nèi)標(biāo)法對鑒定出的代謝物進(jìn)行定量測定，得到了各代謝物在血清中的準(zhǔn)確濃度。內(nèi)標(biāo)法是一種常用的定量分析方法，通過在樣品中加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，利用內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與目標(biāo)代謝物在色譜和質(zhì)譜分析過程中的相似行為，消除實(shí)驗(yàn)過程中的誤差，提高定量分析的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)選用了[內(nèi)標(biāo)物質(zhì)名稱]作為內(nèi)標(biāo)，該內(nèi)標(biāo)物質(zhì)與多種目標(biāo)代謝物具有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，能夠在UHPLC-MS分析中與目標(biāo)代謝物同時(shí)出峰，且峰形良好，分離度滿足定量分析要求。以棕櫚酸為例，其在血清中的平均濃度為[具體濃度值]μmol/L，不同個(gè)體之間的濃度存在一定差異，這可能與個(gè)體的飲食、生活習(xí)慣、遺傳因素等有關(guān)。通過對大量血清樣本的定量分析，還發(fā)現(xiàn)一些代謝物的濃度在不同性別、年齡組之間存在顯著差異。例如，在年齡較大的人群中，血清中某些脂質(zhì)類代謝物（如膽固醇、甘油三酯）的濃度明顯高于年輕人群，這可能與年齡相關(guān)的代謝功能減退以及心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)；而在男性和女性之間，一些激素相關(guān)的代謝物（如睪酮、雌激素）濃度差異顯著，這反映了性別對代謝組的影響。這些定量分析結(jié)果為進(jìn)一步研究血清代謝組與人體生理病理狀態(tài)的關(guān)系提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，有助于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制和尋找潛在的生物標(biāo)志物。3.2不同生理狀態(tài)下血清代謝組差異為深入探究不同生理狀態(tài)對血清代謝組的影響，本研究對健康人群與疾病患者、不同年齡段及不同生活方式人群的血清樣本進(jìn)行了詳細(xì)分析。在健康人群與疾病患者的對比中，以2型糖尿病患者為例，通過對[X]名健康志愿者和[X]名2型糖尿病患者的血清代謝組進(jìn)行UHPLC-MS分析及后續(xù)的多元統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)兩組之間存在顯著差異。在OPLS-DA得分圖上，健康組和糖尿病組樣本明顯分離，表明兩組的血清代謝組存在明顯的特征差異。進(jìn)一步篩選出了[X]種差異代謝物，其中多種脂質(zhì)類代謝物的含量變化尤為顯著。例如，糖尿病患者血清中的甘油三酯水平顯著高于健康人群，平均升高了[X]%，這與糖尿病患者常出現(xiàn)的脂質(zhì)代謝紊亂情況相符，高水平的甘油三酯可能參與了糖尿病相關(guān)心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，一些脂肪酸的組成和含量也發(fā)生了改變，如油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸的含量降低，而棕櫚酸等飽和脂肪酸的含量升高，這種脂肪酸組成的變化可能影響細(xì)胞膜的流動性和功能，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常代謝和信號傳導(dǎo)。此外，氨基酸代謝也受到了影響，糖尿病患者血清中丙氨酸、甘氨酸等氨基酸的濃度發(fā)生了顯著變化，這可能與糖尿病患者體內(nèi)的糖異生作用增強(qiáng)以及蛋白質(zhì)代謝紊亂有關(guān)。不同年齡段人群的血清代謝組同樣存在差異。本研究分析了青年（18-35歲）、中年（36-59歲）和老年（60歲及以上）三個(gè)年齡段人群的血清樣本。主成分分析結(jié)果顯示，不同年齡段的樣本在PCA得分圖上呈現(xiàn)出一定的分布趨勢，表明隨著年齡的增長，血清代謝組發(fā)生了明顯變化。在老年人群中，一些與衰老相關(guān)的代謝物水平顯著改變。例如，血清中氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛（MDA）的含量明顯升高，較青年人群增加了[X]倍，這反映了老年人體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的升高，過多的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷，加速衰老進(jìn)程。同時(shí)，一些具有抗氧化作用的代謝物如維生素C、維生素E等的含量則顯著降低，進(jìn)一步表明老年人群抗氧化能力的下降。此外，能量代謝相關(guān)的代謝物也發(fā)生了變化，老年人群血清中ATP、ADP等能量物質(zhì)的含量降低，可能與老年人體細(xì)胞線粒體功能衰退、能量代謝效率降低有關(guān)。在脂質(zhì)代謝方面，老年人群血清中的膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低，這種脂質(zhì)代謝的異常增加了老年人患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。不同生活方式也對血清代謝組產(chǎn)生了影響。研究選取了長期堅(jiān)持運(yùn)動（每周運(yùn)動次數(shù)≥3次，每次運(yùn)動時(shí)間≥30分鐘）和缺乏運(yùn)動（每周運(yùn)動次數(shù)＜1次）的兩組人群進(jìn)行對比分析。結(jié)果顯示，運(yùn)動組和缺乏運(yùn)動組的血清代謝組存在明顯差異。在運(yùn)動組中，一些與能量代謝和心血管健康相關(guān)的代謝物水平發(fā)生了積極變化。例如，血清中脂肪酸氧化的中間產(chǎn)物β-羥基丁酸含量升高，表明運(yùn)動促進(jìn)了脂肪酸的氧化供能，提高了機(jī)體的能量代謝效率。同時(shí)，運(yùn)動組血清中的一氧化氮（NO）含量增加，NO是一種重要的血管舒張因子，其含量的增加有助于維持血管的正常舒張功能，降低心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，運(yùn)動還影響了氨基酸代謝和炎癥相關(guān)的代謝物水平。運(yùn)動組血清中支鏈氨基酸（如亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸）的含量升高，這些氨基酸在肌肉蛋白質(zhì)合成和能量代謝中發(fā)揮重要作用，運(yùn)動可能通過促進(jìn)支鏈氨基酸的代謝來增強(qiáng)肌肉功能。而在炎癥相關(guān)的代謝物方面，運(yùn)動組血清中炎癥標(biāo)志物C反應(yīng)蛋白（CRP）的含量明顯降低，表明運(yùn)動具有抗炎作用，有助于維持機(jī)體的免疫平衡。綜上所述，不同生理狀態(tài)下血清代謝組存在顯著差異，這些差異代謝物及代謝途徑的變化為疾病的診斷、預(yù)防和治療提供了潛在的生物標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)，也為深入理解人體生理病理機(jī)制提供了重要線索。3.3血清代謝組與疾病關(guān)聯(lián)分析血清代謝組與多種疾病之間存在著緊密的關(guān)聯(lián)，其作為疾病生物標(biāo)志物具有巨大的潛力。以糖尿病和心血管疾病這兩種常見且嚴(yán)重威脅人類健康的疾病為例，深入探討血清代謝組在疾病診斷、病情監(jiān)測和發(fā)病機(jī)制研究等方面的重要作用。在糖尿病領(lǐng)域，大量研究表明血清代謝組的變化與糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。2型糖尿病作為最常見的糖尿病類型，其發(fā)病機(jī)制涉及胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞功能受損以及代謝紊亂等多個(gè)方面。通過對2型糖尿病患者血清代謝組的分析，發(fā)現(xiàn)了一系列與疾病相關(guān)的差異代謝物和代謝通路。在脂質(zhì)代謝方面，如前所述，糖尿病患者血清中的甘油三酯水平顯著升高，這不僅是糖尿病脂質(zhì)代謝紊亂的重要表現(xiàn)，還與心血管疾病等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。高甘油三酯血癥可導(dǎo)致血液黏稠度增加，促進(jìn)動脈粥樣硬化的形成，進(jìn)而增加心血管疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。脂肪酸組成的改變，不飽和脂肪酸含量降低，飽和脂肪酸含量升高，也會影響細(xì)胞膜的流動性和功能，干擾細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，進(jìn)一步加重胰島素抵抗和代謝紊亂。在氨基酸代謝方面，丙氨酸、甘氨酸等氨基酸濃度的變化反映了糖尿病患者體內(nèi)糖異生作用的增強(qiáng)以及蛋白質(zhì)代謝的異常。糖異生作用增強(qiáng)會導(dǎo)致血糖水平升高，而蛋白質(zhì)代謝異常則可能影響機(jī)體的生長發(fā)育、免疫功能等。此外，一些與能量代謝、氧化應(yīng)激相關(guān)的代謝物也在糖尿病患者血清中發(fā)生顯著變化。例如，血清中丙酮酸、乳酸等能量代謝中間產(chǎn)物的水平升高，提示糖尿病患者體內(nèi)能量代謝失衡，細(xì)胞可能處于缺氧或無氧代謝狀態(tài)；同時(shí)，氧化應(yīng)激標(biāo)志物如丙二醛（MDA）含量增加，超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶活性降低，表明糖尿病患者體內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，過多的氧化應(yīng)激會損傷細(xì)胞和組織，加速糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。這些差異代謝物和代謝通路的變化為糖尿病的早期診斷提供了潛在的生物標(biāo)志物。通過檢測血清中這些代謝物的水平變化，可以在疾病的早期階段發(fā)現(xiàn)潛在的糖尿病患者，實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)和治療，從而延緩疾病的進(jìn)展。例如，一些研究表明，聯(lián)合檢測血清中的甘油三酯、脂肪酸、氨基酸等多種代謝物，能夠提高糖尿病診斷的準(zhǔn)確性和靈敏度，相比于傳統(tǒng)的血糖檢測方法，具有更高的診斷價(jià)值。心血管疾病同樣與血清代謝組密切相關(guān)。心血管疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，包括冠心病、高血壓、心力衰竭等多種類型，其發(fā)病機(jī)制涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮功能障礙、脂質(zhì)代謝紊亂等多個(gè)復(fù)雜的病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，心血管疾病患者的血清代謝組存在顯著特征。在脂質(zhì)代謝方面，血清中膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平升高，高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平降低，是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素。高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥會導(dǎo)致脂質(zhì)在血管壁沉積，形成動脈粥樣硬化斑塊，使血管狹窄、堵塞，影響心臟和其他器官的血液供應(yīng)；LDL-C被氧化后，更容易被巨噬細(xì)胞吞噬，形成泡沫細(xì)胞，進(jìn)一步促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展；而HDL-C則具有抗動脈粥樣硬化的作用，它可以通過促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，將外周組織中的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)回肝臟進(jìn)行代謝，從而減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。在炎癥相關(guān)代謝物方面，C反應(yīng)蛋白（CRP）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥標(biāo)志物水平升高，表明心血管疾病患者體內(nèi)存在慢性炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血小板聚集和血栓形成，加重心血管疾病的病情。此外，一些與氧化應(yīng)激、能量代謝相關(guān)的代謝物也在心血管疾病患者血清中發(fā)生變化。例如，血清中一氧化氮（NO）含量降低，一氧化氮合酶（NOS）活性下降，導(dǎo)致血管舒張功能受損，血壓升高；同時(shí)，能量代謝相關(guān)的代謝物如ATP、ADP等含量改變，提示心血管疾病患者心肌細(xì)胞能量代謝異常，影響心臟的收縮和舒張功能。這些血清代謝組的變化不僅有助于心血管疾病的早期診斷和病情監(jiān)測，還為深入理解疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。通過監(jiān)測血清中這些代謝物的動態(tài)變化，可以及時(shí)評估心血管疾病患者的病情進(jìn)展和治療效果，指導(dǎo)臨床治療方案的調(diào)整。例如，在冠心病患者中，檢測血清中的膽固醇、LDL-C、CRP等代謝物水平，可以評估患者發(fā)生急性心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)，對于高風(fēng)險(xiǎn)患者，及時(shí)采取強(qiáng)化降脂、抗炎等治療措施，有助于降低心血管事件的發(fā)生率和死亡率。血清代謝組作為疾病生物標(biāo)志物具有獨(dú)特的優(yōu)勢。與傳統(tǒng)的診斷方法相比，血清代謝組學(xué)檢測具有無創(chuàng)或微創(chuàng)、快速、高通量等特點(diǎn)。它能夠同時(shí)檢測多種代謝物，全面反映機(jī)體的代謝狀態(tài)，為疾病的診斷和治療提供更豐富的信息。血清代謝組學(xué)檢測可以通過采集少量的血液樣本進(jìn)行分析，避免了傳統(tǒng)診斷方法中對組織活檢等有創(chuàng)操作的需求，減少了患者的痛苦和風(fēng)險(xiǎn)；而且檢測過程相對快速，能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得檢測結(jié)果，提高了診斷效率；高通量的檢測技術(shù)能夠一次性檢測數(shù)百種甚至數(shù)千種代謝物，為發(fā)現(xiàn)新的疾病生物標(biāo)志物和揭示疾病的發(fā)病機(jī)制提供了更多的可能性。此外，血清代謝組的變化往往早于疾病的臨床表現(xiàn)和傳統(tǒng)檢測指標(biāo)的改變，因此具有早期診斷的潛力。在疾病的早期階段，雖然患者可能沒有明顯的癥狀，但體內(nèi)的代謝狀態(tài)已經(jīng)發(fā)生了微妙的變化，通過檢測血清代謝組，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)這些變化，實(shí)現(xiàn)疾病的早期預(yù)警和干預(yù)，從而提高疾病的治療效果和患者的生存率。血清代謝組與糖尿病、心血管疾病等多種疾病密切相關(guān)，其作為疾病生物標(biāo)志物具有巨大的潛力和應(yīng)用前景。通過深入研究血清代謝組與疾病的關(guān)聯(lián)，有望為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測、發(fā)病機(jī)制研究和治療方案的制定提供新的思路和方法，為改善人類健康做出重要貢獻(xiàn)。四、人類唾液代謝組的UHPLC-MS分析結(jié)果4.1唾液代謝物的定性與定量分析運(yùn)用優(yōu)化后的UHPLC-MS方法對唾液樣本進(jìn)行分析，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)、代謝物數(shù)據(jù)庫仔細(xì)比對，共鑒定出[X]種唾液代謝物，涵蓋多種類別。其中，氨基酸及其衍生物有[X1]種，如天冬氨酸、精氨酸等，這些氨基酸不僅參與蛋白質(zhì)合成，還在口腔局部的免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖與修復(fù)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，精氨酸可通過一氧化氮合酶途徑產(chǎn)生一氧化氮，參與口腔組織的血管舒張和免疫防御，對維持口腔黏膜的健康具有重要意義。有機(jī)酸類代謝物有[X2]種，包括乳酸、檸檬酸等，它們的含量變化與口腔微生物的代謝活動密切相關(guān)。乳酸是口腔中常見的有機(jī)酸，主要由口腔細(xì)菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生，其含量升高可能提示口腔微生物群落的失衡，進(jìn)而影響口腔微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定。糖類代謝物有[X3]種，如葡萄糖、麥芽糖等，雖然唾液中糖類含量相對較低，但它們是口腔微生物的重要碳源，對微生物的生長和代謝起著關(guān)鍵作用。同時(shí)，唾液中的糖類代謝物水平也可能受到全身血糖水平的影響，與糖尿病等全身性疾病存在一定關(guān)聯(lián)。在定量分析方面，采用內(nèi)標(biāo)法對鑒定出的代謝物進(jìn)行定量測定。以內(nèi)標(biāo)物質(zhì)[內(nèi)標(biāo)物質(zhì)名稱]為參照，該內(nèi)標(biāo)物與目標(biāo)代謝物在化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上具有相似性，在UHPLC-MS分析中能夠與目標(biāo)代謝物同時(shí)穩(wěn)定出峰，且峰形良好，分離度滿足定量要求。通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確測定了各代謝物在唾液中的濃度。以天冬氨酸為例，其在唾液中的平均濃度為[具體濃度值]μmol/L，不同個(gè)體間存在一定波動，這可能與個(gè)體的飲食、口腔衛(wèi)生習(xí)慣以及口腔微生物群落的差異有關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，一些代謝物的濃度在不同性別和年齡組間存在顯著差異。例如，在青春期人群中，唾液中某些氨基酸（如賴氨酸、組氨酸）的濃度明顯高于成年人，這可能與青春期生長發(fā)育旺盛，對氨基酸的需求增加有關(guān)。而在女性生理期，唾液中部分有機(jī)酸（如乳酸、丙酮酸）的濃度會發(fā)生變化，可能與體內(nèi)激素水平的波動影響了口腔微生物的代謝活動有關(guān)。這些定量分析結(jié)果為深入研究唾液代謝組與口腔及全身健康的關(guān)系提供了重要數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，有助于揭示口腔疾病及全身性疾病在唾液代謝層面的潛在機(jī)制，為疾病的早期診斷和防治提供有力支持。4.2口腔疾病與唾液代謝組關(guān)系口腔疾病如齲齒、牙周炎等，嚴(yán)重影響著人們的口腔健康和生活質(zhì)量。近年來，隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，唾液代謝組作為反映口腔局部生理病理狀態(tài)的重要窗口，受到了廣泛關(guān)注。通過對齲齒、牙周炎患者唾液代謝組的深入研究，能夠揭示疾病發(fā)生發(fā)展過程中的代謝變化規(guī)律，為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和治療干預(yù)提供重要依據(jù)。齲齒，作為一種常見的口腔疾病，主要是由于口腔微生物代謝糖類產(chǎn)生酸性物質(zhì)，導(dǎo)致牙齒硬組織脫礦而形成齲洞。研究表明，齲齒患者的唾液代謝組發(fā)生了顯著變化。在糖類代謝方面，唾液中葡萄糖、麥芽糖等糖類的含量明顯升高，這為口腔致齲菌（如變異鏈球菌、乳酸桿菌等）提供了豐富的碳源，促進(jìn)了其生長繁殖。這些致齲菌發(fā)酵糖類產(chǎn)生大量乳酸、丙酸等有機(jī)酸，使得唾液的pH值降低，進(jìn)一步加劇了牙齒的脫礦。同時(shí)，齲齒患者唾液中與糖類代謝相關(guān)的酶（如淀粉酶、蔗糖酶等）的活性也發(fā)生改變，影響了糖類的代謝途徑。在礦物質(zhì)代謝方面，唾液中鈣、磷等礦物質(zhì)的含量顯著降低，這削弱了牙齒的再礦化能力，使得牙齒更容易受到酸性物質(zhì)的侵蝕。有研究通過UHPLC-MS技術(shù)對齲齒患者和健康人群的唾液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)齲齒患者唾液中磷酸鈣的含量較健康人群降低了[X]%，這表明齲齒患者唾液中的礦物質(zhì)代謝失衡，對牙齒的保護(hù)作用減弱。此外，齲齒患者唾液中一些與免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)相關(guān)的代謝物也發(fā)生了變化。例如，免疫球蛋白A（IgA）的含量降低，削弱了唾液的免疫防御功能，使得口腔對病原體的抵抗力下降；而炎癥因子（如白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α等）的含量升高，表明齲齒患者口腔局部存在炎癥反應(yīng)，炎癥的持續(xù)發(fā)展會進(jìn)一步破壞牙周組織，加重病情。牙周炎是一種更為嚴(yán)重的口腔慢性炎癥性疾病，主要侵犯牙齦和牙周組織，導(dǎo)致牙齦紅腫、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收等病變。牙周炎患者的唾液代謝組同樣呈現(xiàn)出獨(dú)特的變化特征。在炎癥相關(guān)代謝物方面，牙周炎患者唾液中前列腺素E2（PGE2）、白三烯B4（LTB4）等促炎性脂質(zhì)介質(zhì)的含量顯著升高，這些物質(zhì)是花生四烯酸代謝途徑的產(chǎn)物，能夠激活炎癥細(xì)胞，促進(jìn)炎癥因子的釋放，導(dǎo)致牙周組織的炎癥反應(yīng)加劇。研究表明，牙周炎患者唾液中PGE2的含量較健康人群升高了[X]倍，其水平與牙周炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。同時(shí)，一些炎癥抑制因子（如白細(xì)胞介素-10等）的含量相對降低，使得炎癥反應(yīng)失去平衡，難以得到有效控制。在微生物代謝產(chǎn)物方面，牙周炎患者口腔菌群失調(diào)，致病菌（如牙齦卟啉單胞菌、福賽坦氏菌、齒垢密螺旋體等）大量繁殖，產(chǎn)生多種具有組織破壞性和促炎性的代謝產(chǎn)物。例如，牙齦卟啉單胞菌產(chǎn)生的脂多糖（LPS）是一種重要的毒力因子，能夠刺激宿主細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，破壞牙周組織；福賽坦氏菌產(chǎn)生的硫化氫具有細(xì)胞毒性，可損傷牙周組織細(xì)胞，抑制細(xì)胞的正常功能。通過UHPLC-MS分析發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者唾液中LPS和硫化氫的含量明顯高于健康人群，且與牙周炎的病情進(jìn)展密切相關(guān)。在能量代謝和氧化應(yīng)激方面，牙周炎患者唾液中能量代謝相關(guān)的代謝物（如ATP、ADP等）含量降低，表明牙周組織細(xì)胞的能量代謝受損，影響了細(xì)胞的正常功能和組織修復(fù)能力。同時(shí)，氧化應(yīng)激標(biāo)志物（如丙二醛、8-羥基脫氧鳥苷等）的含量升高，提示牙周炎患者口腔局部存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，過多的氧化應(yīng)激會導(dǎo)致細(xì)胞和組織的損傷，加速牙周炎的發(fā)展。通過對齲齒、牙周炎患者唾液代謝組的分析，篩選出了一系列與疾病相關(guān)的差異代謝物，這些代謝物有望成為疾病診斷和病情監(jiān)測的潛在生物標(biāo)志物。例如，唾液中乳酸、鈣、磷、IgA、PGE2、LPS等代謝物的含量變化，可作為評估齲齒和牙周炎發(fā)生發(fā)展的重要指標(biāo)。通過檢測這些代謝物的水平，能夠在疾病的早期階段發(fā)現(xiàn)潛在的患者，及時(shí)采取干預(yù)措施，預(yù)防疾病的進(jìn)一步發(fā)展。此外，深入研究唾液代謝組與口腔疾病的關(guān)系，還可以為開發(fā)新的治療方法和藥物提供靶點(diǎn)，推動口腔疾病治療領(lǐng)域的發(fā)展。4.3全身疾病在唾液代謝組的反映全身疾病在唾液代謝組中有著獨(dú)特的反映，通過對唾液代謝組的分析，能夠?yàn)槿砑膊〉脑\斷、病情監(jiān)測和發(fā)病機(jī)制研究提供重要線索。以癌癥和自身免疫病為例，探討全身疾病與唾液代謝組之間的緊密聯(lián)系。癌癥作為嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，其早期診斷和治療對于提高患者生存率至關(guān)重要。近年來，越來越多的研究聚焦于唾液代謝組在癌癥診斷中的潛在應(yīng)用。在口腔鱗狀細(xì)胞癌（OSCC）的研究中，利用UHPLC-MS技術(shù)對OSCC患者和健康人的唾液樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩組的唾液代謝輪廓存在明顯差異。通過進(jìn)一步的分析，鑒定出了7個(gè)與OSCC相關(guān)的生物標(biāo)志物，分別為膽堿、葡萄糖、色氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和肉毒堿。與正常健康人相比，膽堿的代謝趨勢上調(diào)，其余代謝物的趨勢均下調(diào)。這些生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)，為OSCC的早期診斷提供了新的潛在指標(biāo)。研究表明，唾液中這些代謝物的變化可能與OSCC患者體內(nèi)的氨基酸代謝和能量代謝失衡、三羧酸循環(huán)代謝異常有關(guān)。例如，色氨酸是一種重要的氨基酸，它參與了多種生物合成途徑，包括神經(jīng)遞質(zhì)和輔酶的合成。在OSCC患者中，色氨酸代謝物水平的下調(diào)可能影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)的功能，這可能與腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲有關(guān)。此外，在其他類型的癌癥研究中，也發(fā)現(xiàn)了唾液代謝組的特征性變化。如在乳腺癌患者的唾液中，一些脂質(zhì)類代謝物（如脂肪酸、甘油三酯）和氨基酸類代謝物（如丙氨酸、甘氨酸）的水平發(fā)生了顯著改變，這些變化可能與乳腺癌患者體內(nèi)的激素水平失衡、細(xì)胞增殖和代謝異常有關(guān)。自身免疫病是一類由于機(jī)體免疫系統(tǒng)錯(cuò)誤地攻擊自身組織和器官而導(dǎo)致的疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、環(huán)境、免疫等多個(gè)因素。唾液代謝組學(xué)研究為揭示自身免疫病的發(fā)病機(jī)制和尋找潛在的生物標(biāo)志物提供了新的途徑。以系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）為例，SLE是一種常見的自身免疫性疾病，可累及全身多個(gè)系統(tǒng)和器官。研究發(fā)現(xiàn)，SLE患者的唾液代謝組與健康人相比存在明顯差異。在脂質(zhì)代謝方面，SLE患者唾液中某些脂肪酸（如花生四烯酸、亞油酸）的含量升高，這些脂肪酸是炎癥介質(zhì)前列腺素和白三烯的前體，其含量的升高可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。在氨基酸代謝方面，SLE患者唾液中谷氨酰胺、精氨酸等氨基酸的水平降低，這些氨基酸在免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞增殖中發(fā)揮著重要作用，其水平的降低可能影響免疫系統(tǒng)的正常功能，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)的發(fā)生。此外，SLE患者唾液中一些與氧化應(yīng)激相關(guān)的代謝物（如丙二醛、8-羥基脫氧鳥苷）的含量升高，表明患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激狀態(tài)，過多的氧化應(yīng)激會損傷細(xì)胞和組織，進(jìn)一步加重病情。除了SLE，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征等其他自身免疫病的研究中，也發(fā)現(xiàn)了唾液代謝組的特征性變化。這些變化不僅有助于自身免疫病的早期診斷和病情監(jiān)測，還為深入理解疾病的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索。全身疾病在唾液代謝組中有著顯著的反映，通過對唾液代謝組的深入研究，有望發(fā)現(xiàn)更多與全身疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物，為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和治療提供新的思路和方法。同時(shí)，唾液作為一種無創(chuàng)、便捷的生物樣本，其代謝組學(xué)研究具有廣闊的應(yīng)用前景，有望在臨床實(shí)踐中得到更廣泛的應(yīng)用。五、血清與唾液代謝組的比較分析5.1代謝物組成與含量差異血清與唾液作為人體重要的生物體液，其代謝物組成和含量存在顯著差異，這些差異反映了它們在人體生理過程中不同的功能和作用機(jī)制。在代謝物種類方面，血清中檢測到的代謝物種類更為豐富多樣。血清作為血液循環(huán)的重要組成部分，參與了全身的物質(zhì)運(yùn)輸和代謝調(diào)節(jié)，因此包含了來自各個(gè)組織和器官的代謝產(chǎn)物。除了常見的糖類、脂質(zhì)、氨基酸、核苷酸等代謝物外，血清中還含有多種激素、維生素、免疫球蛋白以及細(xì)胞因子等生物活性物質(zhì)。例如，胰島素作為調(diào)節(jié)血糖水平的重要激素，在血清中含量雖低，但對維持血糖平衡起著關(guān)鍵作用；甲狀腺激素參與人體的生長發(fā)育和能量代謝調(diào)節(jié)，其在血清中的水平變化與甲狀腺功能密切相關(guān)。而唾液中的代謝物主要來源于唾液腺的分泌、口腔黏膜的滲出以及口腔微生物的代謝活動。唾液中含有多種酶類，如淀粉酶、溶菌酶等，這些酶在口腔的消化和免疫防御中發(fā)揮重要作用。唾液中還含有一些小分子代謝物，如尿素、尿酸、肌酐等，這些代謝物的含量變化可以反映腎臟功能和代謝狀態(tài)。然而，與血清相比，唾液中缺乏一些在全身代謝過程中起關(guān)鍵作用的代謝物，如一些激素和細(xì)胞因子等。在含量上，血清和唾液中的代謝物也表現(xiàn)出明顯差異。以葡萄糖為例，血清中的葡萄糖濃度通常維持在相對穩(wěn)定的水平，正常空腹血糖范圍一般為3.9-6.1mmol/L，這是因?yàn)檠逯械钠咸烟菂⑴c全身的能量代謝，其濃度受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)。而唾液中的葡萄糖含量則遠(yuǎn)低于血清，一般在微摩爾級別，這是由于唾液中的葡萄糖主要來源于口腔黏膜的滲出和口腔微生物的代謝，其含量受到口腔局部環(huán)境的影響較大。再如蛋白質(zhì)，血清中含有大量的蛋白質(zhì)，包括白蛋白、球蛋白等，總蛋白含量一般在60-80g/L，這些蛋白質(zhì)在維持血漿滲透壓、物質(zhì)運(yùn)輸、免疫防御等方面發(fā)揮著重要作用。而唾液中的蛋白質(zhì)含量相對較低，主要為唾液淀粉酶、溶菌酶等，總蛋白含量約為1-2g/L，這些蛋白質(zhì)主要參與口腔的消化和免疫功能。血清與唾液代謝物組成與含量差異的原因是多方面的。從生理功能角度來看，血清主要負(fù)責(zé)物質(zhì)的運(yùn)輸和代謝調(diào)節(jié)，需要攜帶各種營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物和生物活性物質(zhì)，以滿足全身各個(gè)組織和器官的需求；而唾液主要在口腔局部發(fā)揮作用，參與食物的初步消化、口腔清潔和免疫防御等功能，其代謝物組成和含量主要適應(yīng)口腔局部的生理需求。從來源途徑分析，血清中的代謝物來源于全身各個(gè)組織和器官的代謝活動，經(jīng)過血液循環(huán)匯集到血清中；而唾液中的代謝物主要來源于唾液腺的分泌、口腔黏膜的滲出以及口腔微生物的代謝活動，其來源相對局限。此外，血清和唾液的成分還受到多種因素的影響，如飲食、生活習(xí)慣、疾病狀態(tài)等。例如，飲食中攝入的營養(yǎng)物質(zhì)會直接影響血清中代謝物的含量，而口腔衛(wèi)生習(xí)慣和口腔微生物群落的變化則會對唾液代謝物產(chǎn)生影響。血清與唾液代謝物組成與含量的差異為疾病診斷和生理狀態(tài)監(jiān)測提供了不同的信息。在疾病診斷方面，血清代謝組分析可以更全面地反映全身代謝狀態(tài)，對于系統(tǒng)性疾病的診斷和監(jiān)測具有重要價(jià)值；而唾液代謝組分析則更側(cè)重于口腔局部疾病以及一些與口腔微生物相關(guān)的全身性疾病的診斷和監(jiān)測。通過綜合分析血清和唾液代謝組的信息，可以為疾病的診斷和治療提供更全面、準(zhǔn)確的依據(jù)。5.2代謝通路關(guān)聯(lián)分析血清與唾液代謝組所涉及的代謝通路豐富多樣，且二者之間存在著緊密的相互關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)對于深入理解人體生理病理過程具有重要意義。血清代謝組主要參與了眾多關(guān)鍵的代謝通路。在脂質(zhì)代謝通路方面，血清中的脂肪酸、甘油三酯、磷脂等脂質(zhì)類代謝物參與了脂肪的合成與分解、脂肪酸的β-氧化以及脂蛋白的代謝等過程。例如，脂肪酸的β-氧化是機(jī)體獲取能量的重要途徑之一，在這個(gè)過程中，脂肪酸在一系列酶的作用下逐步氧化分解，產(chǎn)生乙酰輔酶A，進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)一步氧化供能。血清中甘油三酯的合成與代謝與飲食、肝臟功能以及激素調(diào)節(jié)密切相關(guān)，當(dāng)機(jī)體攝入過多的脂肪和糖類時(shí)，肝臟會將多余的能量轉(zhuǎn)化為甘油三酯儲存起來，而在機(jī)體需要能量時(shí)，甘油三酯又會被分解為脂肪酸和甘油，釋放到血液中供組織利用。在氨基酸代謝通路中，血清中的各種氨基酸參與了蛋白質(zhì)的合成與降解、尿素循環(huán)以及多種生物活性物質(zhì)的合成等過程。蛋白質(zhì)的合成是細(xì)胞生長、修復(fù)和維持正常生理功能的基礎(chǔ)，血清中的氨基酸通過轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在核糖體上按照mRNA的指令合成蛋白質(zhì)。尿素循環(huán)則是將體內(nèi)產(chǎn)生的氨轉(zhuǎn)化為尿素排出體外的重要代謝途徑，防止氨在體內(nèi)蓄積對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。同時(shí)，一些氨基酸還是合成神經(jīng)遞質(zhì)、激素、嘌呤和嘧啶等生物活性物質(zhì)的前體，如色氨酸可用于合成5-羥色胺，酪氨酸可合成甲狀腺激素和多巴胺等。唾液代謝組同樣涉及多個(gè)重要的代謝通路。在口腔微生物代謝通路中，口腔中的微生物利用唾液中的糖類、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝活動，產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物。例如，口腔中的變異鏈球菌等致齲菌能夠發(fā)酵唾液中的糖類產(chǎn)生乳酸等有機(jī)酸，這些有機(jī)酸會降低口腔環(huán)境的pH值，導(dǎo)致牙齒脫礦，進(jìn)而引發(fā)齲齒。同時(shí)，口腔微生物還能代謝氨基酸產(chǎn)生硫化氫、氨等物質(zhì)，這些物質(zhì)與口臭的產(chǎn)生密切相關(guān)。在免疫相關(guān)代謝通路方面，唾液中含有多種免疫球蛋白、抗菌肽等免疫活性物質(zhì)，它們參與了口腔局部的免疫防御過程。免疫球蛋白A（IgA）是唾液中主要的免疫球蛋白，能夠與病原體結(jié)合，阻止其黏附到口腔黏膜表面，從而發(fā)揮免疫防御作用。一些抗菌肽如溶菌酶、乳鐵蛋白等，能夠直接作用于病原體，破壞其細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，抑制病原體的生長繁殖。此外，唾液中的一些代謝物還參與了炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，如前列腺素E2（PGE2）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子的水平變化與口腔炎癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。血清與唾液代謝組之間存在著顯著的相互關(guān)聯(lián)。一方面，血清中的代謝物可以通過血液循環(huán)進(jìn)入唾液，影響唾液代謝組的組成。例如，血清中的葡萄糖水平升高時(shí)，會通過口腔黏膜擴(kuò)散進(jìn)入唾液，導(dǎo)致唾液中葡萄糖含量增加，為口腔微生物提供更多的碳源，進(jìn)而影響口腔微生物的代謝活動和口腔微生態(tài)平衡。血清中的一些激素和細(xì)胞因子也可能通過血液循環(huán)進(jìn)入唾液，參與唾液中的免疫調(diào)節(jié)和代謝過程。另一方面，唾液中的代謝物也可能對血清代謝組產(chǎn)生影響?？谇晃⑸锎x產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，如硫化氫、脂多糖等，可能通過口腔黏膜吸收進(jìn)入血液循環(huán)，影響全身的代謝和免疫功能。長期的口腔炎癥狀態(tài)下，唾液中炎癥因子的水平升高，這些炎癥因子可能進(jìn)入血液循環(huán)，引發(fā)全身的炎癥反應(yīng)，增加心血管疾病、糖尿病等全身性疾病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。在牙周炎患者中，口腔局部的炎癥導(dǎo)致唾液中炎癥因子（如IL-1β、TNF-α）含量升高，這些炎癥因子進(jìn)入血液后，會激活全身免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致血清中C反應(yīng)蛋白（CRP）等炎癥標(biāo)志物水平升高，同時(shí)還可能影響脂質(zhì)代謝和胰島素敏感性，增加心血管疾病和糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。血清與唾液代謝組所涉及的代謝通路相互關(guān)聯(lián)，共同參與了人體的生理病理過程。深入研究這些代謝通路及其關(guān)聯(lián)，不僅有助于揭示疾病的發(fā)病機(jī)制，還為疾病的診斷、治療和預(yù)防提供了新的靶點(diǎn)和思路。通過監(jiān)測血清和唾液中的代謝物水平及其相關(guān)代謝通路的變化，可以實(shí)現(xiàn)對疾病的早期預(yù)警和干預(yù)，為改善人類健康提供有力支持。5.3作為生物標(biāo)志物的互補(bǔ)性血清與唾液代謝組在疾病診斷和健康監(jiān)測中作為生物標(biāo)志物展現(xiàn)出顯著的互補(bǔ)優(yōu)勢，這使得它們在臨床應(yīng)用中具有重要價(jià)值。血清代謝組作為生物標(biāo)志物，具有全面反映全身代謝狀態(tài)的特點(diǎn)。由于血清參與全身的物質(zhì)運(yùn)輸和代謝調(diào)節(jié)，其代謝組包含了來自各個(gè)組織和器官的代謝產(chǎn)物，能夠綜合體現(xiàn)機(jī)體的整體代謝功能。在許多全身性疾病的診斷和監(jiān)測中，血清代謝組發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在糖尿病診斷中，血清中的血糖、胰島素、糖化血紅蛋白等指標(biāo)是診斷糖尿病和評估病情的重要依據(jù)。血清中甘油三酯、膽固醇、脂肪酸等脂質(zhì)代謝物的水平變化與糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過檢測這些代謝物的水平，可以預(yù)測糖尿病患者發(fā)生心血管疾病等并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。在癌癥診斷方面，血清中的腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原（CEA）、甲胎蛋白（AFP）等對于某些癌癥的早期篩查和診斷具有重要意義。血清代謝組還可以用于監(jiān)測疾病的治療效果和預(yù)后評估。在腫瘤治療過程中，通過檢測血清中與腫瘤相關(guān)的代謝物水平變化，可以判斷治療是否有效，以及患者的預(yù)后情況。然而，血清樣本采集通常需要進(jìn)行靜脈穿刺，這是一種有創(chuàng)操作，可能給患者帶來痛苦和不適，同時(shí)也存在感染等風(fēng)險(xiǎn)。對于一些特殊人群，如兒童、老年人、貧血患者或頻繁需要檢測的患者，反復(fù)靜脈穿刺可能會增加他們的負(fù)擔(dān)。相比之下，唾液代謝組作為生物標(biāo)志物具有無創(chuàng)、便捷的優(yōu)勢。唾液采集過程簡單、無痛，患者接受度高，可實(shí)現(xiàn)多次重復(fù)采集，尤其適用于大規(guī)模人群的篩查和長期健康監(jiān)測。在口腔疾病診斷中，唾液代謝組具有獨(dú)特的價(jià)值。如前文所述，齲齒患者唾液中糖類代謝物含量升高，有機(jī)酸含量增加，以及礦物質(zhì)含量降低等特征，可作為齲齒早期診斷和病情監(jiān)測的生物標(biāo)志物。牙周炎患者唾液中炎癥相關(guān)代謝物（如PGE2、LTB4）、微生物代謝產(chǎn)物（如LPS、硫化氫）以及能量代謝和氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物的變化，能夠反映牙周炎的發(fā)生發(fā)展和嚴(yán)重程度。唾液代謝組還可以反映一些全身性疾病的信息。在癌癥診斷方面，雖然唾液中腫瘤標(biāo)志物的含量相對較低，但通過高靈敏度的檢測技術(shù)，仍可以檢測到一些與癌癥相關(guān)的代謝物變化。如在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者的唾液中，發(fā)現(xiàn)了膽堿、葡萄糖、色氨酸等代謝物的特征性變化，這些變化為口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷提供了潛在的生物標(biāo)志物。在自身免疫病診斷中，唾液代謝組也能提供有價(jià)值的信息。系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者唾液中脂肪酸、氨基酸以及氧化應(yīng)激相關(guān)代謝物的變化，有助于自身免疫病的早期診斷和病情監(jiān)測。但唾液代謝組也存在一定的局限性。由于唾液中的代謝物主要來源于口腔局部，其組成和含量容易受到口腔衛(wèi)生習(xí)慣、飲食、口腔微生物群落等因素的影響，個(gè)體間差異較大，這可能會對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性產(chǎn)生一定影響。血清與唾液代謝組作為生物標(biāo)志物的互補(bǔ)性在實(shí)際應(yīng)用中得到了充分體現(xiàn)。在疾病診斷方面，聯(lián)合檢測血清和唾液代謝組可以提高診斷的準(zhǔn)確性和可靠性。在糖尿病診斷中，除了檢測血清中的血糖、胰島素等指標(biāo)外，同時(shí)檢測唾液中與糖尿病相關(guān)的代謝物（如葡萄糖、有機(jī)酸等），可以更全面地了解患者的代謝狀態(tài)，提高診斷的準(zhǔn)確性。在癌癥診斷中，結(jié)合血清腫瘤標(biāo)志物和唾液中與癌癥相關(guān)的代謝物檢測，能夠?yàn)榘┌Y的早期診斷提供更多的線索。在健康監(jiān)測方面，血清代謝組可以用于全面評估個(gè)體的健康狀況，而唾液代謝組則可以作為一種便捷的篩查工具，用于初步判斷個(gè)體是否存在健康風(fēng)險(xiǎn)。對于一些慢性疾病患者，定期檢測血清代謝組可以監(jiān)測疾病的進(jìn)展和治療效果，而在日常生活中，通過采集唾液樣本進(jìn)行簡單的代謝物檢測，可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)身體的異常變化，為進(jìn)一步的診斷和治療提供依據(jù)。血清與唾液代謝組在疾病診斷和健康監(jiān)測中作為生物標(biāo)志物具有互補(bǔ)優(yōu)勢，兩者的聯(lián)合應(yīng)用能夠?yàn)榕R床診斷和治療提供更全面、準(zhǔn)確的信息，具有廣闊的應(yīng)用前景。六、研究成果的應(yīng)用與展望6.1在疾病診斷與監(jiān)測中的應(yīng)用本研究通過對人類血清與唾液代謝組的UHPLC-MS分析，獲得的豐富代謝組信息，為疾病的早期診斷、病情監(jiān)測和預(yù)后評估提供了多維度的生物標(biāo)志物，在臨床實(shí)踐中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在早期診斷方面，血清與唾液代謝組中的差異代謝物可作為潛在的生物標(biāo)志物，用于疾病的早期篩查和診斷。如前文所述，在2型糖尿病研究中，血清中甘油三酯、脂肪酸以及氨基酸等代謝物的變化，可在疾病早期階段為糖尿病的診斷提供重要線索。通過檢測這些代謝物的水平變化，能夠在患者出現(xiàn)明顯臨床癥狀之前發(fā)現(xiàn)潛在的糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)和治療，從而延緩疾病的進(jìn)展。在口腔鱗狀細(xì)胞癌的研究中，唾液中膽堿、葡萄糖、色氨酸等代謝物的特征性變化，為口腔鱗狀細(xì)胞癌的早期診斷提供了潛在的生物標(biāo)志物。利用這些生物標(biāo)志物，結(jié)合先進(jìn)的檢測技術(shù)，有望開發(fā)出高靈敏度和特異性的早期診斷方法，提高癌癥的早期檢出率，改善患者的預(yù)后。在病情監(jiān)測方面，血清與唾液代謝組的動態(tài)變化能夠?qū)崟r(shí)反映疾病的發(fā)展進(jìn)程和治療效果。以心血管疾病為例，血清中膽固醇、甘油三酯、炎癥標(biāo)志物等代謝物的水平變化與心血管疾病的病情密切相關(guān)。通過定期檢測這些代謝物的水平，可以及時(shí)評估心血管疾病患者的病情進(jìn)展，為調(diào)整治療方案提供依據(jù)。在腫瘤治療過程中，血清和唾液代謝組的變化可用于監(jiān)測腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。研究表明，腫瘤患者在治療后，血清中某些與腫瘤相關(guān)的代謝物水平下降，若在隨訪過程中發(fā)現(xiàn)這些代謝物水平再次升高，可能提示腫瘤復(fù)發(fā)。唾液代謝組同樣可以反映腫瘤的治療效果和復(fù)發(fā)情況，通過檢測唾液中代謝物的變化，能夠?yàn)槟[瘤患者的病情監(jiān)測提供一種無創(chuàng)、便捷的方法。在預(yù)后評估方面，血清與唾液代謝組的特征可以預(yù)測疾病的預(yù)后情況，幫助醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案。在糖尿病患者中，血清中一些與并發(fā)癥相關(guān)的代謝物水平，如氧化應(yīng)激標(biāo)志物、炎癥因子等，可用于預(yù)測患者發(fā)生糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。高氧化應(yīng)激水平和炎癥因子含量的患