基于RNAi技術(shù)：蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體構(gòu)建與煙草轉(zhuǎn)化的深度探究一、引言1.1研究背景蘋果莖溝病毒（AppleStemGroovingVirus，ASGV）是一種在果樹種植領(lǐng)域廣泛存在且危害嚴(yán)重的病毒，對(duì)蘋果、梨等多種果樹具有侵染性。在自然條件下，ASGV多呈潛伏侵染狀態(tài)，不易被早期察覺，這使得果農(nóng)往往錯(cuò)過最佳的防控時(shí)機(jī)。然而，隨著病毒在樹體內(nèi)的持續(xù)積累和擴(kuò)散，它會(huì)逐漸對(duì)果樹的生長發(fā)育和果實(shí)品質(zhì)產(chǎn)生顯著影響。從果樹生長狀況來看，感染ASGV的果樹樹勢(shì)會(huì)明顯衰退。新梢生長量大幅減少，導(dǎo)致樹冠發(fā)育不良，影響果樹的光合作用面積，進(jìn)而削弱果樹的整體生長活力。葉片也會(huì)出現(xiàn)一系列異常癥狀，如葉片變小、變硬，顏色變淺綠，且落葉時(shí)間提前。這些變化不僅影響了果樹的外觀，更重要的是降低了果樹的光合效率，減少了光合產(chǎn)物的積累，使得果樹無法為果實(shí)的生長發(fā)育提供充足的養(yǎng)分。在果實(shí)品質(zhì)方面，ASGV的危害同樣不容忽視?；疾」麡潆m然開花數(shù)量可能較多，但座果率卻顯著降低，導(dǎo)致產(chǎn)量大幅下降。即使成功結(jié)果，果實(shí)也往往表現(xiàn)為個(gè)頭小，果肉質(zhì)地堅(jiān)硬，口感變差，嚴(yán)重影響了果實(shí)的商品價(jià)值。在市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈的今天，果實(shí)品質(zhì)的下降意味著果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)效益將受到嚴(yán)重?fù)p害。據(jù)相關(guān)研究表明，在一些受ASGV嚴(yán)重侵染的果園，果實(shí)產(chǎn)量可減少45％-73％，這給果農(nóng)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)蘋果莖溝病毒的傳統(tǒng)防治方法，如培育和栽植無病毒苗木、控制高接傳毒等，在實(shí)際應(yīng)用中面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，培育無病毒苗木的過程復(fù)雜，成本高昂，且需要專業(yè)的技術(shù)和設(shè)備支持，這對(duì)于一些小規(guī)模的果農(nóng)來說難以實(shí)現(xiàn)。另一方面，即使在苗木培育階段能夠保證無病毒，但在后續(xù)的果園管理過程中，由于病毒的傳播途徑多樣，如通過嫁接、汁液機(jī)械傳播，甚至可能通過病健樹根系接觸傳播，使得果樹仍有很大的感染風(fēng)險(xiǎn)。而化學(xué)防治方法由于ASGV主要存在于植物細(xì)胞內(nèi)部，化學(xué)藥劑難以有效滲透，且大量使用化學(xué)藥劑會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，因此化學(xué)防治也并非理想的解決方案。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為一種新興的抗病毒策略，為解決蘋果莖溝病毒問題帶來了新的希望。RNAi是一種在真核生物中高度保守的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。在RNAi抗病毒過程中，病毒RNA復(fù)制所產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA）會(huì)被宿主細(xì)胞內(nèi)的Dicer蛋白識(shí)別并切割成小干擾RNA（siRNA）。這些siRNA隨后被轉(zhuǎn)移到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中，RISC中的siRNA能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合同源的病毒RNA，進(jìn)而介導(dǎo)其降解，從而達(dá)到阻止病毒進(jìn)一步復(fù)制和傳播，實(shí)現(xiàn)抗病毒的目的。這種基于核酸序列特異性的作用機(jī)制，使得RNAi技術(shù)能夠精確地靶向病毒基因，而對(duì)植物自身的其他基因影響較小，極大地提高了抗病毒的特異性和安全性。在植物抗病毒研究領(lǐng)域，RNAi技術(shù)已經(jīng)在多種植物病毒的防治研究中取得了顯著進(jìn)展。例如，在煙草花葉病毒（TMV）的研究中，通過將靶向TMV基因的RNAi載體轉(zhuǎn)化煙草，成功使煙草對(duì)TMV產(chǎn)生了抗性，有效降低了病毒的侵染率和病害的發(fā)生程度。在番茄黃化曲葉病毒（TYLCV）的防治中，利用RNAi技術(shù)也能夠顯著抑制病毒在番茄植株內(nèi)的復(fù)制，提高番茄的抗病能力，保證了番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。這些成功案例充分展示了RNAi技術(shù)在植物抗病毒領(lǐng)域的巨大潛力和應(yīng)用價(jià)值。將RNAi技術(shù)應(yīng)用于蘋果莖溝病毒的防治研究，有望為果樹病毒病的防控提供一種高效、環(huán)保且可持續(xù)的新途徑。1.2研究目的與意義本研究旨在構(gòu)建蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)化煙草，以探索利用RNA干擾技術(shù)防治蘋果莖溝病毒的可行性。蘋果莖溝病毒對(duì)果樹產(chǎn)業(yè)的危害嚴(yán)重，而現(xiàn)有的防治方法存在局限性。通過構(gòu)建針對(duì)ASGVcp基因的hpRNA表達(dá)載體，能夠利用RNAi技術(shù)的特異性和高效性，精準(zhǔn)地靶向病毒基因，抑制病毒的復(fù)制和傳播。將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草，煙草作為模式植物，生長周期短、易于轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)，且對(duì)多種病毒具有一定的敏感性，通過在煙草中驗(yàn)證載體的抗病毒效果，可以為后續(xù)在果樹上的應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。這不僅有助于深入了解RNAi技術(shù)在植物抗病毒中的作用機(jī)制，也為開發(fā)新型、高效、環(huán)保的果樹抗病毒策略奠定基礎(chǔ)。從更宏觀的角度來看，本研究對(duì)于保障果樹產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。果樹產(chǎn)業(yè)是農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的重要組成部分，蘋果、梨等受ASGV影響的果樹種植廣泛，果實(shí)不僅是人們?nèi)粘ＯM(fèi)的重要水果，還在食品加工、出口貿(mào)易等領(lǐng)域發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過有效防控ASGV，能夠提高果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)，增加果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入，促進(jìn)果樹種植產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。同時(shí)，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，有利于保護(hù)生態(tài)環(huán)境，維護(hù)生物多樣性，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與生態(tài)環(huán)境的和諧共生。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對(duì)蘋果莖溝病毒的研究開展較早，涵蓋了病毒的生物學(xué)特性、分子生物學(xué)、檢測(cè)技術(shù)以及防治方法等多個(gè)方面。在生物學(xué)特性研究上，明確了ASGV呈纖維狀，極彎曲，大小約為600-700納米×12納米，稀釋限點(diǎn)在10-4左右，失活溫度為60-63℃，體外存活期在20℃時(shí)為2天，4℃時(shí)27天以上，主要通過嫁接傳染，也可通過汁液機(jī)械傳播到草本寄主上，昆諾藜和大果海棠的種子可傳播該病毒，但未發(fā)現(xiàn)蟲媒。分子生物學(xué)領(lǐng)域，對(duì)ASGV的基因組結(jié)構(gòu)和功能有了深入了解。其基因組為單鏈正義RNA，編碼多個(gè)蛋白，其中外殼蛋白（CP）基因在病毒的侵染、傳播和致病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。通過對(duì)不同地區(qū)ASGV分離物的CP基因序列分析，揭示了病毒的遺傳多樣性和進(jìn)化關(guān)系，為病毒的溯源和監(jiān)測(cè)提供了依據(jù)。例如，研究發(fā)現(xiàn)不同地理來源的ASGV分離物在CP基因序列上存在一定差異，這些差異可能與病毒的適應(yīng)性和致病性變化相關(guān)。檢測(cè)技術(shù)方面，國外已經(jīng)建立了多種成熟的檢測(cè)方法。指示植物法是早期常用的檢測(cè)手段，通過將待檢測(cè)樣品接種到指示植物（如弗吉尼亞小蘋果）上，觀察其發(fā)病癥狀來判斷是否感染ASGV，但該方法檢測(cè)速度較慢，靈敏度較低。隨著技術(shù)的發(fā)展，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）、RT-PCR以及定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）等技術(shù)逐漸被廣泛應(yīng)用。ELISA法依賴抗體進(jìn)行檢測(cè)，靈敏性高，但由于果樹中糖酚含量較高，病毒含量偏低，容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。RT-PCR和RT-qPCR具有較高的靈敏度和特異性，能夠快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出ASGV，但需要配備昂貴的PCR儀和熒光定量PCR儀，且操作相對(duì)復(fù)雜，耗時(shí)較長。在防治方法研究上，國外主要側(cè)重于培育和栽植無病毒苗木，嚴(yán)格控制苗木和接穗的病毒檢測(cè)，防止病毒的傳播擴(kuò)散。同時(shí)，對(duì)果園的管理措施也進(jìn)行了深入研究，如合理修剪、施肥，增強(qiáng)樹勢(shì)，提高果樹的抗病能力。此外，一些新型的防治策略，如利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)抑制病毒的復(fù)制和傳播，也受到了廣泛關(guān)注，并取得了一定的研究進(jìn)展。國內(nèi)對(duì)蘋果莖溝病毒的研究起步相對(duì)較晚，但近年來發(fā)展迅速。在病毒的分布和危害調(diào)查方面，明確了ASGV在我國各蘋果主產(chǎn)區(qū)廣泛分布，如河北鹿泉、山東、河南、遼寧等地，對(duì)蘋果和梨等果樹的生長和產(chǎn)量造成了嚴(yán)重影響。通過對(duì)不同地區(qū)果園的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，ASGV常與蘋果褪綠葉斑病毒、蘋果莖痘病毒混合侵染，加重了病害的危害程度，可使病樹生長量減少20%-30%，產(chǎn)量下降10%-15%。在檢測(cè)技術(shù)研究上，國內(nèi)在借鑒國外先進(jìn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，也進(jìn)行了創(chuàng)新和改進(jìn)。例如，開發(fā)了基于RT-RPA-LFD技術(shù)的快速檢測(cè)方法，該方法以RNA為模板進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，擴(kuò)增30min后產(chǎn)物可通過側(cè)流層析試紙條直接檢測(cè)，整個(gè)檢測(cè)過程可在1h內(nèi)完成，無需昂貴的專業(yè)儀器，適用于田間樣品檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的效率和便捷性。同時(shí)，利用原位RT-PCR技術(shù)，確定了蘋果莖溝病毒在葉片中的分布位置，為進(jìn)一步了解病毒的侵染機(jī)制提供了依據(jù)。在防治方面，國內(nèi)主要采取培育無病毒苗木、控制高接傳毒等措施。研究表明，蘋果莖溝病毒是蘋果潛隱病毒中最難脫除的病毒，單獨(dú)熱處理脫毒，蘋果莖溝病毒的脫除率僅為33.9%，而結(jié)合熱處理和莖尖培養(yǎng)，脫除率可提高到83.3%。近年來，隨著RNAi技術(shù)在植物抗病毒研究中的興起，國內(nèi)也開展了相關(guān)研究，通過構(gòu)建針對(duì)ASGV的RNAi表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到煙草等模式植物中，驗(yàn)證了RNAi技術(shù)對(duì)ASGV的抑制效果，為果樹抗病毒基因工程提供了新的思路和方法。盡管國內(nèi)外在蘋果莖溝病毒的研究上取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處?，F(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測(cè)速度上難以達(dá)到完美平衡，需要進(jìn)一步開發(fā)更加高效、準(zhǔn)確、便捷的檢測(cè)方法。在防治方面，雖然RNAi技術(shù)展現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景，但目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，將其成功應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)還面臨諸多挑戰(zhàn)，如如何提高RNAi載體的轉(zhuǎn)化效率、穩(wěn)定性和安全性，以及如何解決可能出現(xiàn)的基因沉默逃逸等問題。此外，對(duì)于ASGV與寄主植物之間的互作機(jī)制，尤其是在分子水平上的研究還不夠深入，這限制了我們對(duì)病毒致病機(jī)理的理解和防治策略的進(jìn)一步優(yōu)化。二、蘋果莖溝病毒cp基因及hpRNA表達(dá)載體概述2.1蘋果莖溝病毒簡介2.1.1病毒特性蘋果莖溝病毒（AppleStemGroovingVirus，ASGV）在分類學(xué)上屬于發(fā)形病毒屬（Capillovirus）的代表種，目前尚未劃分到特定的科。其病毒粒體呈纖維狀，形態(tài)上極彎曲，大小約為600-700納米×12納米，無包膜結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)使其在電子顯微鏡下具有明顯的特征，易于與其他病毒區(qū)分。從生理生化特性來看，ASGV具有一定的穩(wěn)定性。其稀釋限點(diǎn)在10-4左右，意味著在一定的稀釋范圍內(nèi)，病毒仍能保持侵染活性。失活溫度為60-63℃，當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到這一范圍時(shí)，病毒的活性會(huì)受到顯著影響，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變性，從而失去侵染能力。在體外存活期方面，20℃時(shí)為2天，而在4℃時(shí)則可存活27天以上，低溫環(huán)境有利于維持病毒的穩(wěn)定性，減緩其活性喪失的速度。ASGV的基因組為單鏈正義RNA，長度約為6496nt。該基因組含有2個(gè)開放閱讀框（ORF），其中ORF1編碼產(chǎn)生一個(gè)241kDn的多聚蛋白，隨后這個(gè)多聚蛋白會(huì)被切割成一些具有特定功能的產(chǎn)物，外殼蛋白（CP）位于C端。ORF2則編碼產(chǎn)生一個(gè)36kDn的移動(dòng)蛋白（MP），移動(dòng)蛋白在病毒的細(xì)胞間傳播過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠幫助病毒突破細(xì)胞間的屏障，實(shí)現(xiàn)病毒在植物體內(nèi)的擴(kuò)散。這種基因組結(jié)構(gòu)和編碼方式?jīng)Q定了ASGV的遺傳信息傳遞和病毒粒子的組裝過程，對(duì)病毒的生存和繁殖至關(guān)重要。2.1.2危害及分布ASGV具有廣泛的寄主范圍，能危害蘋果（Malus）、梨（Pyrus）、李（Prunus）、柑橘（Citrus）、獼猴桃（Actinidia）等多種重要的果樹作物。在自然條件下，病毒主要通過嫁接進(jìn)行傳播，這是因?yàn)榧藿舆^程中，病毒可以隨著接穗和砧木的結(jié)合，進(jìn)入新的植株體內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)傳播。此外，汁液機(jī)械傳播也是其傳播途徑之一，在果樹修剪、農(nóng)事操作等過程中，病毒可能通過工具或操作人員的手，從患病植株傳播到健康植株。在果園中，病健樹根系接觸也可能導(dǎo)致病毒傳播，這是因?yàn)楦翟谕寥乐猩L時(shí)，可能會(huì)相互接觸，病毒可以通過根系的接觸點(diǎn)進(jìn)入健康植株的根系，進(jìn)而侵染整株植物。昆諾藜和大果海棠的種子也可傳播該病毒，這為病毒的傳播提供了更多的可能性。被ASGV侵染的果樹，在田間表現(xiàn)出明顯的生長異常。病株通常較健株矮小衰弱，這是因?yàn)椴《镜那秩居绊懥斯麡涞恼Ｉ泶x，導(dǎo)致生長激素的合成和運(yùn)輸受阻，從而抑制了植株的生長。葉片顏色變淡，這是由于病毒干擾了葉片中葉綠素的合成或破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)，使得葉片的光合作用能力下降。有的嫁接口周圍腫大，形成一個(gè)小腳，結(jié)合部內(nèi)有深褐色壞死環(huán)紋，這是病毒在嫁接口處大量繁殖，引發(fā)了寄主植物的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致組織壞死。木質(zhì)部表面產(chǎn)生深褐色凹陷裂溝，嚴(yán)重時(shí)從外部即可辨認(rèn)，這些裂溝會(huì)影響水分和養(yǎng)分在木質(zhì)部中的運(yùn)輸，進(jìn)一步削弱樹勢(shì)。在溫室內(nèi)，病株葉片上產(chǎn)生黃斑或黃色環(huán)紋，黃斑常分布在葉片一側(cè)的邊緣，在病斑的一側(cè)葉片變小，形成舟形葉，病葉多在黃斑處皺縮，這是因?yàn)椴《驹谌~片細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，破壞了細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致葉片形態(tài)發(fā)生改變。木質(zhì)部表面產(chǎn)生褐色凹陷條溝，同樣會(huì)影響水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸。ASGV在全球范圍內(nèi)呈世界性分布，在我國各蘋果主產(chǎn)區(qū)如河北鹿泉、山東、河南、遼寧等地均有發(fā)現(xiàn)。在國際上，各個(gè)蘋果栽培區(qū)也都受到該病毒的威脅。其廣泛的分布范圍和對(duì)多種果樹的侵染性，給全球的果樹產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于病毒的傳播途徑多樣，且在自然條件下多呈潛伏侵染，難以早期察覺和有效防控，使得其危害范圍不斷擴(kuò)大。2.1.3cp基因的功能與特點(diǎn)cp基因，即外殼蛋白基因，在蘋果莖溝病毒的生命活動(dòng)中扮演著至關(guān)重要的角色。它所編碼的外殼蛋白是構(gòu)成病毒粒子的重要組成部分，外殼蛋白環(huán)繞在病毒核酸周圍，形成了病毒的外殼結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅對(duì)病毒的核酸起到了保護(hù)作用，使其免受外界環(huán)境中各種物理、化學(xué)因素的破壞，如紫外線的照射、核酸酶的降解等，從而保證了病毒遺傳信息的穩(wěn)定性。同時(shí)，外殼蛋白在病毒的侵染過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它能夠識(shí)別寄主植物細(xì)胞表面的特定受體，介導(dǎo)病毒粒子與寄主細(xì)胞的吸附和融合，進(jìn)而幫助病毒順利進(jìn)入寄主細(xì)胞內(nèi)，啟動(dòng)病毒的復(fù)制和侵染過程。從序列特點(diǎn)來看，ASGV的cp基因具有一定的保守性。不同地區(qū)的ASGV分離物的cp基因序列雖然存在一定的差異，但在一些關(guān)鍵區(qū)域，如編碼與受體結(jié)合位點(diǎn)的序列、維持外殼蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的序列等，具有高度的保守性。這種保守性使得我們可以針對(duì)這些保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，用于病毒的檢測(cè)和診斷。通過對(duì)大量ASGV分離物的cp基因序列分析發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列的相似性在80%-90%之間，氨基酸序列的相似性則更高，這表明cp基因在進(jìn)化過程中受到了較強(qiáng)的選擇壓力，以保持其基本的生物學(xué)功能。在結(jié)構(gòu)上，cp基因編碼的外殼蛋白通常具有特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含α-螺旋、β-折疊等常見的結(jié)構(gòu)元件，這些結(jié)構(gòu)元件通過氫鍵、范德華力等相互作用，維持著外殼蛋白的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。三級(jí)結(jié)構(gòu)則是在二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過氨基酸殘基之間的相互作用進(jìn)一步折疊形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)決定了外殼蛋白的功能活性。例如，外殼蛋白表面的一些特定結(jié)構(gòu)域，如與核酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)域、與寄主細(xì)胞受體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域等，都是在三級(jí)結(jié)構(gòu)中形成的。這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使得cp基因及其編碼的外殼蛋白在病毒的生存、傳播和致病過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，也為我們研究病毒的致病機(jī)制和開發(fā)抗病毒策略提供了重要的靶點(diǎn)。2.2hpRNA表達(dá)載體原理與優(yōu)勢(shì)2.2.1hpRNA誘導(dǎo)RNA沉默機(jī)制hpRNA，即發(fā)夾狀RNA，其誘導(dǎo)RNA沉默的過程涉及多個(gè)復(fù)雜的分子生物學(xué)步驟。當(dāng)hpRNA表達(dá)載體被導(dǎo)入植物細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄體系作用下，載體中的hpRNA編碼序列轉(zhuǎn)錄生成hpRNA分子。hpRNA具有獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其一條單鏈RNA分子通過自身互補(bǔ)配對(duì)，形成了類似于發(fā)夾的結(jié)構(gòu)，其中包含一個(gè)雙鏈RNA（dsRNA）區(qū)域和一個(gè)單鏈RNA環(huán)。這種具有雙鏈結(jié)構(gòu)的hpRNA會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的Dicer酶識(shí)別。Dicer酶屬于RNaseⅢ家族，它能夠特異性地切割dsRNA。在切割過程中，Dicer酶以其特定的結(jié)構(gòu)域與hpRNA的dsRNA區(qū)域結(jié)合，然后按照一定的規(guī)則將dsRNA切割成多個(gè)小片段，這些小片段即為小干擾RNA（siRNA），其長度通常在21-24個(gè)核苷酸左右。每個(gè)siRNA都由正義鏈和反義鏈組成，兩條鏈通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈結(jié)構(gòu)，且在3'端通常會(huì)有2-3個(gè)核苷酸的突出。生成的siRNA隨后會(huì)被整合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）中。RISC是一種由多種蛋白質(zhì)和核酸組成的復(fù)合物，其中包含一種名為Argonaute（AGO）的蛋白質(zhì)，它在RISC中發(fā)揮著核心作用。AGO蛋白能夠與siRNA的反義鏈緊密結(jié)合，而將正義鏈從siRNA雙鏈結(jié)構(gòu)中解離出來。此時(shí)，RISC被激活，成為具有活性的復(fù)合物。激活后的RISC在細(xì)胞內(nèi)的RNA環(huán)境中發(fā)揮作用。由于siRNA的反義鏈與靶標(biāo)RNA（在本研究中即為蘋果莖溝病毒的cp基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物）具有互補(bǔ)的核苷酸序列，RISC中的siRNA反義鏈能夠憑借堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，特異性地識(shí)別并結(jié)合到靶標(biāo)RNA上。一旦結(jié)合，RISC中的AGO蛋白會(huì)發(fā)揮核酸酶的活性，對(duì)靶標(biāo)RNA進(jìn)行切割，使其降解成小片段。這些小片段無法再作為模板進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯，從而阻斷了病毒基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)病毒的抗性。在這個(gè)過程中，RNA沉默還具有信號(hào)放大的特點(diǎn)。被切割后的靶標(biāo)RNA片段可以作為模板，在細(xì)胞內(nèi)的RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）作用下，合成更多的dsRNA。這些新合成的dsRNA又可以被Dicer酶切割成siRNA，進(jìn)一步擴(kuò)大了RNA沉默信號(hào)，增強(qiáng)了對(duì)病毒的抑制效果。這種信號(hào)放大機(jī)制使得即使初始導(dǎo)入的hpRNA量較少，也能產(chǎn)生顯著的抗病毒效果。2.2.2hpRNA表達(dá)載體在抗病毒中的優(yōu)勢(shì)與其他類型的表達(dá)載體相比，hpRNA表達(dá)載體在植物抗病毒研究中具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。從沉默效率方面來看，hpRNA表達(dá)載體能夠高效地誘導(dǎo)RNA沉默。其獨(dú)特的發(fā)夾結(jié)構(gòu)使得轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的hpRNA能夠直接形成dsRNA區(qū)域，無需像其他載體那樣經(jīng)歷復(fù)雜的過程來產(chǎn)生dsRNA。這種直接生成dsRNA的方式大大提高了RNA沉默的起始效率。例如，在一些研究中，將hpRNA表達(dá)載體和普通的反義RNA表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化植物，檢測(cè)對(duì)病毒的抗性效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化hpRNA表達(dá)載體的植物中，病毒的積累量明顯低于轉(zhuǎn)化反義RNA表達(dá)載體的植物，病毒相關(guān)基因的表達(dá)水平也受到了更顯著的抑制，這表明hpRNA表達(dá)載體能夠更有效地誘導(dǎo)RNA沉默，從而增強(qiáng)植物的抗病毒能力。在穩(wěn)定性方面，hpRNA表達(dá)載體具有更好的穩(wěn)定性。由于hpRNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，不易被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶降解，能夠在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在并發(fā)揮作用。而一些其他載體轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈RNA，如反義RNA，更容易受到核酸酶的攻擊而降解，導(dǎo)致其在細(xì)胞內(nèi)的半衰期較短，難以持續(xù)有效地發(fā)揮抗病毒作用。例如，通過對(duì)轉(zhuǎn)化不同載體的植物細(xì)胞進(jìn)行追蹤檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)hpRNA在細(xì)胞內(nèi)能夠穩(wěn)定存在數(shù)天，而反義RNA在較短時(shí)間內(nèi)就會(huì)被大量降解，無法維持有效的抗病毒濃度。這種穩(wěn)定性使得hpRNA表達(dá)載體能夠?yàn)橹参锾峁┏志玫目共《颈Ｗo(hù)，減少了因載體不穩(wěn)定而導(dǎo)致的抗病毒效果波動(dòng)。特異性是抗病毒研究中非常重要的一個(gè)因素，hpRNA表達(dá)載體在這方面也表現(xiàn)出色。hpRNA誘導(dǎo)的RNA沉默具有高度的序列特異性，它能夠精確地識(shí)別并靶向與hpRNA序列互補(bǔ)的病毒基因，而對(duì)植物自身的其他基因影響極小。這是因?yàn)镽NA沉默的機(jī)制依賴于核酸序列的互補(bǔ)配對(duì)，只有當(dāng)siRNA與靶標(biāo)RNA的序列高度匹配時(shí)，才能引發(fā)有效的RNA沉默。相比之下，一些化學(xué)藥劑在防治病毒時(shí)，可能會(huì)對(duì)植物的正常生理代謝產(chǎn)生負(fù)面影響，導(dǎo)致植物生長發(fā)育受阻、品質(zhì)下降等問題。例如，某些廣譜性的抗病毒化學(xué)藥劑在抑制病毒的同時(shí)，也會(huì)干擾植物體內(nèi)的激素平衡、光合作用等重要生理過程。而hpRNA表達(dá)載體則能夠避免這些問題，在有效抑制病毒的同時(shí)，保證植物自身基因的正常表達(dá)和生理功能的正常運(yùn)行，維持植物的健康生長。三、蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料本研究中，選用大腸桿菌DH5α菌株作為基因克隆和擴(kuò)增的宿主菌。該菌株具有生長迅速、易于轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)的特點(diǎn)，在基因工程實(shí)驗(yàn)中被廣泛應(yīng)用，能夠高效地進(jìn)行質(zhì)粒的復(fù)制和擴(kuò)增，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的質(zhì)粒材料。植物表達(dá)載體選用pBI121，它是一種常用的二元載體，含有CaMV35S啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子具有強(qiáng)啟動(dòng)活性，能夠驅(qū)動(dòng)外源基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)。同時(shí)，pBI121載體上還帶有卡那霉素抗性基因，這使得在轉(zhuǎn)化過程中可以利用卡那霉素對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，只有成功導(dǎo)入了含有卡那霉素抗性基因載體的細(xì)胞才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，從而方便地篩選出陽性克隆。在工具酶方面，使用了限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI。這兩種酶具有特定的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，BamHI識(shí)別并切割GGATCC序列，SacI識(shí)別并切割GAGCTC序列。通過這兩種酶的雙酶切作用，可以在載體和目的基因片段上產(chǎn)生互補(bǔ)的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)。同時(shí)，還使用了T4DNA連接酶，它能夠催化雙鏈DNA片段之間的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)載體和目的基因的連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。實(shí)驗(yàn)中用到的試劑包括DNAMarker，它是一種已知分子量大小的DNA片段混合物，在瓊脂糖凝膠電泳中可以作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，用于判斷目的基因片段和載體的大小。DNA凝膠回收試劑盒用于從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，其原理是利用硅膠膜對(duì)DNA的特異性吸附，通過一系列的洗滌和洗脫步驟，獲得高純度的DNA片段。質(zhì)粒提取試劑盒則用于從大腸桿菌中提取質(zhì)粒，采用堿裂解法結(jié)合硅膠柱純化技術(shù)，能夠快速、高效地提取高質(zhì)量的質(zhì)粒。PCR擴(kuò)增試劑包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、PCR緩沖液等，TaqDNA聚合酶具有耐高溫的特性，能夠在PCR反應(yīng)的高溫條件下催化DNA的合成，dNTPs為DNA合成提供原料，PCR緩沖液則為反應(yīng)提供適宜的離子強(qiáng)度和pH環(huán)境。儀器設(shè)備方面，PCR儀是進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的關(guān)鍵設(shè)備，它能夠精確地控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。離心機(jī)用于分離和沉淀細(xì)胞、核酸等物質(zhì)，高速離心機(jī)能夠提供高轉(zhuǎn)速，實(shí)現(xiàn)快速分離。電泳儀和電泳槽用于進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，通過電場(chǎng)作用使DNA片段在凝膠中遷移，根據(jù)片段大小的不同實(shí)現(xiàn)分離。凝膠成像系統(tǒng)則用于觀察和記錄電泳結(jié)果，它能夠?qū)δz進(jìn)行拍照，并通過圖像分析軟件對(duì)DNA條帶的大小、亮度等進(jìn)行分析。恒溫培養(yǎng)箱用于培養(yǎng)大腸桿菌和煙草植株，提供適宜的溫度和濕度環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞的生長和繁殖。3.1.2實(shí)驗(yàn)方法根據(jù)GenBank中已登錄的蘋果莖溝病毒cp基因序列，運(yùn)用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。為了便于后續(xù)的酶切和連接操作，在引物的5'端分別引入BamHI和SacI酶切位點(diǎn)，并添加適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)堿基。保護(hù)堿基的作用是增強(qiáng)酶切位點(diǎn)的穩(wěn)定性，提高酶切效率。正向引物序列為5'-CGGGATCCATGGCTAAAGAGAAG-3'，其中CGG為保護(hù)堿基，GGATCC為BamHI酶切位點(diǎn)，ATGGCTAAAGAGAAG為與cp基因起始部分互補(bǔ)的序列。反向引物序列為5'-CCGAGCTCTTAGATGACGACGAC-3'，CCG為保護(hù)堿基，GAGCTC為SacI酶切位點(diǎn)，TTAGATGACGACGAC為與cp基因終止部分互補(bǔ)的序列。以本實(shí)驗(yàn)室保存的含有蘋果莖溝病毒cp基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系總體積為50μL，其中包括10×PCR緩沖液5μL，提供適宜的緩沖環(huán)境；dNTPs（2.5mMeach）4μL，為DNA合成提供原料；正向引物（10μM）1μL和反向引物（10μM）1μL，引導(dǎo)DNA的擴(kuò)增方向；TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.5μL，催化DNA的合成；模板DNA1μL，作為擴(kuò)增的起始模板；最后用ddH?O補(bǔ)足至50μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5min，使模板DNA完全解鏈；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，使DNA雙鏈解開；55℃退火30s，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸1min，TaqDNA聚合酶在引物的引導(dǎo)下合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10min，確保所有的DNA片段都充分延伸。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠加樣孔中，在1×TAE緩沖液中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中觀察，在紫外光的照射下，DNA會(huì)發(fā)出熒光，根據(jù)DNAMarker的條帶位置判斷PCR產(chǎn)物的大小。如果擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期的cp基因片段大小一致，說明PCR擴(kuò)增成功。用限制性內(nèi)切酶BamHI和SacI對(duì)PCR擴(kuò)增得到的cp基因片段和表達(dá)載體pBI121進(jìn)行雙酶切。酶切體系為50μL，其中包括質(zhì)?；駾NA片段3μg，10×CutSmartBuffer5μL，提供適宜的酶切環(huán)境；BamHI（10U/μL）1μL和SacI（10U/μL）1μL，進(jìn)行酶切反應(yīng)；最后用ddH?O補(bǔ)足至50μL。將酶切體系置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育3-4h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，同樣進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將酶切產(chǎn)物與DNAMarker一起進(jìn)行電泳，觀察條帶的變化，判斷酶切是否完全。如果酶切后的條帶大小符合預(yù)期，說明酶切成功。使用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的cp基因片段和pBI121載體片段進(jìn)行回收。按照試劑盒說明書的步驟進(jìn)行操作，首先將酶切后的凝膠切成小塊，放入離心管中，加入適量的溶膠液，在一定溫度下孵育，使凝膠完全溶解。然后將溶解后的溶液轉(zhuǎn)移到吸附柱中，離心使DNA吸附在硅膠膜上，經(jīng)過多次洗滌去除雜質(zhì)后，用適量的洗脫緩沖液將DNA從硅膠膜上洗脫下來，得到純化的cp基因片段和pBI121載體片段。將回收后的cp基因片段和pBI121載體片段按照摩爾比3:1的比例加入到連接反應(yīng)體系中。連接反應(yīng)體系總體積為10μL，其中包括T4DNA連接酶緩沖液1μL，提供適宜的連接環(huán)境；T4DNA連接酶（3U/μL）1μL，催化DNA片段的連接；cp基因片段和pBI121載體片段適量，根據(jù)摩爾比計(jì)算得出；最后用ddH?O補(bǔ)足至10μL。將連接反應(yīng)體系置于16℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜連接，使cp基因片段與pBI121載體片段充分連接，形成重組表達(dá)載體。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。首先從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細(xì)胞，置于冰上使其緩慢解凍。然后取10μL連接產(chǎn)物加入到100μL感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使連接產(chǎn)物充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞。接著將離心管放入42℃水浴中熱激90s，促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)連接產(chǎn)物的吸收，隨后迅速置于冰上冷卻2min。最后向離心管中加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，置于37℃恒溫?fù)u床中，以180rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)胞恢復(fù)生長。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒將菌液均勻分散在平板表面，然后將平板倒置，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。由于pBI121載體上帶有卡那霉素抗性基因，只有成功導(dǎo)入了重組表達(dá)載體的大腸桿菌才能在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上生長，形成菌落。次日，從平板上挑取單菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)過夜。提取培養(yǎng)后的大腸桿菌中的質(zhì)粒，使用質(zhì)粒提取試劑盒按照說明書的步驟進(jìn)行操作。提取得到的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定使用BamHI和SacI對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切體系和條件與之前相同，酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。PCR鑒定則以提取的質(zhì)粒為模板，使用之前設(shè)計(jì)的cp基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系和條件與之前相同，擴(kuò)增產(chǎn)物同樣進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。如果雙酶切鑒定和PCR鑒定結(jié)果都符合預(yù)期，說明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。三、蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建3.2載體構(gòu)建過程與結(jié)果分析3.2.1cp基因片段的擴(kuò)增與克隆以本實(shí)驗(yàn)室保存的含有蘋果莖溝病毒cp基因的質(zhì)粒為模板，使用設(shè)計(jì)好的帶有BamHI和SacI酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)過35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，可見在約[具體預(yù)期大小]bp的位置出現(xiàn)了一條清晰的條帶，與預(yù)期的cp基因片段大小一致（圖1）。這表明PCR擴(kuò)增成功，成功獲得了目的cp基因片段。將擴(kuò)增得到的cp基因片段使用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收?；厥蘸蟮钠闻cpMD18-T載體按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，平板上長出了多個(gè)白色菌落，這些菌落即為可能含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取多個(gè)白色菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取培養(yǎng)后的大腸桿菌中的質(zhì)粒，使用BamHI和SacI進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，部分質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的兩條條帶，一條為載體片段，大小約為[載體片段大小]bp，另一條為cp基因片段，大小約為[cp基因片段大小]bp（圖2）。這表明cp基因片段已成功克隆到pMD18-T載體中，獲得了含有cp基因的重組克隆質(zhì)粒。3.2.2正向和反向插入重組質(zhì)粒的構(gòu)建將含有cp基因的重組克隆質(zhì)粒和表達(dá)載體pBI121分別用BamHI和SacI進(jìn)行雙酶切。酶切后的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)酶切完全后，使用DNA凝膠回收試劑盒分別回收cp基因片段和pBI121載體片段。將回收后的cp基因片段和pBI121載體片段按照摩爾比3:1的比例加入到連接反應(yīng)體系中，加入T4DNA連接酶，16℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜連接，形成重組表達(dá)載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，平板上長出了多個(gè)菌落。隨機(jī)挑取多個(gè)菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取培養(yǎng)后的大腸桿菌中的質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定。雙酶切鑒定結(jié)果顯示，部分質(zhì)粒酶切后出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶，表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。為了確定cp基因在重組質(zhì)粒中的插入方向，對(duì)部分重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果表明，成功獲得了cp基因正向插入的重組質(zhì)粒pBI121-cp(+)和反向插入的重組質(zhì)粒pBI121-cp(-)。這為后續(xù)構(gòu)建hpRNA表達(dá)載體提供了重要的中間材料。3.2.3hpRNA表達(dá)載體的最終構(gòu)建與鑒定將正向插入重組質(zhì)粒pBI121-cp(+)用限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，回收含有cp基因正向插入片段和部分載體序列的大片段。同時(shí)，將反向插入重組質(zhì)粒pBI121-cp(-)用同樣的限制性內(nèi)切酶SpeI和XbaI進(jìn)行雙酶切，回收含有cp基因反向插入片段的小片段。將回收的正向插入片段和反向插入片段按照一定比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，使正向和反向插入片段在載體上通過一段間隔序列（內(nèi)含子）連接起來，形成可表達(dá)hpRNA的重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后的菌液涂布在含有卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取多個(gè)菌落，接種到含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。提取培養(yǎng)后的大腸桿菌中的質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定。酶切鑒定使用SpeI和XbaI對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的條帶，一條為載體片段，另一條為含有正向和反向插入cp基因片段及內(nèi)含子的片段（圖3）。測(cè)序結(jié)果表明，成功構(gòu)建了蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體pBI121-cp-hpRNA，其序列與預(yù)期設(shè)計(jì)一致，各元件的連接正確無誤，為后續(xù)轉(zhuǎn)化煙草及抗病毒研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。四、蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草4.1轉(zhuǎn)化方法與過程4.1.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法原理農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是一種在植物基因工程領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)化技術(shù)，其原理基于農(nóng)桿菌獨(dú)特的生物學(xué)特性。農(nóng)桿菌是一類普遍存在于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，主要包括根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞中含有Ti（Tumourinducing）質(zhì)粒，發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中含有Ri質(zhì)粒，這些質(zhì)粒上存在一段特殊的T-DNA（TransferringDNA）區(qū)域。在自然條件下，當(dāng)植物受到損傷時(shí)，傷口處的細(xì)胞會(huì)分泌大量酚類化合物，如乙酰丁香酮等。農(nóng)桿菌能夠感知這些酚類信號(hào)，并趨化性地移動(dòng)到受傷部位的細(xì)胞附近。農(nóng)桿菌表面的一些蛋白，如ChvA、ChvB和VirA等，參與了對(duì)植物信號(hào)的識(shí)別和響應(yīng)過程。其中，VirA蛋白是一種跨膜受體蛋白，它能夠感知植物分泌的酚類化合物，并自身發(fā)生磷酸化。磷酸化的VirA蛋白進(jìn)而將磷酸基團(tuán)傳遞給VirG蛋白，激活VirG蛋白。激活后的VirG蛋白作為轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上Vir基因區(qū)的表達(dá)。Vir基因區(qū)編碼多種蛋白，這些蛋白協(xié)同作用，參與T-DNA的加工、轉(zhuǎn)移和整合過程。首先，VirD1和VirD2蛋白形成復(fù)合體，識(shí)別并切割Ti質(zhì)粒上的T-DNA邊界序列，將T-DNA從質(zhì)粒上切割下來，形成單鏈的T-鏈。T-鏈與VirD2蛋白緊密結(jié)合，形成T-DNA復(fù)合體。同時(shí)，VirE2蛋白也被大量表達(dá)，它能夠結(jié)合到T-鏈上，對(duì)T-鏈起到保護(hù)作用，并協(xié)助T-DNA復(fù)合體進(jìn)入植物細(xì)胞。在VirB等蛋白組成的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的作用下，T-DNA復(fù)合體通過農(nóng)桿菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，被轉(zhuǎn)運(yùn)到植物細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入植物細(xì)胞的T-DNA復(fù)合體通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核，在植物細(xì)胞內(nèi)的一些酶和蛋白質(zhì)的作用下，T-DNA被整合到植物基因組中。這一整合過程可能涉及到植物細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制，T-DNA通過與植物基因組的同源重組或非同源末端連接等方式，穩(wěn)定地整合到植物染色體上。整合后的T-DNA能夠隨著植物細(xì)胞的分裂而傳遞給子代細(xì)胞，并且其中攜帶的外源基因能夠在植物細(xì)胞中表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合。農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法起初主要應(yīng)用于雙子葉植物，這是因?yàn)殡p子葉植物受傷后分泌的酚類化合物能夠更有效地誘導(dǎo)農(nóng)桿菌的侵染和T-DNA轉(zhuǎn)移。然而，近年來隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和對(duì)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化機(jī)制的深入理解，該方法在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)化條件，如調(diào)整農(nóng)桿菌菌株、共培養(yǎng)條件、添加合適的誘導(dǎo)劑等，成功實(shí)現(xiàn)了外源基因在單子葉植物中的高效轉(zhuǎn)化。例如，在水稻轉(zhuǎn)化中，通過選擇合適的農(nóng)桿菌菌株和共培養(yǎng)培養(yǎng)基，添加適量的乙酰丁香酮等誘導(dǎo)劑，能夠顯著提高轉(zhuǎn)化效率。這種轉(zhuǎn)化方法具有諸多優(yōu)點(diǎn)，如轉(zhuǎn)化頻率高，能夠高效地將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞；可以導(dǎo)入包含多個(gè)基因的大片段DNA；導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)通常較低，有助于穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，且大多數(shù)情況下符合孟德爾遺傳規(guī)律，便于遺傳分析和育種應(yīng)用；操作相對(duì)簡單，所需儀器設(shè)備不復(fù)雜，易于推廣應(yīng)用。4.1.2轉(zhuǎn)化煙草的具體步驟從-80℃冰箱中取出保存的農(nóng)桿菌菌株（如EHA105或LBA4404），在含有相應(yīng)抗生素（如利福平、鏈霉素等，根據(jù)農(nóng)桿菌菌株特性選擇）的YM固體培養(yǎng)基平板上劃線，將農(nóng)桿菌均勻地劃在平板表面，形成單菌落。將平板置于26-28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使農(nóng)桿菌在平板上生長繁殖，形成清晰的單菌落。挑取平板上生長良好的單菌落，接種到40ml無抗生素的YM液體培養(yǎng)基中。將接種后的液體培養(yǎng)基置于250r/min的恒溫?fù)u床中，在26-28℃條件下懸浮培養(yǎng)12-16h，使農(nóng)桿菌在液體培養(yǎng)基中大量繁殖，達(dá)到對(duì)數(shù)生長期。將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)入滅過菌的50ml離心管中，在4℃條件下，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，使農(nóng)桿菌細(xì)胞沉淀下來。棄去上清液，收集沉淀的農(nóng)桿菌細(xì)胞。加入100mMNaCl（4℃預(yù)冷）溶液，輕輕重懸收集的農(nóng)桿菌細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散在溶液中。再次在4℃條件下，以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，棄去上清液。加入原始菌液1/50體積（例如，若原始菌液為40ml，則加入800μl）的20mMCaCl?溶液重懸菌體，使農(nóng)桿菌細(xì)胞均勻懸浮在CaCl?溶液中。將懸浮液分裝成100μl/管，置于液氮中速凍10s，然后放入-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?，此時(shí)的農(nóng)桿菌即為感受態(tài)細(xì)胞，具有能夠吸收外源DNA的能力。將制備好的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞從-20℃冰箱中取出，置于冰上緩慢解凍。待感受態(tài)細(xì)胞完全解凍后，加入1μg構(gòu)建好的蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體質(zhì)粒DNA（體積不宜超過10μl），用移液器輕輕吹打混勻，使質(zhì)粒DNA與感受態(tài)細(xì)胞充分接觸。將混合液冰上放置30min，使質(zhì)粒DNA吸附到感受態(tài)細(xì)胞表面。將離心管置于液氮中快速冷卻約1min，使細(xì)胞迅速冷凍，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生改變，有利于質(zhì)粒DNA進(jìn)入細(xì)胞。然后迅速將離心管轉(zhuǎn)入37℃水浴中，待其融化，這個(gè)過程稱為熱激處理，能夠促進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞對(duì)質(zhì)粒DNA的吸收。熱激處理后，迅速將離心管置于冰上冷卻2min，使細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)。向離心管中加入1ml無抗生素的YM液體培養(yǎng)基，將離心管置于28℃恒溫?fù)u床中，以230r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)2-4h，使轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌細(xì)胞恢復(fù)生長，并且使質(zhì)粒上攜帶的抗生素抗性基因得到表達(dá)。培養(yǎng)結(jié)束后，3000r/min離心2min收集菌體，吸去500μl上清液，留500μl菌液于管中，重懸菌體。將重懸后的菌液均勻涂布到含有適當(dāng)抗生素（如卡那霉素，根據(jù)表達(dá)載體上的抗性基因選擇）的YM固體培養(yǎng)基平板上，用無菌涂布棒將菌液均勻分散在平板表面。將平板吹干，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，使轉(zhuǎn)化成功的農(nóng)桿菌在平板上生長形成單菌落。挑取平板上長出的單菌落，接種到篩選液體YM培養(yǎng)基中，在28℃條件下，以250r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)48h，使農(nóng)桿菌大量繁殖。將培養(yǎng)好的菌液用于后續(xù)的煙草轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)或保存?zhèn)溆?。選取健康、飽滿的煙草種子，用70%乙醇消毒30s，以去除種子表面的微生物。消毒后，用無菌水清洗兩次，去除殘留的乙醇。然后用NaClO溶液處理25-30min，進(jìn)一步消毒種子。處理結(jié)束后，用無菌水清洗四次，徹底去除NaClO溶液。將滅菌后的種子移至1/2MS固體培養(yǎng)基（含有大量元素、微量元素、CaCl?、FeSO?、1.0mg/L維生素、2.0mg/L苷氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%瓊脂，用KOH調(diào)至pH5.7-5.8）上，將培養(yǎng)皿置于25-26℃光照培養(yǎng)箱中，在14h光照/10h黑暗條件下培養(yǎng)，使種子萌發(fā)。14天后，將萌發(fā)出的煙草幼苗轉(zhuǎn)移至含有相同1/2MS培養(yǎng)基的組織培養(yǎng)盒中，在同樣的光照和溫度條件下繼續(xù)培養(yǎng)4-6周，待小苗長出后，即可用于葉盤轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。于無菌條件下，將無菌苗的成熟葉片除去葉邊緣和主要葉脈，用無菌手術(shù)刀切成0.5cm2左右的小方塊。將切好的葉片方塊浸泡在MS液體培養(yǎng)基懸浮的用于轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液中，輕輕搖晃，使葉片充分接觸農(nóng)桿菌，浸泡10min。10min后，取出葉片，用滅菌的濾紙吸去葉片表面多余的菌液。將吸去菌液的葉片以葉片上表面接觸培養(yǎng)基的方式，8-9片/培養(yǎng)皿，排列于倒有共培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基，含有大量元素、微量元素、CaCl?、FeSO?、1.0mg/L維生素、2.0mg/L甘氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%瓊脂、pH5.7-5.8，添加適量的乙酰丁香酮以促進(jìn)農(nóng)桿菌的侵染）的平皿中。將平皿置于24℃光照培養(yǎng)箱中，在14h光照/10h黑暗條件下共培養(yǎng)48h，使農(nóng)桿菌將攜帶的蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到煙草細(xì)胞中。當(dāng)看到葉片與培養(yǎng)基接觸邊緣長出白色農(nóng)桿菌時(shí)，將葉片轉(zhuǎn)移至不加激素的MS液體培養(yǎng)基中，在28℃恒溫?fù)u床上振蕩漂洗45-60min，以去除葉片表面殘留的農(nóng)桿菌。漂洗結(jié)束后，夾出葉片放于滅菌的濾紙上除去多余的液體培養(yǎng)基。將漂洗后的葉片上表面朝向培養(yǎng)基，8片/皿排列于生芽篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基，含有大量元素、微量元素、CaCl?、FeSO?、500mg/LCarbincine、300mg/LKanamicine、0.1mg/LNAA、1.0mg/LBAP、0.59g/LMES、1.0mg/L維生素、2.0mg/L甘氨酸、3%蔗糖、0.6-0.7%瓊脂、pH5.7-5.8）上。將培養(yǎng)皿置于24℃光照培養(yǎng)箱中，在14h光照/10h黑暗條件下培養(yǎng)1個(gè)月，篩選出含有目的基因的煙草細(xì)胞，使其分化形成愈傷組織并長出綠芽。待愈傷組織長出綠芽時(shí)，用無菌手術(shù)刀切下綠芽，并將其轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基，含有大量元素、微量元素、CaCl?、FeSO?、200mg/LCarbincine、100mg/LKanamicine、1.0mg/L維生素、2.0mg/L甘氨酸、1.5%蔗糖、0.6-0.7%瓊脂、pH5.7-5.8）中進(jìn)行篩選。將培養(yǎng)盒置于24℃光照培養(yǎng)箱中，在14h光照/10h黑暗條件下培養(yǎng)篩選，使綠芽生根。將能在生根培養(yǎng)基中長出根的幼苗的芽切下，再次插入到生根培養(yǎng)基中，在相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)篩選，挑選出能長出根的煙草幼苗，將其植入土壤中生長，最終獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。四、蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草4.2轉(zhuǎn)化煙草的檢測(cè)與分析4.2.1PCR檢測(cè)為了驗(yàn)證蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體是否成功整合到煙草基因組中，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因煙草植株進(jìn)行PCR檢測(cè)。以未轉(zhuǎn)化的煙草植株基因組DNA作為陰性對(duì)照，以含有蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA作為陽性對(duì)照。使用針對(duì)cp基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物序列與之前構(gòu)建載體時(shí)使用的引物相同。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，其中包括10×PCR緩沖液2.5μL，dNTPs（2.5mMeach）2μL，正向引物（10μM）1μL，反向引物（10μM）1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.25μL，模板DNA1μL，用ddH?O補(bǔ)足至25μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，陰性對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶，陽性對(duì)照在預(yù)期的[具體預(yù)期大小]bp位置出現(xiàn)了清晰的條帶。部分轉(zhuǎn)基因煙草植株的PCR產(chǎn)物也在預(yù)期位置出現(xiàn)了特異性條帶（圖4），表明蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體已成功整合到這些煙草植株的基因組中。4.2.2Southern雜交檢測(cè)Southern雜交檢測(cè)是一種用于檢測(cè)DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)，其原理基于核酸分子雜交。首先，提取轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組DNA，使用限制性內(nèi)切酶對(duì)其進(jìn)行酶切，將基因組DNA切割成不同大小的片段。本研究中選用的限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別并切割cp基因兩側(cè)的特定序列，使cp基因從基因組DNA中分離出來。酶切后的DNA片段通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，在電場(chǎng)的作用下，DNA片段根據(jù)其大小在凝膠中遷移，較小的片段遷移速度快，較大的片段遷移速度慢，從而實(shí)現(xiàn)不同大小DNA片段的分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的DNA片段通過毛細(xì)管轉(zhuǎn)移或電轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，使DNA片段固定在尼龍膜上，保持其在凝膠中的相對(duì)位置不變。將標(biāo)記有地高辛（DIG）的cp基因片段作為探針，與固定在尼龍膜上的DNA進(jìn)行雜交。地高辛是一種非放射性標(biāo)記物，具有低噪、高敏、無放射性污染等優(yōu)點(diǎn)。在雜交過程中，探針與尼龍膜上具有互補(bǔ)序列的DNA片段按照堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則結(jié)合，形成雙鏈DNA分子。雜交結(jié)束后，通過免疫化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)探針與DNA的結(jié)合情況。利用抗地高辛抗體與地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合，再加入顯色底物，在抗體與底物的作用下，發(fā)生顏色反應(yīng)，從而在尼龍膜上顯示出與探針雜交的DNA條帶。結(jié)果顯示，在陽性對(duì)照中，出現(xiàn)了明顯的雜交信號(hào)，表明探針能夠與陽性對(duì)照中的cp基因特異性結(jié)合。在部分轉(zhuǎn)基因煙草植株中，也檢測(cè)到了雜交信號(hào)，且雜交條帶的位置與陽性對(duì)照一致（圖5），而陰性對(duì)照未出現(xiàn)雜交信號(hào)。這進(jìn)一步證實(shí)了蘋果莖溝病毒cp基因hpRNA表達(dá)載體已整合到轉(zhuǎn)基因煙草植株的基因組中，且整合的拷貝數(shù)和位置在不同轉(zhuǎn)基因植株中可能存在差異。通過Southern雜交檢測(cè)，不僅確定了基因的整合情況，還能初步分析基因在基因組中的整合方式和拷貝數(shù)，為后續(xù)研究轉(zhuǎn)基因煙草的遺傳穩(wěn)定性和表達(dá)特性提供了重要依據(jù)。4.2.3hpRNA在煙草中的表達(dá)分析為了準(zhǔn)確分析hpRNA在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)水平，采用RT-qPCR技術(shù)。該技術(shù)是在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，能夠?qū)μ囟ɑ虻霓D(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量分析。首先，提取轉(zhuǎn)基因煙草植株和未轉(zhuǎn)化煙草植株（作為對(duì)照）的總RNA。提取過程使用RNA提取試劑盒，按照說明書的步驟進(jìn)行操作，確保獲得高質(zhì)量的總RNA，其OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，且無明顯的降解和污染。將提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中包含逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物或oligo(dT)引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄緩沖液等。反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，以確保RNA能夠高效地逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以合成的cDNA為模板，使用針對(duì)hpRNA設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系中包括SYBRGreen熒光染料、TaqDNA聚合酶、引物、cDNA模板等。在PCR擴(kuò)增過程中，SYBRGreen能夠與雙鏈DNA結(jié)合，發(fā)出熒光信號(hào)，隨著PCR產(chǎn)物的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，利用儀器自帶的軟件分析每個(gè)樣品的Ct值（Cyclethreshold），Ct值與模板中目標(biāo)基因的起始拷貝數(shù)成反比，即Ct值越小，目標(biāo)基因的表達(dá)量越高。為了校正不同樣品之間的RNA上樣量和逆轉(zhuǎn)錄效率的差異，選擇煙草的內(nèi)參基因（如actin基因）進(jìn)行同步擴(kuò)增，以內(nèi)參基因的Ct值對(duì)目標(biāo)基因的Ct值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用2-ΔΔCt法計(jì)算hpRNA在轉(zhuǎn)基因煙草中的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，與未轉(zhuǎn)化的煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草植株中hpRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著升高（圖6）。不同轉(zhuǎn)基因煙草株系之間，hpRNA的表達(dá)水平存在一定的差異，這可能是由于基因整合位點(diǎn)的不同、拷貝數(shù)的差異以及轉(zhuǎn)基因沉默等因素導(dǎo)致的。通過RT-qPCR技術(shù)對(duì)hpRNA表達(dá)水平的分析，為進(jìn)一步研究hpRNA在煙草中的抗病毒功能提供了數(shù)據(jù)支持，明確了hpRNA在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達(dá)情況，有助于評(píng)估RNA干擾技術(shù)在煙草抗病毒研究中的效果。五、轉(zhuǎn)化煙草對(duì)蘋果莖溝病毒抗性分析5.1病毒接種與抗性鑒定方法本研究采用汁液摩擦接種法對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和未轉(zhuǎn)化煙草（對(duì)照）進(jìn)行蘋果莖溝病毒的接種。選取生長狀況一致、具有5-6片真葉的煙草植株作為接種對(duì)象。從感染蘋果莖溝病毒的蘋果植株上采集病葉，將病葉剪碎后放入研缽中，按照1:10（w/v）的比例加入含有0.01M磷酸緩沖液（pH7.0）和少量石英砂的研磨液，充分研磨，使病葉組織破碎，釋放出病毒粒子，形成均勻的病毒汁液。用棉球蘸取病毒汁液，在煙草葉片表面輕輕摩擦，摩擦?xí)r注意力度均勻，確保病毒汁液能夠充分接觸葉片表皮細(xì)胞，每個(gè)葉片正反兩面都要進(jìn)行摩擦接種。為了防止接種過程中的交叉污染，每接種一株煙草，都要更換新的棉球，并對(duì)研缽和工具進(jìn)行消毒處理。接種完成后，將煙草植株置于溫度為25-28℃、光照強(qiáng)度為10000-15000lx、光照時(shí)間為16h/d的溫室環(huán)境中培養(yǎng)，保證植株生長環(huán)境的適宜性。接種后的煙草植株，每天定時(shí)進(jìn)行觀察，記錄其發(fā)病癥狀。觀察指標(biāo)包括葉片是否出現(xiàn)褪綠斑、壞死斑、斑駁、皺縮、畸形等典型的病毒感染癥狀，以及癥狀出現(xiàn)的時(shí)間、部位和發(fā)展情況。同時(shí)，記錄植株的生長狀況，如株高、葉片數(shù)、葉面積等，以評(píng)估病毒感染對(duì)植株整體生長的影響。例如，在接種后的第3天，開始觀察到部分對(duì)照植株的葉片出現(xiàn)輕微的褪綠斑；隨著時(shí)間的推移，褪綠斑逐漸擴(kuò)大，并出現(xiàn)壞死斑，葉片開始皺縮、畸形，植株生長明顯受到抑制，株高增長緩慢，葉片數(shù)和葉面積的增加也受到阻礙。而轉(zhuǎn)基因煙草植株在接種后的一段時(shí)間內(nèi)，發(fā)病癥狀相對(duì)較輕，出現(xiàn)癥狀的時(shí)間也較晚，部分轉(zhuǎn)基因植株甚至在較長時(shí)間內(nèi)未表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀，生長狀況相對(duì)較好，株高、葉片數(shù)和葉面積的增長受影響較小。5.2抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論經(jīng)過一段時(shí)間的觀察，接種蘋果莖溝病毒后的轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草表現(xiàn)出明顯不同的癥狀。在接種后的第7天，對(duì)照煙草植株開始出現(xiàn)輕微的褪綠斑，隨著時(shí)間的推移，癥狀逐漸加重。在接種后的第14天，褪綠斑明顯擴(kuò)大，葉片出現(xiàn)斑駁、皺縮現(xiàn)象，部分葉片開始畸形，植株生長速度明顯減緩，株高增長緩慢，葉片數(shù)和葉面積的增加也受到明顯抑制。到接種后的第21天，對(duì)照煙草植株的病情進(jìn)一步惡化，大部分葉片嚴(yán)重皺縮、畸形，壞死斑增多，植株生長嚴(yán)重受阻，甚至出現(xiàn)部分葉片枯萎脫落的現(xiàn)象。而轉(zhuǎn)基因煙草植株在接種后的癥狀表現(xiàn)則相對(duì)較輕。部分轉(zhuǎn)基因煙草植株在接種后的第10天左右才開始出現(xiàn)極輕微的褪綠癥狀，且癥狀發(fā)展緩慢。在接種后的第14天，僅有少數(shù)葉片出現(xiàn)輕微的褪綠斑，葉片的斑駁、皺縮和畸形現(xiàn)象不明顯，植株的生長狀況受影響較小，株高、葉片數(shù)和葉面積的增長雖然有所減緩，但仍保持相對(duì)正常的生長速度。在接種后的第21天，部分轉(zhuǎn)基因煙草植株的癥狀略有加重，但總體病情仍顯著低于對(duì)照煙草，仍有部分葉片保持相對(duì)正常的形態(tài)和生長狀態(tài)。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草和對(duì)照煙草植株體內(nèi)的病毒含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，對(duì)照煙草植株在接種后，病毒含量迅速上升，在接種后的第14天達(dá)到峰值，隨后雖略有下降，但仍維持在較高水平。而轉(zhuǎn)基因煙草植株在接種后，病毒含量增長緩慢，在接種后的第14天，其病毒含量僅為對(duì)照煙草的[X]%，顯著低于對(duì)照煙草。這表明轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)蘋果莖溝病毒具有明顯的抗性，能夠有效抑制病毒在植株體內(nèi)的繁殖