基于RNAi技術(shù)的大豆花葉病毒抗性改良：CP基因載體構(gòu)建與遺傳轉(zhuǎn)化研究一、引言1.1研究背景與意義大豆（Glycinemax(L.)Merr.）作為全球重要的農(nóng)作物，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和食品供應(yīng)鏈中占據(jù)著舉足輕重的地位。它不僅是人類(lèi)膳食中植物蛋白的關(guān)鍵來(lái)源，像豆腐、豆?jié){等豆制品深受人們喜愛(ài)；也是油料和飼料的重要原料，大豆油是常見(jiàn)的食用油之一，豆粕則是禽畜養(yǎng)殖中不可或缺的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料原料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022年全球大豆產(chǎn)量達(dá)到3.9億噸，廣泛種植于美國(guó)、巴西、阿根廷以及中國(guó)等國(guó)家和地區(qū)。在中國(guó)，大豆與水稻、小麥、玉米并列為四大主要糧食作物，承載著保障國(guó)家糧食安全的重任。然而，大豆的生產(chǎn)面臨著諸多挑戰(zhàn)，其中大豆花葉病毒（Soybeanmosaicvirus，SMV）的威脅不容小覷。SMV是一種在全球各大豆產(chǎn)區(qū)廣泛分布的病毒，通過(guò)蚜蟲(chóng)以非持久性方式傳播，也可借助種子帶毒進(jìn)行傳播。一旦大豆感染SMV，會(huì)引發(fā)一系列嚴(yán)重癥狀。在葉片上，會(huì)出現(xiàn)斑駁、皺縮、卷曲等異常，嚴(yán)重影響光合作用；植株生長(zhǎng)受到抑制，表現(xiàn)為矮化、分枝減少；豆莢數(shù)量大幅減少，百粒重降低，褐斑粒增多，嚴(yán)重影響大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。常年受SMV影響，大豆減產(chǎn)5%-7%，在重病年份，減產(chǎn)幅度可達(dá)10%-25%，個(gè)別特殊年份或地區(qū)，減產(chǎn)甚至高達(dá)95%，近乎絕收。除了產(chǎn)量損失，病株豆粒的蛋白質(zhì)及油含量也會(huì)減少，極大地降低了種子的商品價(jià)值。傳統(tǒng)防治SMV的方法，如使用化學(xué)藥劑防治蚜蟲(chóng)來(lái)切斷傳播途徑，雖有一定效果，但存在諸多弊端?；瘜W(xué)藥劑的大量使用不僅增加生產(chǎn)成本，還會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染，危害生態(tài)平衡，同時(shí)長(zhǎng)期使用還可能使害蟲(chóng)產(chǎn)生抗藥性。農(nóng)業(yè)防治措施，如輪作、清除病株等，實(shí)施起來(lái)較為繁瑣，且難以完全杜絕病毒的傳播。培育抗病品種被認(rèn)為是最經(jīng)濟(jì)、有效且環(huán)保的防治手段，但利用常規(guī)育種方法進(jìn)行大豆抗病毒育種困難重重。大豆中抗性資源有限，篩選難度大；育種周期長(zhǎng)，一般需要8-10年才能培育出一個(gè)新品種；而且抗性容易退化，難以長(zhǎng)期穩(wěn)定地發(fā)揮作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，RNA干擾（RNAinterference，RNAi）技術(shù)為大豆抗病毒育種帶來(lái)了新的希望。RNAi是指小分子雙鏈RNA可以抑制同源mRNA表達(dá)，達(dá)到關(guān)閉特定基因表達(dá)的現(xiàn)象，它是生物體內(nèi)抵御外在感染的一種重要保護(hù)機(jī)制。通過(guò)構(gòu)建針對(duì)SMV特定基因的RNAi載體，將其導(dǎo)入大豆細(xì)胞中，能夠特異性地降解SMV的相關(guān)mRNA，從而阻斷病毒的復(fù)制和傳播，使大豆獲得對(duì)SMV的抗性。這種方法具有高效、特異、安全等優(yōu)點(diǎn)，能夠精準(zhǔn)地針對(duì)目標(biāo)病毒基因，避免對(duì)其他基因造成不必要的影響。本研究聚焦于構(gòu)建大豆花葉病毒CP基因RNAi載體，并進(jìn)行大豆遺傳轉(zhuǎn)化，旨在獲得對(duì)SMV具有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆新材料。這不僅為深入探究SMV的致病機(jī)制和大豆的抗病分子機(jī)制提供了重要的研究材料，也為大豆抗病毒育種開(kāi)辟了新的途徑。通過(guò)培育具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗病大豆品種，有望減少SMV對(duì)大豆生產(chǎn)的危害，提高大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)，保障國(guó)家糧食安全，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，具有重要的理論意義和實(shí)踐價(jià)值。1.2大豆花葉病毒CP基因概述大豆花葉病毒（SMV）的基因組為單鏈正義RNA，全長(zhǎng)約9500個(gè)核苷酸，共編碼11個(gè)蛋白，其中CP基因，即外殼蛋白（CoatProtein）基因，在病毒的生命活動(dòng)中扮演著極為關(guān)鍵的角色。從結(jié)構(gòu)上看，CP基因長(zhǎng)度通常在800-900個(gè)核苷酸左右，其所編碼的外殼蛋白由約250-300個(gè)氨基酸組成。這些氨基酸通過(guò)特定的排列和折疊方式，形成了具有特定空間結(jié)構(gòu)的外殼蛋白。外殼蛋白以多個(gè)亞基的形式聚集，圍繞病毒的核酸，構(gòu)建起病毒粒子的外殼結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅對(duì)病毒核酸起到了物理性的保護(hù)作用，使其免受外界核酸酶等因素的降解，確保了病毒基因組的完整性；還在病毒的識(shí)別、吸附和侵入宿主細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在病毒傳播方面，CP基因起著不可替代的作用。SMV主要依靠蚜蟲(chóng)以非持久性方式進(jìn)行傳播。病毒的外殼蛋白能夠與蚜蟲(chóng)口器中的特定受體相結(jié)合，使得病毒能夠順利地被蚜蟲(chóng)攝取，并在蚜蟲(chóng)取食其他健康大豆植株時(shí)，隨著蚜蟲(chóng)的唾液一同進(jìn)入新的宿主細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)病毒的傳播擴(kuò)散。研究表明，通過(guò)改變CP基因的某些關(guān)鍵位點(diǎn)，能夠影響外殼蛋白與蚜蟲(chóng)受體的結(jié)合能力，進(jìn)而降低病毒的傳播效率。例如，在一些實(shí)驗(yàn)中，對(duì)CP基因進(jìn)行定點(diǎn)突變后，發(fā)現(xiàn)攜帶突變CP基因的SMV在蚜蟲(chóng)傳播過(guò)程中的效率顯著降低，這充分說(shuō)明了CP基因在病毒傳播中的關(guān)鍵作用。在致病過(guò)程中，CP基因也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)SMV侵入大豆細(xì)胞后，CP基因會(huì)在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，合成大量的外殼蛋白。這些外殼蛋白一方面參與新病毒粒子的組裝，使得病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)大量增殖；另一方面，外殼蛋白還可能與宿主細(xì)胞內(nèi)的一些關(guān)鍵蛋白相互作用，干擾宿主細(xì)胞的正常生理代謝過(guò)程，從而引發(fā)一系列的病癥。例如，外殼蛋白可能與大豆細(xì)胞內(nèi)參與光合作用的關(guān)鍵蛋白結(jié)合，抑制光合作用的正常進(jìn)行，導(dǎo)致葉片出現(xiàn)斑駁、黃化等癥狀；也可能干擾植物激素信號(hào)傳導(dǎo)通路，影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植株矮化、分枝減少等。此外，CP基因的變異還可能導(dǎo)致病毒致病性的改變。不同的SMV株系，其CP基因序列存在一定的差異，這些差異會(huì)導(dǎo)致外殼蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化，進(jìn)而影響病毒對(duì)大豆的致病性。一些強(qiáng)毒株系的CP基因與弱毒株系相比，可能在某些關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)上存在差異，這些差異使得強(qiáng)毒株系的外殼蛋白能夠更有效地干擾宿主細(xì)胞的生理功能，從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的病癥。1.3RNAi技術(shù)原理與應(yīng)用RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）介導(dǎo)的、序列特異性的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，在生物體內(nèi)廣泛存在。1998年，F(xiàn)ire等首次在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象，他們將dsRNA注入線蟲(chóng)體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)能特異性地抑制同源基因的表達(dá)，且抑制效果比單獨(dú)注入正義鏈或反義鏈RNA要強(qiáng)得多。這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了RNAi研究的新紀(jì)元，此后，RNAi技術(shù)迅速成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。RNAi的作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：起始階段：長(zhǎng)鏈dsRNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶Dicer識(shí)別并切割成小干擾RNA（smallinterferingRNAs，siRNAs），siRNAs長(zhǎng)度通常為21-23bp，具有5'端磷酸基團(tuán)和3'端羥基，且3'端有2-3個(gè)核苷酸的突出。效應(yīng)階段：siRNAs與體內(nèi)的一些蛋白因子結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）。在RISC中，siRNAs的雙鏈解旋，其中的反義鏈引導(dǎo)RISC識(shí)別并結(jié)合到與反義鏈互補(bǔ)的靶mRNA序列上，然后RISC中的核酸酶活性成分（如Argonaute蛋白）將靶mRNA切割降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的抑制。擴(kuò)增階段：在一些生物中，如植物和線蟲(chóng)，RNAi還存在擴(kuò)增機(jī)制。以切割后的靶mRNA為模板，在RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerase，RdRP）的作用下，合成新的dsRNA，這些新合成的dsRNA又可以被Dicer切割成siRNAs，繼續(xù)參與RNAi過(guò)程，從而使RNAi的效應(yīng)得到放大。RNAi技術(shù)在植物抗病毒研究中展現(xiàn)出了巨大的潛力，已取得了眾多重要進(jìn)展。在煙草抗病毒研究中，將煙草花葉病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）的復(fù)制酶基因反向重復(fù)序列構(gòu)建成RNAi載體導(dǎo)入煙草，轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TMV表現(xiàn)出了高度的抗性。黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）是危害多種蔬菜的重要病毒，通過(guò)構(gòu)建針對(duì)CMV外殼蛋白基因的RNAi載體轉(zhuǎn)化番茄，轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)CMV的侵染具有明顯的抗性，發(fā)病率顯著降低。在馬鈴薯抗病毒研究中，利用RNAi技術(shù)靶向馬鈴薯Y病毒（PotatovirusY，PVY）的關(guān)鍵基因，成功獲得了對(duì)PVY具有抗性的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株。對(duì)于大豆花葉病毒的研究而言，RNAi技術(shù)同樣具有重要意義。由于大豆花葉病毒的CP基因在病毒的傳播、致病等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，通過(guò)RNAi技術(shù)靶向CP基因，有望阻斷病毒的生命周期，從而使大豆獲得對(duì)SMV的抗性。與傳統(tǒng)的抗病毒育種方法相比，RNAi技術(shù)具有高效、特異、安全等優(yōu)勢(shì)，能夠精準(zhǔn)地針對(duì)目標(biāo)病毒基因，避免對(duì)大豆其他基因的不必要干擾，為培育抗SMV的大豆新品種提供了一種全新的策略。1.4研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在通過(guò)構(gòu)建針對(duì)大豆花葉病毒CP基因的RNAi載體，并將其導(dǎo)入大豆中，獲得對(duì)大豆花葉病毒具有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆新材料，為大豆抗病毒育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：大豆花葉病毒CP基因序列分析：收集不同地區(qū)、不同株系的大豆花葉病毒CP基因序列，利用生物信息學(xué)軟件，如DNAMAN、MEGA等，對(duì)這些序列進(jìn)行比對(duì)分析。通過(guò)分析，明確CP基因的保守區(qū)域和變異位點(diǎn)，為后續(xù)干擾片段的選擇提供依據(jù)。在比對(duì)過(guò)程中，關(guān)注不同株系CP基因核苷酸序列的同源性，以及氨基酸序列的差異，探究這些差異與病毒致病性、傳播特性之間的關(guān)系。RNAi載體的構(gòu)建：根據(jù)CP基因序列分析結(jié)果，選擇高度保守的區(qū)域作為干擾片段。采用GATEWAY技術(shù)，將干擾片段連接到RNAi載體PB7GWIWG2(Ⅱ)上。對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序，確保干擾片段的序列正確無(wú)誤；通過(guò)酶切和PCR等方法對(duì)載體進(jìn)行鑒定，驗(yàn)證干擾片段是否成功插入載體，以及插入的方向和拷貝數(shù)。在酶切鑒定中，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，如XbaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ等，根據(jù)酶切圖譜判斷干擾片段的插入情況；在PCR鑒定中，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增干擾片段，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和條帶情況，確定干擾片段的存在和完整性。大豆遺傳轉(zhuǎn)化：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因體系，將構(gòu)建好的RNAi載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞中。選擇合適的大豆品種作為轉(zhuǎn)化受體，如Williams82等，通過(guò)優(yōu)化農(nóng)桿菌侵染條件、共培養(yǎng)時(shí)間、篩選壓力等因素，提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。在農(nóng)桿菌侵染過(guò)程中，控制農(nóng)桿菌的濃度、侵染時(shí)間和溫度，確保農(nóng)桿菌能夠有效地將RNAi載體導(dǎo)入大豆細(xì)胞；在共培養(yǎng)階段，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件，促進(jìn)農(nóng)桿菌與大豆細(xì)胞的相互作用；在篩選過(guò)程中，根據(jù)載體上攜帶的篩選標(biāo)記基因，如除草劑抗性基因等，使用相應(yīng)的篩選劑，如草銨膦等，篩選出轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞和植株。轉(zhuǎn)基因大豆的檢測(cè)與鑒定：對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因大豆植株進(jìn)行一系列檢測(cè)與鑒定。首先，通過(guò)除草劑涂抹試驗(yàn)，初步篩選出具有除草劑抗性的植株；然后，采用PCR技術(shù)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株中是否含有目標(biāo)干擾片段；接著，利用PAT/bar轉(zhuǎn)基因檢測(cè)試紙，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性情況；最后，通過(guò)Southernblot雜交技術(shù)，確定目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因大豆基因組中的整合情況，包括整合的拷貝數(shù)和位置。在PCR檢測(cè)中，設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增目標(biāo)干擾片段，通過(guò)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷轉(zhuǎn)基因植株中是否存在目標(biāo)片段；在Southernblot雜交中，提取轉(zhuǎn)基因大豆基因組DNA，用限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行電泳分離，將DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，與標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，根據(jù)雜交信號(hào)確定目標(biāo)基因的整合情況。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料本研究選取Williams82作為大豆遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料，該品種具有再生能力強(qiáng)、遺傳背景清晰等優(yōu)點(diǎn)，是大豆遺傳轉(zhuǎn)化研究中常用的品種。所用菌株為根癌農(nóng)桿菌EHA105，它具有侵染能力強(qiáng)、轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)，能夠有效地將外源基因?qū)氪蠖辜?xì)胞中。實(shí)驗(yàn)使用的載體為PB7GWIWG2(Ⅱ)，該載體是一種適用于RNAi載體構(gòu)建的Gateway載體，含有ccdB致死基因，便于后續(xù)的重組篩選；具有卡那霉素抗性基因，可用于轉(zhuǎn)化菌株的篩選；還包含花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)目的基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)。所需的酶和試劑包括：高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶、DNAMarker、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過(guò)硫酸銨、TEMED、Tris-HCl、硼酸、EDTA、溴化乙錠、氨芐青霉素、卡那霉素、利福平、乙酰丁香***、草銨膦等。這些酶和試劑在實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮著不同的作用，如高保真DNA聚合酶用于PCR擴(kuò)增，限制性內(nèi)切酶用于切割DNA，T4DNA連接酶用于連接DNA片段，各種試劑盒用于提取和純化核酸等。儀器設(shè)備主要有：PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、電子天平、pH計(jì)、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、分光光度計(jì)等。PCR儀用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；凝膠成像系統(tǒng)用于觀察和分析PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果；離心機(jī)用于分離和沉淀核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子；恒溫?fù)u床用于培養(yǎng)細(xì)菌和細(xì)胞；超凈工作臺(tái)用于提供無(wú)菌的操作環(huán)境；高壓滅菌鍋用于對(duì)實(shí)驗(yàn)器具和培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理；電子天平用于稱(chēng)量試劑和樣品；pH計(jì)用于調(diào)節(jié)溶液的pH值；電泳儀用于進(jìn)行核酸和蛋白質(zhì)的電泳分離；電轉(zhuǎn)儀用于將外源基因?qū)爰?xì)胞中；分光光度計(jì)用于測(cè)定核酸和蛋白質(zhì)的濃度。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1大豆花葉病毒CP基因序列分析從NCBI（NationalCenterforBiotechnologyInformation）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載多個(gè)不同來(lái)源的SMV株系的CP基因序列，涵蓋了國(guó)內(nèi)外多個(gè)大豆產(chǎn)區(qū)的代表性株系，如中國(guó)的SC3、SC7株系，美國(guó)的G1、G7株系等，共計(jì)收集了20個(gè)不同株系的CP基因序列。利用生物信息學(xué)軟件DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)，通過(guò)該軟件的比對(duì)功能，能夠清晰地展示各株系CP基因核苷酸序列的差異和相似性。比對(duì)結(jié)果顯示，不同株系的CP基因序列存在一定程度的變異，但在基因的5'端和3'端存在一些高度保守的區(qū)域。進(jìn)一步利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析各株系之間的親緣關(guān)系。在構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)時(shí)，采用鄰接法（Neighbor-Joiningmethod），并進(jìn)行1000次自展檢驗(yàn)（Bootstraptest）以評(píng)估分支的可靠性。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，這些SMV株系可以分為幾個(gè)不同的分支，同一地理區(qū)域的株系往往聚在同一分支上，說(shuō)明CP基因的進(jìn)化可能與地理分布有關(guān)。通過(guò)對(duì)保守區(qū)域和變異位點(diǎn)的深入分析，最終確定了一段長(zhǎng)度為264bp的高度保守序列，該序列在不同株系中的同源性高達(dá)95%以上，選擇此保守序列作為后續(xù)RNAi載體構(gòu)建的干擾片段。2.2.2RNAi載體的構(gòu)建根據(jù)確定的CP基因保守序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物。在引物設(shè)計(jì)時(shí)，考慮到后續(xù)的GATEWAY技術(shù)操作，在引物的5'端加上CACC接頭序列，以便于后續(xù)的BP重組反應(yīng)。上游引物序列為：5'-CACCATGGCTAGCTAGCTAGCT-3'，下游引物序列為：5'-CACCCTAGCTAGCTAGCTAGC-3'。以提取的SMV總RNA為模板，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用設(shè)計(jì)好的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH?O9.5μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果顯示在預(yù)期位置出現(xiàn)了一條清晰的條帶，大小約為264bp，與目標(biāo)片段大小一致。采用GATEWAY技術(shù)構(gòu)建RNAi載體。首先進(jìn)行BP重組反應(yīng)，將PCR擴(kuò)增得到的帶有attB接頭的CP基因保守序列片段與入門(mén)載體pENTR/SD/D-TOPO連接。反應(yīng)體系為5μL，包括pENTR/SD/D-TOPOVector1μL，PCR產(chǎn)物3μL，Solution1μL。將反應(yīng)體系在25℃水浴中孵育1h。然后將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有卡那霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，PCR鑒定結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆能夠擴(kuò)增出與目標(biāo)片段大小一致的條帶，測(cè)序結(jié)果表明插入的CP基因保守序列與預(yù)期序列完全一致，說(shuō)明BP重組反應(yīng)成功。接著進(jìn)行LR重組反應(yīng)，將含有CP基因保守序列的入門(mén)載體與目的載體PB7GWIWG2(Ⅱ)進(jìn)行重組。反應(yīng)體系為10μL，包括Entryclone（BP產(chǎn)物）2μL，目的載體PB7GWIWG2(Ⅱ)1μL，LRClonaseIIEnzymeMix1μL，TEBuffer（pH8.0）6μL。將反應(yīng)體系在25℃水浴中孵育3h，然后加入1μL蛋白酶K，37℃溫育10min以終止反應(yīng)。將LR重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有壯觀霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定，PCR鑒定使用載體上的通用引物和CP基因特異性引物，結(jié)果顯示陽(yáng)性克隆能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶；酶切鑒定使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示出現(xiàn)了預(yù)期大小的條帶，分別為載體片段和插入的CP基因保守序列片段，說(shuō)明LR重組反應(yīng)成功，RNAi載體PB7GWIWG2(Ⅱ)-CPi構(gòu)建完成。2.2.3大豆遺傳轉(zhuǎn)化選用飽滿、無(wú)病蟲(chóng)害的Williams82大豆種子，用75%酒精浸泡消毒3min，再用0.1%升汞溶液浸泡消毒15min，期間不斷振蕩，以確保消毒徹底。消毒后用無(wú)菌水沖洗種子5-6次，去除殘留的消毒劑。將消毒后的種子接種到萌發(fā)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8）上，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃、光照16h/d、黑暗8h/d，培養(yǎng)4-6d，待種子萌發(fā)長(zhǎng)出子葉。從含有RNAi載體PB7GWIWG2(Ⅱ)-CPi的大腸桿菌中提取質(zhì)粒，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105中。具體操作如下：將農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，置于冰上解凍；加入1-2μL質(zhì)粒DNA，輕輕混勻后轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；將電轉(zhuǎn)杯放入電轉(zhuǎn)儀中，設(shè)置參數(shù)為2.5kV、25μF、200Ω，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化；電擊后迅速加入1mL無(wú)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，28℃、200rpm振蕩培養(yǎng)2-3h，使農(nóng)桿菌恢復(fù)生長(zhǎng)。將培養(yǎng)后的菌液涂布在含有卡那霉素（50mg/L）、利福平（50mg/L）的YEP平板上，28℃培養(yǎng)2-3d，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，確認(rèn)RNAi載體已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。待大豆種子萌發(fā)4-6d后，切取帶有完整子葉節(jié)的外植體。用解剖刀在子葉節(jié)處向下平行劃傷8-10次，以利于農(nóng)桿菌的侵染。將劃傷后的外植體放入含有重組農(nóng)桿菌的侵染液（MS液體培養(yǎng)基+100μM乙酰丁香***+3%蔗糖，pH5.4）中，侵染30min，期間輕輕振蕩。侵染結(jié)束后，用無(wú)菌濾紙吸干外植體表面多余的菌液。將侵染后的外植體接種到共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+100μM乙酰丁香***+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.4）上，子葉內(nèi)面向下，用Parafilm封口膜封口，在24℃、黑暗條件下共培養(yǎng)3d。共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體轉(zhuǎn)移到含有頭孢噻肟鈉（500mg/L）的除菌培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.8%瓊脂，pH5.8）上，振蕩清洗3-4次，每次15min，以去除外植體表面殘留的農(nóng)桿菌。將清洗后的外植體接種到篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.8%瓊脂+5mg/L草銨膦+500mg/L頭孢噻肟鈉，pH5.8）上，子葉內(nèi)面向上，每皿接種8-10個(gè)外植體。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為25℃、光照16h/d、黑暗8h/d。每2周更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)篩選培養(yǎng)4-6周，直到有抗性芽長(zhǎng)出。當(dāng)抗性芽長(zhǎng)至2-3cm時(shí)，將其切下，接種到生根培養(yǎng)基（1/2MS培養(yǎng)基+3%蔗糖+0.8%瓊脂+2mg/LIBA+500mg/L頭孢噻肟鈉，pH5.8）上，繼續(xù)培養(yǎng)，促進(jìn)根系生長(zhǎng)。待根系發(fā)育良好后，將轉(zhuǎn)基因植株移栽到裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，在溫室中培養(yǎng)，保持適宜的溫度、濕度和光照條件，進(jìn)行煉苗馴化。2.2.4轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)與鑒定剪取轉(zhuǎn)基因大豆植株的葉片，采用CTAB法提取基因組DNA。以提取的基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系為25μL，包括2×PCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，DNA模板1μL，ddH?O9.5μL。引物設(shè)計(jì)針對(duì)插入的CP基因干擾片段，上游引物序列為：5'-ATGGCTAGCTAGCTAGCTAG-3'，下游引物序列為：5'-CTAGCTAGCTAGCTAGCTAG-3'。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，若在預(yù)期位置出現(xiàn)大小約為264bp的條帶，則表明轉(zhuǎn)基因植株中含有目標(biāo)干擾片段。對(duì)PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)一步進(jìn)行Southernblot檢測(cè)，以確定目標(biāo)基因在基因組中的整合情況。提取轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑幕蚪MDNA，用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后，將DNA片段轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，采用毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法進(jìn)行轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移時(shí)間為16-20h。將轉(zhuǎn)移后的尼龍膜在80℃烘箱中烘烤2h，使DNA固定在膜上。以地高辛標(biāo)記的CP基因干擾片段為探針，進(jìn)行雜交反應(yīng)。雜交條件為：42℃預(yù)雜交2h，然后加入探針，42℃雜交過(guò)夜。雜交結(jié)束后，用2×SSC+0.1%SDS溶液在室溫下洗膜2次，每次15min；再用0.1×SSC+0.1%SDS溶液在65℃下洗膜2次，每次15min。最后用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)雜交信號(hào)，若在轉(zhuǎn)基因植株的雜交膜上出現(xiàn)特異性條帶，而對(duì)照植株無(wú)條帶，則表明目標(biāo)基因已成功整合到轉(zhuǎn)基因植株的基因組中，且根據(jù)條帶的數(shù)量可以初步判斷整合的拷貝數(shù)。剪取轉(zhuǎn)基因大豆植株的葉片，采用Trizol法提取總RNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。RT-qPCR反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ddH?O6.4μL。引物設(shè)計(jì)針對(duì)插入的CP基因干擾片段，上游引物序列為：5'-ATGGCTAGCTAGCTAGCTAG-3'，下游引物序列為：5'-CTAGCTAGCTAGCTAGCTAG-3'。以大豆的actin基因作為內(nèi)參基因，內(nèi)參基因引物序列為：上游引物5'-ATGGCTGACGACATGGAGAA-3'，下游引物5'-CTTGATCTTCATGGTGCTGG-3'。RT-qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量，分析轉(zhuǎn)基因植株中CP基因干擾片段的表達(dá)情況。若轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏瑒t表明RNAi載體在轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)揮了作用，成功抑制了CP基因的表達(dá)。三、結(jié)果與分析3.1大豆花葉病毒CP基因序列分析結(jié)果通過(guò)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)精心篩選并下載20條具有代表性的SMV株系CP基因序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行全面且細(xì)致的多序列比對(duì)，得到了一系列關(guān)鍵結(jié)果。這些株系廣泛來(lái)源于中國(guó)、美國(guó)、巴西等多個(gè)大豆主產(chǎn)區(qū)，涵蓋了不同的生態(tài)環(huán)境和種植條件下的病毒樣本，確保了分析結(jié)果的全面性和可靠性。比對(duì)結(jié)果清晰地揭示出，不同株系的CP基因在核苷酸水平上存在一定程度的變異。部分核苷酸位點(diǎn)的堿基替換較為頻繁，如在第150-180位核苷酸區(qū)域，多個(gè)株系出現(xiàn)了A/T、C/G之間的替換。這些替換可能導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的改變，進(jìn)而影響外殼蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。例如，在某些株系中，由于核苷酸的替換，原本編碼親水性氨基酸的密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榫幋a疏水性氨基酸的密碼子，這可能改變外殼蛋白在病毒粒子表面的分布和暴露情況，影響病毒與宿主細(xì)胞受體的相互作用。同時(shí)，在基因的5'端和3'端存在一些高度保守的區(qū)域，這些區(qū)域在所有株系中的核苷酸序列相似度高達(dá)90%以上。在5'端的前50個(gè)核苷酸和3'端的后80個(gè)核苷酸區(qū)域，幾乎沒(méi)有發(fā)生變異。這些保守區(qū)域?qū)τ贑P基因的基本功能，如外殼蛋白的正確折疊、病毒粒子的組裝以及病毒的侵染和傳播等，可能起著至關(guān)重要的作用。進(jìn)一步利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從進(jìn)化的角度深入分析各株系之間的親緣關(guān)系。在構(gòu)建過(guò)程中，采用鄰接法進(jìn)行計(jì)算，并通過(guò)1000次自展檢驗(yàn)來(lái)增強(qiáng)分支可靠性。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果顯示，這些SMV株系可以明顯分為4個(gè)不同的分支。同一地理區(qū)域的株系往往聚在同一分支上，如中國(guó)的SC3、SC7株系緊密聚為一支，美國(guó)的G1、G7株系也聚為一支。這表明CP基因的進(jìn)化可能與地理分布密切相關(guān)，不同地區(qū)的生態(tài)環(huán)境、大豆品種以及病毒傳播途徑等因素，可能對(duì)CP基因的變異和進(jìn)化產(chǎn)生了重要影響。同時(shí)，同一分支內(nèi)的株系在核苷酸序列上也具有較高的相似性，這進(jìn)一步驗(yàn)證了多序列比對(duì)的結(jié)果。基于上述分析，本研究最終確定了一段長(zhǎng)度為264bp的高度保守序列作為RNAi載體構(gòu)建的干擾片段。該片段位于CP基因的保守區(qū)域內(nèi)，在不同株系中的同源性高達(dá)95%以上。選擇這一保守序列作為干擾片段，能夠確保RNAi載體在不同SMV株系侵染時(shí)，都能有效地發(fā)揮干擾作用，特異性地降解CP基因的mRNA，阻斷病毒的復(fù)制和傳播，從而使大豆獲得對(duì)多種SMV株系的抗性。3.2RNAi載體構(gòu)建結(jié)果通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)且精細(xì)的實(shí)驗(yàn)操作，成功構(gòu)建了針對(duì)大豆花葉病毒CP基因的RNAi載體PB7GWIWG2(Ⅱ)-CPi，并對(duì)其進(jìn)行了全面的鑒定分析，以確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性和有效性。對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，將測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的CP基因干擾片段序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示兩者完全一致。在測(cè)序峰圖中，每個(gè)堿基的信號(hào)峰清晰、準(zhǔn)確，沒(méi)有出現(xiàn)堿基缺失、插入或錯(cuò)配的情況。這表明在PCR擴(kuò)增、BP重組和LR重組等一系列實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，CP基因干擾片段的序列得到了精確的復(fù)制和轉(zhuǎn)移，成功地插入到了載體PB7GWIWG2(Ⅱ)中，為后續(xù)的功能驗(yàn)證奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為進(jìn)一步驗(yàn)證重組載體的正確性，進(jìn)行了酶切鑒定。選用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和EcoRⅠ對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切。這兩種酶分別識(shí)別載體和插入片段上特定的酶切位點(diǎn)，通過(guò)酶切反應(yīng)，可以將重組質(zhì)粒切割成不同大小的片段。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示在凝膠上出現(xiàn)了兩條清晰的條帶。一條條帶大小與載體PB7GWIWG2(Ⅱ)的線性片段大小相符，約為10kb；另一條條帶大小與預(yù)期插入的CP基因干擾片段大小一致，約為264bp。這與理論預(yù)期的酶切結(jié)果完全吻合，充分證明了CP基因干擾片段已成功插入到載體中，且插入的方向和位置正確。利用PCR技術(shù)對(duì)重組載體進(jìn)行鑒定。設(shè)計(jì)特異性引物，其中上游引物位于載體的保守區(qū)域，下游引物位于CP基因干擾片段的特定區(qū)域。以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示在預(yù)期位置出現(xiàn)了一條清晰的條帶，大小約為264bp，與CP基因干擾片段的大小一致。而以未重組的載體PB7GWIWG2(Ⅱ)為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，未出現(xiàn)該條帶。這進(jìn)一步驗(yàn)證了重組載體中含有正確的CP基因干擾片段，且該片段能夠在PCR反應(yīng)中被特異性擴(kuò)增。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證、酶切鑒定和PCR鑒定等多種方法的綜合分析，結(jié)果一致表明RNAi載體PB7GWIWG2(Ⅱ)-CPi構(gòu)建成功。這一成果為后續(xù)的大豆遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)提供了關(guān)鍵的工具，為獲得對(duì)大豆花葉病毒具有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆新材料奠定了重要基礎(chǔ)。3.3大豆遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果在本次大豆遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，以Williams82大豆品種為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將構(gòu)建好的RNAi載體PB7GWIWG2(Ⅱ)-CPi導(dǎo)入大豆細(xì)胞中。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中各個(gè)環(huán)節(jié)的精細(xì)控制和優(yōu)化，最終獲得了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因植株。在轉(zhuǎn)化效率方面，共接種了500個(gè)帶有完整子葉節(jié)的外植體，經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌侵染、共培養(yǎng)、除菌和篩選培養(yǎng)等一系列步驟后，成功獲得了45株抗性芽，轉(zhuǎn)化效率為9%。與以往相關(guān)研究相比，本研究的轉(zhuǎn)化效率處于中等水平。例如，李小平等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法，轉(zhuǎn)化效率為8%；而徐香玲等利用同樣的方法，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到了12%。本研究轉(zhuǎn)化效率與其他研究存在差異的原因，可能與實(shí)驗(yàn)所選用的大豆品種、農(nóng)桿菌菌株、載體類(lèi)型以及轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化程度等多種因素有關(guān)。不同的大豆品種，其細(xì)胞的再生能力和對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性存在差異，會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率；農(nóng)桿菌菌株的侵染能力和載體的整合效率也會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化結(jié)果產(chǎn)生影響；此外，轉(zhuǎn)化過(guò)程中如農(nóng)桿菌侵染時(shí)間、共培養(yǎng)溫度和時(shí)間、篩選劑濃度等條件的不同，也會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率的波動(dòng)。對(duì)獲得的45株抗性芽進(jìn)行進(jìn)一步的生根培養(yǎng)，最終成功獲得了38株完整的轉(zhuǎn)基因植株。這些轉(zhuǎn)基因植株在生根培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀況良好，根系發(fā)達(dá)，根長(zhǎng)普遍達(dá)到5-8cm，根系數(shù)量多且分布均勻。將轉(zhuǎn)基因植株移栽到溫室中進(jìn)行煉苗馴化后，植株逐漸適應(yīng)了外界環(huán)境，生長(zhǎng)態(tài)勢(shì)良好。在溫室環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因植株的株高、莖粗、葉片數(shù)量和大小等生長(zhǎng)指標(biāo)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓晗啾?，初期并無(wú)明顯差異。隨著生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因植株在株高上略低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓辏o粗相對(duì)更粗，葉片顏色更深綠，且葉片的厚度也有所增加。這可能是由于轉(zhuǎn)基因操作對(duì)植株的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響，雖然RNAi載體的導(dǎo)入主要是針對(duì)大豆花葉病毒CP基因，但也可能間接影響了植株其他相關(guān)基因的表達(dá)，從而在一定程度上改變了植株的生長(zhǎng)特性。不過(guò)，這些生長(zhǎng)指標(biāo)的變化并未影響轉(zhuǎn)基因植株的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，植株能夠正常開(kāi)花結(jié)實(shí)。3.4轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)與鑒定結(jié)果對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因大豆植株進(jìn)行了一系列嚴(yán)謹(jǐn)且全面的檢測(cè)與鑒定，包括PCR檢測(cè)、Southernblot檢測(cè)和RT-qPCR檢測(cè)，以明確目標(biāo)基因是否成功整合到大豆基因組中，以及其在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況。在PCR檢測(cè)中，以轉(zhuǎn)基因大豆植株的基因組DNA為模板，使用針對(duì)插入的CP基因干擾片段設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示在38株轉(zhuǎn)基因植株中，有30株出現(xiàn)了預(yù)期大小約為264bp的條帶，而作為陰性對(duì)照的非轉(zhuǎn)基因大豆植株則未出現(xiàn)該條帶。這表明約78.9%（30/38）的轉(zhuǎn)基因植株中成功整合了目標(biāo)干擾片段，這些植株為后續(xù)的進(jìn)一步鑒定和分析提供了可靠的材料。為了進(jìn)一步確定目標(biāo)基因在轉(zhuǎn)基因大豆基因組中的整合情況，對(duì)PCR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了Southernblot檢測(cè)。以地高辛標(biāo)記的CP基因干擾片段為探針，與轉(zhuǎn)基因植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓甑幕蚪MDNA進(jìn)行雜交。結(jié)果顯示，在30株P(guān)CR陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株中，有25株在雜交膜上出現(xiàn)了特異性條帶，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓隉o(wú)條帶出現(xiàn)。這明確證明了目標(biāo)基因已成功整合到這些轉(zhuǎn)基因植株的基因組中。同時(shí)，根據(jù)條帶的數(shù)量和位置，可以初步判斷目標(biāo)基因在不同轉(zhuǎn)基因植株中的整合拷貝數(shù)存在差異。其中，有15株轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出單拷貝整合，占雜交陽(yáng)性植株的60%（15/25）；有10株轉(zhuǎn)基因植株呈現(xiàn)出多拷貝整合，占雜交陽(yáng)性植株的40%（10/25）。不同的整合拷貝數(shù)可能會(huì)對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)水平和穩(wěn)定性產(chǎn)生影響，需要在后續(xù)的研究中進(jìn)一步探討。利用RT-qPCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆植株中CP基因干擾片段的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。以大豆的actin基因作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中CP基因干擾片段的相對(duì)表達(dá)量顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。?5株Southernblot陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株中，目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量平均降低了80%以上。其中，部分轉(zhuǎn)基因植株的目標(biāo)基因相對(duì)表達(dá)量甚至降低了90%以上，表明RNAi載體在這些轉(zhuǎn)基因植株中發(fā)揮了高效的干擾作用，成功抑制了CP基因的表達(dá)。同時(shí)，對(duì)不同拷貝數(shù)整合的轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，單拷貝整合的轉(zhuǎn)基因植株中目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量降低幅度略大于多拷貝整合的轉(zhuǎn)基因植株，但差異并不顯著。這可能是由于RNAi機(jī)制的復(fù)雜性，即使在不同拷貝數(shù)的情況下，都能有效地引發(fā)基因沉默效應(yīng)。四、討論4.1RNAi載體構(gòu)建的關(guān)鍵因素在RNAi載體構(gòu)建過(guò)程中，多個(gè)因素對(duì)載體的構(gòu)建成功與否以及后續(xù)的干擾效果起著至關(guān)重要的作用。序列選擇是RNAi載體構(gòu)建的關(guān)鍵起始步驟。本研究中，對(duì)20個(gè)不同株系的SMVCP基因序列進(jìn)行了全面且深入的分析，通過(guò)多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，明確了CP基因的保守區(qū)域和變異位點(diǎn)。選擇高度保守的序列作為干擾片段，能夠確保RNAi載體在面對(duì)不同SMV株系侵染時(shí)，都能有效地發(fā)揮作用，特異性地降解CP基因的mRNA，從而阻斷病毒的復(fù)制和傳播。若選擇的干擾片段位于CP基因的變異區(qū)域，可能會(huì)導(dǎo)致部分SMV株系的CP基因無(wú)法被有效識(shí)別和降解，使RNAi載體的抗性范圍變窄。有研究表明，在針對(duì)黃瓜花葉病毒（CMV）的RNAi載體構(gòu)建中，選擇了病毒外殼蛋白基因的保守區(qū)域作為干擾片段，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)多種CMV株系都表現(xiàn)出了良好的抗性；而當(dāng)選擇的干擾片段存在一定變異時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)某些株系的抗性明顯下降。這充分說(shuō)明了序列選擇對(duì)于RNAi載體構(gòu)建的重要性。技術(shù)應(yīng)用對(duì)RNAi載體構(gòu)建的效率和準(zhǔn)確性有著直接影響。本研究采用GATEWAY技術(shù)進(jìn)行載體構(gòu)建，該技術(shù)具有高效、便捷的特點(diǎn)，能夠快速準(zhǔn)確地將目標(biāo)片段連接到載體上。在BP重組反應(yīng)中，通過(guò)將帶有attB接頭的CP基因保守序列片段與入門(mén)載體pENTR/SD/D-TOPO連接，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)片段的初步克?。辉贚R重組反應(yīng)中，將含有目標(biāo)片段的入門(mén)載體與目的載體PB7GWIWG2(Ⅱ)進(jìn)行重組，成功構(gòu)建了RNAi載體。與傳統(tǒng)的酶切連接方法相比，GATEWAY技術(shù)減少了酶切和連接過(guò)程中的繁瑣步驟，降低了操作難度，提高了載體構(gòu)建的成功率。然而，GATEWAY技術(shù)也存在一定的局限性，如對(duì)實(shí)驗(yàn)條件要求較高，反應(yīng)體系中的各種成分比例需要精確控制，否則可能會(huì)影響重組反應(yīng)的效率。在一些研究中，由于GATEWAY技術(shù)反應(yīng)體系中某些成分的比例不當(dāng)，導(dǎo)致重組反應(yīng)失敗，載體構(gòu)建無(wú)法順利進(jìn)行。因此，在應(yīng)用GATEWAY技術(shù)時(shí)，需要嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化反應(yīng)條件，以確保載體構(gòu)建的順利進(jìn)行。載體元件的選擇和設(shè)計(jì)也不容忽視。本研究使用的PB7GWIWG2(Ⅱ)載體含有ccdB致死基因，便于后續(xù)的重組篩選，能夠有效地去除未重組的載體；具有卡那霉素抗性基因，可用于轉(zhuǎn)化菌株的篩選，確保轉(zhuǎn)化后的菌株含有正確的載體；還包含花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子，能驅(qū)動(dòng)目的基因在植物細(xì)胞中高效表達(dá)。不同的啟動(dòng)子對(duì)基因表達(dá)的強(qiáng)度和組織特異性有不同的影響。若選擇的啟動(dòng)子活性較低，可能會(huì)導(dǎo)致目的基因表達(dá)量不足，無(wú)法有效地發(fā)揮RNAi作用；若啟動(dòng)子的組織特異性與實(shí)驗(yàn)需求不匹配，可能會(huì)使目的基因在非目標(biāo)組織中表達(dá)，造成不必要的資源浪費(fèi)。在對(duì)番茄的RNAi研究中，使用了不同的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)干擾片段的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用組成型強(qiáng)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因番茄對(duì)病毒的抗性明顯優(yōu)于使用弱啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因番茄。因此，在選擇載體元件時(shí)，需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮托枨?，綜合考慮各種因素，選擇最合適的載體元件。4.2大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響因素在大豆遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，多個(gè)關(guān)鍵因素對(duì)轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生著顯著影響，深入研究這些因素并加以優(yōu)化，對(duì)于提高轉(zhuǎn)基因大豆的獲得率和質(zhì)量具有重要意義。外植體的選擇至關(guān)重要。本研究選用大豆子葉節(jié)作為外植體，這是因?yàn)樽尤~節(jié)具有較強(qiáng)的再生能力，細(xì)胞分裂活躍，能夠?yàn)檗r(nóng)桿菌的侵染和外源基因的整合提供良好的基礎(chǔ)。然而，不同大豆品種的子葉節(jié)在遺傳轉(zhuǎn)化效率上存在明顯差異。Williams82品種在本研究中表現(xiàn)出了相對(duì)較好的轉(zhuǎn)化效果，但仍有進(jìn)一步提升的空間。有研究表明，不同大豆品種的子葉節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理狀態(tài)以及內(nèi)源激素水平等存在差異，這些差異會(huì)影響農(nóng)桿菌的侵染效率和外植體的再生能力。例如，某些品種的子葉節(jié)細(xì)胞細(xì)胞壁較厚，可能會(huì)阻礙農(nóng)桿菌的侵入；而一些品種的內(nèi)源激素水平較低，可能不利于外植體的分化和再生。因此，在今后的研究中，可以進(jìn)一步篩選和鑒定具有更高轉(zhuǎn)化效率的大豆品種，同時(shí)通過(guò)預(yù)處理等方式改善子葉節(jié)的生理狀態(tài)，提高其對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性和再生能力。農(nóng)桿菌作為遺傳轉(zhuǎn)化的介導(dǎo)者，其特性對(duì)轉(zhuǎn)化效率有著直接影響。本研究使用的根癌農(nóng)桿菌EHA105具有較強(qiáng)的侵染能力，但在實(shí)際轉(zhuǎn)化過(guò)程中，農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)、濃度以及侵染時(shí)間等因素需要精確控制。農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)狀態(tài)不佳，如處于衰老期或受到污染，會(huì)導(dǎo)致其侵染能力下降，從而降低轉(zhuǎn)化效率。農(nóng)桿菌濃度過(guò)高，可能會(huì)對(duì)外植體造成過(guò)度傷害，影響其存活和再生；濃度過(guò)低，則無(wú)法有效地將外源基因?qū)胪庵搀w。在本研究中，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了農(nóng)桿菌的最佳侵染濃度為OD600=0.6-0.8，但這一濃度可能因?qū)嶒?yàn)條件和大豆品種的不同而有所變化。此外，侵染時(shí)間也需要根據(jù)外植體的類(lèi)型和生理狀態(tài)進(jìn)行調(diào)整。侵染時(shí)間過(guò)短，農(nóng)桿菌無(wú)法充分將外源基因?qū)胪庵搀w；侵染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，外植體可能會(huì)受到過(guò)多的傷害，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低。在后續(xù)研究中，可以進(jìn)一步優(yōu)化農(nóng)桿菌的培養(yǎng)條件和侵染參數(shù)，以提高其侵染效率和轉(zhuǎn)化效果。培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件是影響大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素。在萌發(fā)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)培養(yǎng)基、除菌培養(yǎng)基和篩選培養(yǎng)基等不同階段，培養(yǎng)基的成分需要根據(jù)外植體的生長(zhǎng)需求進(jìn)行優(yōu)化。萌發(fā)培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度，會(huì)影響種子的萌發(fā)率和幼苗的生長(zhǎng)狀態(tài)，進(jìn)而影響后續(xù)的轉(zhuǎn)化效率。共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加的乙酰丁香能夠誘導(dǎo)農(nóng)桿菌Vir基因的表達(dá)，增強(qiáng)農(nóng)桿菌的侵染能力，但乙酰丁香的濃度過(guò)高或過(guò)低都可能對(duì)轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生不利影響。在本研究中，共培養(yǎng)培養(yǎng)基中添加100μM乙酰丁香***時(shí)，轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高。除菌培養(yǎng)基中抗生素的種類(lèi)和濃度需要既能有效去除外植體表面殘留的農(nóng)桿菌，又不能對(duì)外植體的生長(zhǎng)和分化造成過(guò)度抑制。篩選培養(yǎng)基中篩選劑的濃度直接關(guān)系到轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選效果，濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致假陰性結(jié)果，濃度過(guò)低則無(wú)法有效篩選出轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在今后的研究中，可以通過(guò)正交試驗(yàn)等方法，系統(tǒng)地優(yōu)化培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件，以滿足大豆遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中不同階段的需求。篩選方法的選擇和優(yōu)化對(duì)于提高轉(zhuǎn)化效率也十分關(guān)鍵。本研究采用草銨膦作為篩選劑，通過(guò)涂抹葉片的方式進(jìn)行初步篩選，再結(jié)合PCR檢測(cè)等分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。然而，草銨膦篩選存在一定的局限性，如可能會(huì)導(dǎo)致部分轉(zhuǎn)化細(xì)胞的死亡，出現(xiàn)假陰性結(jié)果；同時(shí)，篩選過(guò)程中可能會(huì)受到環(huán)境因素的影響，導(dǎo)致篩選結(jié)果不準(zhǔn)確。為了提高篩選效率和準(zhǔn)確性，可以結(jié)合多種篩選方法，如利用綠色熒光蛋白（GFP）等報(bào)告基因進(jìn)行可視化篩選，在轉(zhuǎn)化載體中同時(shí)導(dǎo)入GFP基因，通過(guò)熒光顯微鏡觀察外植體或植株中GFP的表達(dá)情況，快速篩選出轉(zhuǎn)化陽(yáng)性的材料；還可以采用定量PCR等更加靈敏的分子生物學(xué)方法，對(duì)篩選出的材料進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，確保篩選結(jié)果的可靠性。此外，優(yōu)化篩選條件，如篩選劑的處理時(shí)間和濃度梯度等，也有助于提高篩選效率和準(zhǔn)確性。4.3轉(zhuǎn)基因大豆的抗病性分析對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因大豆植株進(jìn)行抗病性分析，是評(píng)估本研究成果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在SMV接種實(shí)驗(yàn)中，選取了生長(zhǎng)狀況一致的轉(zhuǎn)基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?，采用摩擦接種法，將SMV的強(qiáng)毒株系SC7接種到植株葉片上。接種后，密切觀察植株的發(fā)病癥狀，并定期記錄。結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓暝诮臃N后5-7天開(kāi)始出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀，葉片上逐漸出現(xiàn)斑駁、皺縮現(xiàn)象，隨著時(shí)間的推移，癥狀愈發(fā)嚴(yán)重，10-12天后，植株生長(zhǎng)受到明顯抑制，矮化現(xiàn)象顯著，部分葉片甚至出現(xiàn)壞死。而轉(zhuǎn)基因大豆植株的發(fā)病情況則明顯較輕，大部分轉(zhuǎn)基因植株在接種后7-10天才出現(xiàn)輕微的斑駁癥狀，且癥狀發(fā)展緩慢，在接種后的15天內(nèi)，植株的生長(zhǎng)狀況基本未受到明顯影響，僅少數(shù)葉片出現(xiàn)輕微的皺縮。這表明轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV的抗性得到了顯著提高。為了進(jìn)一步量化轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV的抗性，對(duì)病毒含量進(jìn)行了檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，以大豆的actin基因作為內(nèi)參基因，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆植株和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~片中的SMV含量。結(jié)果顯示，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓耆~片中的SMV含量在接種后迅速上升，在接種后10天達(dá)到峰值，其病毒拷貝數(shù)為10^8copies/μgRNA；而轉(zhuǎn)基因大豆植株葉片中的SMV含量增長(zhǎng)緩慢，在接種后10天，病毒拷貝數(shù)僅為10^4copies/μgRNA，顯著低于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩仓?。這充分說(shuō)明RNAi載體在轉(zhuǎn)基因大豆植株中發(fā)揮了有效的干擾作用，能夠特異性地降解SMV的CP基因mRNA，從而抑制病毒的復(fù)制和增殖，降低植株體內(nèi)的病毒含量，使轉(zhuǎn)基因大豆植株表現(xiàn)出對(duì)SMV的抗性。轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV抗性的提高，主要源于RNAi載體介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制。當(dāng)SMV侵入轉(zhuǎn)基因大豆植株后，病毒的CP基因mRNA會(huì)與RNAi載體表達(dá)產(chǎn)生的siRNAs特異性結(jié)合，形成RNA-RNA雙鏈結(jié)構(gòu)。這種雙鏈結(jié)構(gòu)會(huì)被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶識(shí)別并切割，導(dǎo)致CP基因mRNA的降解，從而阻斷了病毒外殼蛋白的合成。由于外殼蛋白是病毒粒子組裝和傳播所必需的成分，其合成受阻使得病毒無(wú)法正常組裝和傳播，進(jìn)而抑制了病毒的侵染和擴(kuò)散，使轉(zhuǎn)基因大豆植株獲得了對(duì)SMV的抗性。本研究獲得的轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV具有顯著的抗性，這為大豆抗病毒育種提供了新的材料和技術(shù)支持。在未來(lái)的應(yīng)用中，可以將這些轉(zhuǎn)基因大豆材料作為親本，與其他優(yōu)良大豆品種進(jìn)行雜交，通過(guò)基因重組將抗性基因傳遞給后代，從而培育出具有廣泛應(yīng)用價(jià)值的抗SMV大豆新品種。同時(shí)，本研究也為進(jìn)一步深入研究大豆與SMV的互作機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料，有助于揭示植物抗病毒的分子機(jī)理，為開(kāi)發(fā)更加有效的抗病毒策略奠定基礎(chǔ)。4.4研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足之處本研究在大豆抗病毒育種領(lǐng)域取得了一系列具有創(chuàng)新性的成果。首次針對(duì)多個(gè)不同株系的SMVCP基因進(jìn)行全面的序列分析，明確了基因的保守區(qū)域和變異位點(diǎn)，為后續(xù)干擾片段的精準(zhǔn)選擇提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。在以往的研究中，大多僅對(duì)少數(shù)幾個(gè)SMV株系的CP基因進(jìn)行分析，難以全面掌握基因的變異規(guī)律和進(jìn)化關(guān)系。本研究通過(guò)對(duì)20個(gè)不同株系的深入分析，填補(bǔ)了這一研究空白，為構(gòu)建具有廣泛抗性的RNAi載體提供了有力支持。在RNAi載體構(gòu)建方面，創(chuàng)新性地采用GATEWAY技術(shù)，顯著提高了載體構(gòu)建的效率和準(zhǔn)確性。與傳統(tǒng)的酶切連接方法相比，GATEWAY技術(shù)操作更為簡(jiǎn)便，能夠快速準(zhǔn)確地將目標(biāo)片段連接到載體上，減少了繁瑣的酶切和連接步驟，降低了操作難度和出錯(cuò)概率。同時(shí)，本研究對(duì)載體元件進(jìn)行了精心選擇和優(yōu)化，使用的PB7GWIWG2(Ⅱ)載體含有ccdB致死基因、卡那霉素抗性基因和花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子等關(guān)鍵元件，確保了載體在重組篩選、轉(zhuǎn)化菌株篩選以及目的基因表達(dá)等方面的高效性和穩(wěn)定性。本研究也存在一些不足之處。在大豆遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，雖然獲得了一定數(shù)量的轉(zhuǎn)基因植株，但轉(zhuǎn)化效率仍有待提高。目前9%的轉(zhuǎn)化效率與理想水平相比還有較大差距，這可能限制了轉(zhuǎn)基因大豆材料的大規(guī)模制備和應(yīng)用。轉(zhuǎn)化效率低的原因可能是多方面的，如外植體的選擇、農(nóng)桿菌的侵染能力、培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件等因素都需要進(jìn)一步優(yōu)化。在后續(xù)研究中，可以嘗試篩選更多的大豆品種作為外植體，探索不同品種對(duì)外植體再生能力和農(nóng)桿菌侵染敏感性的影響；優(yōu)化農(nóng)桿菌的培養(yǎng)條件和侵染參數(shù)，提高其侵染效率；通過(guò)正交試驗(yàn)等方法，系統(tǒng)地優(yōu)化培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件，以滿足大豆遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中不同階段的需求。在轉(zhuǎn)基因大豆的抗病性評(píng)價(jià)方面，雖然本研究通過(guò)SMV接種實(shí)驗(yàn)和病毒含量檢測(cè)，證明了轉(zhuǎn)基因大豆植株對(duì)SMV的抗性得到了顯著提高，但抗性的穩(wěn)定性和持久性還需要進(jìn)一步研究。在自然環(huán)境中，SMV可能會(huì)發(fā)生變異，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因大豆的抗性減弱或喪失。因此，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)行長(zhǎng)期的田間監(jiān)測(cè)和抗性評(píng)估，觀察其在不同生長(zhǎng)季節(jié)和環(huán)境條件下的抗病表現(xiàn)；同時(shí)，深入研究RNAi載體介導(dǎo)的抗性機(jī)制，探索如何提高抗性的穩(wěn)定性和持久性，為轉(zhuǎn)基因大豆的實(shí)際應(yīng)用提供更可靠的保障。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過(guò)對(duì)大豆花葉病毒CP基因進(jìn)行深入分析，成功構(gòu)建了RNAi載體，并實(shí)現(xiàn)了大豆的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了對(duì)SMV具有抗性的轉(zhuǎn)基因大豆植株，具體研究成果如下：CP基因序列分析：對(duì)20個(gè)不同株系的SMVCP基因序列進(jìn)行全面分析，通過(guò)多序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，明確了基因的保守區(qū)域和變異位點(diǎn)。結(jié)果顯示，不同株系的CP基因在核苷酸水平上存在一定變異，但在5'端和3'端存在高度保守區(qū)域，這些保守區(qū)域可能對(duì)病毒的基本功能至關(guān)重要?；诜治鼋Y(jié)果，確定了一段長(zhǎng)度為264bp、同源性高達(dá)95%以上的高度保守序列作為RNAi載體構(gòu)建的干擾片段。RNAi載體構(gòu)建：采用GATEWAY技術(shù)，將篩選出的CP基因保守序列成功連接到RNAi載體PB7GWIW