基于Real-timePCR的兩種益生菌非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法的比較與優(yōu)化研究一、引言1.1研究背景在人體微生態(tài)系統(tǒng)中，益生菌作為一類對宿主有益的活性微生物，扮演著至關(guān)重要的角色，與人體健康緊密相連。在腸道內(nèi)，益生菌能通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，抑制有害菌的生長，促進(jìn)有益菌的增殖，從而維護(hù)腸道微生態(tài)的穩(wěn)定，預(yù)防和緩解腹瀉、便秘等腸道疾病。有研究表明，在抗生素相關(guān)性腹瀉的預(yù)防中，特定益生菌的補(bǔ)充可使腹瀉發(fā)生率顯著降低。在免疫調(diào)節(jié)方面，益生菌與免疫系統(tǒng)相互作用，刺激免疫細(xì)胞的活性，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力，幫助人體抵御病原體的入侵。如嗜酸乳桿菌能夠激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力，提升機(jī)體的免疫防御水平。隨著人們健康意識的不斷提高，益生菌產(chǎn)品在市場上的需求日益增長，涵蓋了食品、保健品、藥品等多個(gè)領(lǐng)域。在食品領(lǐng)域，益生菌酸奶、益生菌飲料等產(chǎn)品受到消費(fèi)者的廣泛喜愛；在保健品領(lǐng)域，益生菌膠囊、益生菌粉劑等成為熱門的健康補(bǔ)充劑；在藥品領(lǐng)域，益生菌制劑也被用于治療一些腸道疾病和調(diào)節(jié)腸道功能。對于益生菌產(chǎn)品而言，活菌數(shù)量是決定其功效的關(guān)鍵因素。只有達(dá)到一定數(shù)量的活菌，才能在腸道內(nèi)定殖并發(fā)揮作用。以雙歧桿菌為例，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)每克產(chǎn)品中雙歧桿菌的活菌數(shù)達(dá)到10^7CFU以上時(shí)，才能有效調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道功能。如果活菌數(shù)量不足，益生菌產(chǎn)品的功效將大打折扣，無法滿足消費(fèi)者對健康的需求。因此，準(zhǔn)確測定益生菌產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，對于評估產(chǎn)品質(zhì)量、確保產(chǎn)品功效以及保障消費(fèi)者權(quán)益具有重要意義。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法雖然是經(jīng)典的活菌計(jì)數(shù)方法，但存在檢測時(shí)間長、對生長條件要求苛刻、易受雜菌污染等缺點(diǎn)。例如，培養(yǎng)某些益生菌需要特定的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，且培養(yǎng)時(shí)間可能長達(dá)數(shù)天，這不僅耗費(fèi)時(shí)間和人力，還可能因雜菌的生長而影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。熒光染色法雖然具有快速、靈敏的特點(diǎn)，但也存在染色劑選擇、操作復(fù)雜等問題，且對設(shè)備要求較高。Real-timePCR技術(shù)作為一種先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)，近年來在微生物檢測領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。該技術(shù)能夠在PCR反應(yīng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。在諾卡菌的檢測中，Real-timePCR技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地檢測出諾卡菌的存在，為疾病的診斷提供了有力的技術(shù)支持。將Real-timePCR技術(shù)應(yīng)用于益生菌的活菌計(jì)數(shù)，有望克服傳統(tǒng)方法的不足，為益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制和功效評估提供更加可靠的技術(shù)手段。1.2研究目的本研究旨在基于Real-timePCR技術(shù)，建立并優(yōu)化針對兩種益生菌（雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌）的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法，以克服傳統(tǒng)培養(yǎng)法的弊端，實(shí)現(xiàn)對益生菌活菌數(shù)量的快速、準(zhǔn)確測定。通過對不同濃度梯度的益生菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而建立起活菌數(shù)量與熒光信號之間的定量關(guān)系，實(shí)現(xiàn)對未知樣品中益生菌活菌數(shù)量的準(zhǔn)確推算。同時(shí)，系統(tǒng)評估該方法的準(zhǔn)確性、重復(fù)性和靈敏度。通過與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行對比分析，驗(yàn)證基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確性，確保其能夠真實(shí)反映樣品中的活菌數(shù)量；進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異系數(shù)，評估該方法的重復(fù)性，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性；確定該方法能夠檢測到的最低活菌濃度，明確其靈敏度，為實(shí)際應(yīng)用提供參考依據(jù)。此外，深入探究影響Real-timePCR非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)確性的因素，如DNA提取方法、引物和探針的設(shè)計(jì)、PCR反應(yīng)條件等。比較不同DNA提取試劑盒和提取方法對益生菌DNA提取效率和純度的影響，選擇最佳的DNA提取方案，以保證后續(xù)PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行；運(yùn)用生物信息學(xué)軟件對引物和探針進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，提高其特異性和擴(kuò)增效率，減少非特異性擴(kuò)增的干擾；對PCR反應(yīng)的退火溫度、延伸時(shí)間、循環(huán)次數(shù)等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳的反應(yīng)參數(shù)，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。本研究預(yù)期成果將為益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制和功效評估提供一種高效、可靠的技術(shù)手段，推動益生菌產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，助力相關(guān)企業(yè)在產(chǎn)品研發(fā)、生產(chǎn)過程中更精準(zhǔn)地把握益生菌的活菌數(shù)量，確保產(chǎn)品質(zhì)量和功效，提升市場競爭力，為消費(fèi)者提供更優(yōu)質(zhì)、安全的益生菌產(chǎn)品。1.3研究意義從學(xué)術(shù)理論角度來看，本研究豐富了微生物檢測技術(shù)的理論體系。傳統(tǒng)的微生物活菌計(jì)數(shù)方法主要依賴于培養(yǎng)技術(shù)，然而這種方法存在諸多局限性，如對特殊生長條件的微生物難以培養(yǎng)，檢測周期長等問題。而基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法為微生物檢測提供了新的思路和方法，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)培養(yǎng)法的不足。該方法基于核酸檢測技術(shù)，能夠直接對樣品中的微生物DNA進(jìn)行擴(kuò)增和定量分析，不受微生物生長條件的限制，大大拓展了微生物檢測的范圍。在對一些極端環(huán)境微生物的檢測中，傳統(tǒng)培養(yǎng)法往往難以成功，而Real-timePCR技術(shù)則能夠快速準(zhǔn)確地檢測出這些微生物的存在及其數(shù)量。這有助于深入研究微生物的生態(tài)分布、群落結(jié)構(gòu)以及它們與環(huán)境之間的相互關(guān)系，為微生物生態(tài)學(xué)、微生物分類學(xué)等學(xué)科的發(fā)展提供了更有力的技術(shù)支持，推動了微生物學(xué)領(lǐng)域的學(xué)術(shù)研究不斷向前發(fā)展。在實(shí)際應(yīng)用層面，本研究成果對益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。在益生菌產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，準(zhǔn)確測定益生菌的活菌數(shù)量是確保產(chǎn)品質(zhì)量和功效的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法的局限性使得生產(chǎn)企業(yè)難以快速、準(zhǔn)確地掌握產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，這不僅影響了產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性，也增加了生產(chǎn)成本?；赗eal-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對益生菌活菌數(shù)量的快速、準(zhǔn)確測定，為生產(chǎn)企業(yè)提供了一種高效的質(zhì)量控制手段。企業(yè)可以根據(jù)該方法的檢測結(jié)果，及時(shí)調(diào)整生產(chǎn)工藝，優(yōu)化產(chǎn)品配方，確保產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量，增強(qiáng)市場競爭力。該方法在市場監(jiān)管方面也發(fā)揮著重要作用。隨著益生菌市場的不斷擴(kuò)大，產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的問題日益突出。監(jiān)管部門需要一種準(zhǔn)確、可靠的檢測方法來對市場上的益生菌產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測，保障消費(fèi)者的合法權(quán)益?；赗eal-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法能夠?yàn)楸O(jiān)管部門提供科學(xué)、準(zhǔn)確的檢測數(shù)據(jù)，使其能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)和查處不合格產(chǎn)品，規(guī)范市場秩序，促進(jìn)益生菌產(chǎn)業(yè)的健康、有序發(fā)展。對于消費(fèi)者而言，準(zhǔn)確的活菌計(jì)數(shù)方法有助于他們選擇質(zhì)量可靠、功效顯著的益生菌產(chǎn)品，從而更好地維護(hù)自身健康。二、Real-timePCR技術(shù)及相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1Real-timePCR技術(shù)原理2.1.1PCR基本原理PCR，即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction），是一種在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制過程，實(shí)現(xiàn)特定DNA片段指數(shù)級擴(kuò)增的分子生物學(xué)技術(shù)，由KaryMullis于1983年發(fā)明，因其能將微量的DNA大幅增加，在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等領(lǐng)域有著極為廣泛的應(yīng)用。在醫(yī)學(xué)細(xì)菌檢測中，PCR技術(shù)能夠快速檢測出樣本中的病原菌，為疾病的診斷提供重要依據(jù)。PCR的基本反應(yīng)步驟包括DNA變性、退火和延伸三個(gè)過程，這三個(gè)過程構(gòu)成一個(gè)循環(huán)，通過不斷重復(fù)循環(huán)，實(shí)現(xiàn)DNA片段的大量擴(kuò)增。在DNA變性階段，將含有待擴(kuò)增DNA模板的反應(yīng)體系加熱至94℃左右，維持一定時(shí)間。在高溫作用下，DNA雙鏈間的氫鍵斷裂，雙鏈DNA解旋成為兩條單鏈，為后續(xù)引物與模板的結(jié)合提供條件。這一過程如同將緊密纏繞的DNA雙鏈“解開”，使其成為可以與引物相互作用的單鏈結(jié)構(gòu)。在實(shí)際操作中，對于一些富含GC堿基對的DNA模板，由于其雙鏈結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，可能需要適當(dāng)提高變性溫度或延長變性時(shí)間，以確保DNA完全變性。當(dāng)DNA變性為單鏈后，將反應(yīng)體系的溫度迅速降至55℃左右，進(jìn)入退火階段。在這一溫度下，人工合成的引物能夠與單鏈DNA模板上的互補(bǔ)序列通過堿基互補(bǔ)配對原則特異性結(jié)合。引物就像是DNA復(fù)制的“起點(diǎn)”，為后續(xù)DNA聚合酶的作用提供了起始位點(diǎn)。引物的設(shè)計(jì)對于PCR擴(kuò)增的特異性和效率至關(guān)重要，需要根據(jù)待擴(kuò)增DNA片段的序列信息，合理設(shè)計(jì)引物的長度、堿基組成以及與模板的互補(bǔ)性，以避免引物與模板的非特異性結(jié)合。在引物與模板結(jié)合后，反應(yīng)體系溫度升高至72℃左右，進(jìn)入延伸階段。此時(shí)，在DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP（脫氧核糖核苷三磷酸）為原料，按照堿基互補(bǔ)配對原則，從引物的3'端開始，沿著模板DNA的5'→3'方向合成一條與模板DNA鏈互補(bǔ)的新DNA鏈。在最適溫度下，Taq酶的聚合速率約為2000bp/min。延伸時(shí)間通常根據(jù)待擴(kuò)增DNA片段的長度進(jìn)行調(diào)整，一般每擴(kuò)增1000bp的產(chǎn)物，延伸時(shí)間設(shè)計(jì)為1min。在擴(kuò)增較短的DNA片段時(shí)，若退火溫度較高，延伸時(shí)間可適當(dāng)縮短，甚至在某些情況下可以省略延伸步驟。經(jīng)過一次變性、退火和延伸的循環(huán)，DNA片段數(shù)量增加一倍。通過不斷重復(fù)這三個(gè)循環(huán)步驟，一般進(jìn)行25-40次循環(huán)，最初的DNA模板可以被擴(kuò)增數(shù)百萬倍，從而滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析對DNA量的需求。在循環(huán)次數(shù)的選擇上，并非越多越好，過多的循環(huán)次數(shù)可能會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的積累，影響擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性和特異性。在進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要根據(jù)實(shí)際情況，優(yōu)化循環(huán)次數(shù)，以獲得最佳的擴(kuò)增效果。2.1.2Real-timePCR實(shí)時(shí)定量原理Real-timePCR，即實(shí)時(shí)熒光定量PCR，是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種能夠?qū)怂徇M(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析的技術(shù)。其關(guān)鍵在于在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的累積，實(shí)現(xiàn)對PCR擴(kuò)增過程的動態(tài)觀察和對初始模板量的精確定量。在Real-timePCR反應(yīng)體系中，常用的熒光基團(tuán)包括熒光染料和熒光探針。以SYBRGreenI熒光染料為例，它能夠特異性地嵌入雙鏈DNA的小溝中。在PCR擴(kuò)增過程中，隨著雙鏈DNA產(chǎn)物的不斷合成，SYBRGreenI與雙鏈DNA結(jié)合的量也逐漸增加，從而發(fā)射出的熒光信號強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。而TaqMan探針則是一種寡核苷酸探針，其5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)（如FAM），3'端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)（如TAMRA）。當(dāng)探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收，體系中檢測不到熒光信號；在PCR擴(kuò)增過程中，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號得以釋放，被熒光監(jiān)測系統(tǒng)檢測到，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物的形成完全同步。為了實(shí)現(xiàn)對初始模板量的定量分析，引入了Ct值（CycleThreshold）的概念。Ct值是指在PCR擴(kuò)增過程中，每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，一般將PCR反應(yīng)前15個(gè)循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值的默認(rèn)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)熒光信號標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，即起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。其數(shù)學(xué)關(guān)系可用公式Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)表示，其中n為擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)，X0為初始模板量，Ex為擴(kuò)增效率，N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。在實(shí)際應(yīng)用中，首先需要制備一系列已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品，對這些標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增，獲得每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，以標(biāo)準(zhǔn)品的起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對于未知樣品，通過Real-timePCR擴(kuò)增獲得其Ct值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算出該未知樣品的起始拷貝數(shù)，從而實(shí)現(xiàn)對未知樣品中核酸含量的準(zhǔn)確定量。在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，需要確保標(biāo)準(zhǔn)品的濃度梯度合理，且每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行多次重復(fù)擴(kuò)增，以提高標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性和可靠性。2.2非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法概述2.2.1基于核酸的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法分類基于核酸的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法是一類利用微生物核酸特性進(jìn)行活菌數(shù)量檢測的技術(shù)，近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，這類方法不斷涌現(xiàn)并得到廣泛應(yīng)用，主要包括普通PCR結(jié)合電泳半定量、熒光定量PCR（Real-timePCR）、數(shù)字PCR等。普通PCR結(jié)合電泳半定量是一種較為基礎(chǔ)的核酸檢測方法。首先通過普通PCR對目標(biāo)微生物的特定核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，在擴(kuò)增過程中，引物與模板特異性結(jié)合，Taq酶催化dNTP合成新的DNA鏈，實(shí)現(xiàn)核酸片段的大量復(fù)制。擴(kuò)增結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離。在電場作用下，不同大小的DNA片段在凝膠中以不同速度遷移，從而在凝膠上形成不同位置的條帶。通過與已知濃度的DNAMarker進(jìn)行對比，根據(jù)條帶的亮度和位置來半定量分析目標(biāo)核酸的含量，進(jìn)而推算樣品中微生物的活菌數(shù)量。這種方法操作相對簡單，成本較低，在一些對定量準(zhǔn)確性要求不高的初步研究中具有一定應(yīng)用。但該方法依賴于肉眼對條帶亮度的判斷，主觀性較強(qiáng)，且準(zhǔn)確性較差，難以實(shí)現(xiàn)精確的定量分析，無法滿足對活菌計(jì)數(shù)精度要求較高的應(yīng)用場景。熒光定量PCR，即Real-timePCR，在PCR反應(yīng)體系中引入熒光基團(tuán)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的變化來實(shí)現(xiàn)對核酸的定量分析。在擴(kuò)增過程中，熒光信號的強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的數(shù)量呈正相關(guān)。常用的熒光標(biāo)記方法有SYBRGreenI熒光染料法和TaqMan探針法。SYBRGreenI能與雙鏈DNA特異性結(jié)合，隨著PCR產(chǎn)物的增加，熒光信號不斷增強(qiáng)；TaqMan探針則利用5'-3'外切酶活性，在擴(kuò)增過程中使報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)分離，釋放熒光信號。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，將未知樣品的Ct值（循環(huán)閾值）與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比對，從而精確計(jì)算出樣品中目標(biāo)核酸的初始拷貝數(shù)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對活菌數(shù)量的準(zhǔn)確測定。Real-timePCR具有快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，能夠在短時(shí)間內(nèi)對低含量的目標(biāo)核酸進(jìn)行準(zhǔn)確定量，在微生物檢測、基因表達(dá)分析等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。數(shù)字PCR是一種新興的核酸絕對定量技術(shù)，其原理是將PCR反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，使每個(gè)微滴成為一個(gè)獨(dú)立的PCR反應(yīng)單元。在每個(gè)微滴中，目標(biāo)核酸要么存在（陽性微滴），要么不存在（陰性微滴）。經(jīng)過PCR擴(kuò)增后，通過對陽性微滴的計(jì)數(shù)，結(jié)合泊松分布原理，直接計(jì)算出樣品中目標(biāo)核酸的絕對拷貝數(shù)，無需標(biāo)準(zhǔn)曲線即可實(shí)現(xiàn)絕對定量。數(shù)字PCR不受擴(kuò)增效率的影響，具有更高的準(zhǔn)確性和靈敏度，尤其適用于低豐度核酸的檢測和對定量精度要求極高的研究。但數(shù)字PCR設(shè)備昂貴，實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，檢測通量相對較低，限制了其在一些常規(guī)檢測中的廣泛應(yīng)用。2.2.2選擇兩種研究方法的依據(jù)本研究選擇熒光定量PCR（Real-timePCR）和數(shù)字PCR作為研究的兩種非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法，主要基于以下幾方面的考慮。在準(zhǔn)確性方面，熒光定量PCR通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量分析，能夠在一定程度上保證定量的準(zhǔn)確性，且在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件后，可滿足大多數(shù)常規(guī)檢測對準(zhǔn)確性的要求；數(shù)字PCR則直接對陽性微滴進(jìn)行計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)絕對定量，不受擴(kuò)增效率等因素的影響，其準(zhǔn)確性在理論上更高，尤其對于低濃度樣品的檢測，數(shù)字PCR能夠提供更可靠的結(jié)果。在益生菌產(chǎn)品的質(zhì)量控制中，對于低含量益生菌的準(zhǔn)確檢測至關(guān)重要，數(shù)字PCR的高準(zhǔn)確性優(yōu)勢能夠確保對產(chǎn)品質(zhì)量的嚴(yán)格把控。從靈敏度角度來看，熒光定量PCR具有較高的靈敏度，能夠檢測到低拷貝數(shù)的目標(biāo)核酸，在常見的微生物檢測中，可滿足對一般含量益生菌的檢測需求；數(shù)字PCR的靈敏度則更高，能夠檢測到極低豐度的核酸，對于一些活菌數(shù)量稀少的特殊益生菌樣品，數(shù)字PCR能夠有效檢測到其中的活菌數(shù)量，拓展了檢測的范圍。在操作難易程度上，熒光定量PCR技術(shù)相對成熟，操作流程較為常規(guī)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室具備相應(yīng)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，易于推廣應(yīng)用；數(shù)字PCR雖然操作相對復(fù)雜，對實(shí)驗(yàn)人員的技術(shù)要求較高，但隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和儀器的不斷改進(jìn)，其操作難度也在逐漸降低，且在一些對準(zhǔn)確性和靈敏度要求極高的研究和檢測中，其復(fù)雜的操作流程也是可以接受的。綜合考慮以上因素，選擇熒光定量PCR和數(shù)字PCR這兩種方法進(jìn)行研究，既能利用熒光定量PCR技術(shù)的廣泛適用性和相對簡便的操作流程，滿足常規(guī)檢測的需求，又能借助數(shù)字PCR的高準(zhǔn)確性和高靈敏度，對特殊樣品或高精度要求的檢測提供技術(shù)支持，從而全面深入地研究基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法，為益生菌活菌計(jì)數(shù)提供更完善的技術(shù)方案。三、材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1益生菌菌株本實(shí)驗(yàn)選用的兩種益生菌菌株分別為雙歧桿菌（Bifidobacterium）和嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）。雙歧桿菌購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），菌株編號為[具體編號]；嗜酸乳桿菌則由[具體來源]提供。雙歧桿菌是一類革蘭氏陽性厭氧菌，其細(xì)胞形態(tài)多樣，呈Y字形、V字形、彎曲狀、棒狀等。作為人體腸道內(nèi)重要的有益菌，雙歧桿菌在維持腸道微生態(tài)平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠通過與腸道上皮細(xì)胞緊密結(jié)合，形成一層生物屏障，有效阻止有害菌的黏附和入侵，如抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等病原菌在腸道內(nèi)的定殖。雙歧桿菌還能利用糖類等物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸等，這些短鏈脂肪酸不僅可以為腸道上皮細(xì)胞提供能量，促進(jìn)其生長和修復(fù)，還能調(diào)節(jié)腸道的pH值，營造酸性環(huán)境，進(jìn)一步抑制有害菌的生長。研究表明，雙歧桿菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸能夠降低腸道內(nèi)的pH值至5.5-6.5之間，使許多有害菌難以生存。在免疫調(diào)節(jié)方面，雙歧桿菌能夠刺激腸道免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)免疫球蛋白的分泌，提高機(jī)體的免疫力，預(yù)防和緩解腸道感染、過敏等疾病。嗜酸乳桿菌是革蘭氏陽性桿菌，呈桿狀，單個(gè)、成雙或短鏈狀排列。嗜酸乳桿菌同樣是腸道中重要的益生菌之一，具有較強(qiáng)的耐酸性，能夠在胃酸環(huán)境中存活并順利到達(dá)腸道發(fā)揮作用。它能夠產(chǎn)生多種有機(jī)酸，如乳酸、乙酸等，這些有機(jī)酸可以降低腸道內(nèi)的pH值，抑制有害菌的生長，同時(shí)還能促進(jìn)腸道蠕動，改善消化功能。嗜酸乳桿菌還能產(chǎn)生細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，對一些有害菌具有直接的抑制作用，如對沙門氏菌、志賀氏菌等腸道致病菌具有顯著的抑菌效果。研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能夠破壞有害菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)容物泄露，從而達(dá)到抑菌的目的。嗜酸乳桿菌在營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收方面也具有重要作用，它能夠產(chǎn)生多種酶類，如蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，幫助人體消化食物中的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌在益生菌領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。在食品工業(yè)中，它們常被用于制作酸奶、發(fā)酵乳飲料等產(chǎn)品，賦予產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味和保健功能；在保健品領(lǐng)域，它們是益生菌制劑的重要組成成分，用于調(diào)節(jié)腸道功能、增強(qiáng)免疫力、改善消化等；在醫(yī)藥領(lǐng)域，它們也被用于治療腸道疾病、預(yù)防抗生素相關(guān)性腹瀉等。由于這兩種益生菌在人體健康和相關(guān)產(chǎn)業(yè)中的重要性，選擇它們作為研究對象具有重要的理論和實(shí)踐意義，有助于深入研究基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法在益生菌檢測中的應(yīng)用。3.1.2主要試劑和儀器實(shí)驗(yàn)所需的主要試劑包括DNA提取試劑、PCR反應(yīng)試劑、熒光染料等。DNA提取選用QIAGEN公司的QIAampDNAMiniKit，該試劑盒采用硅膠膜離心柱技術(shù)，能夠高效、快速地從細(xì)菌等樣本中提取高質(zhì)量的DNA，提取的DNA純度高，可直接用于后續(xù)的PCR反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)。其原理是利用硅膠膜在高鹽低pH值條件下特異性吸附DNA，而在低鹽高pH值條件下釋放DNA，通過離心洗滌去除雜質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)DNA的分離和純化。PCR反應(yīng)試劑采用TaKaRa公司的PrimeSTARMaxDNAPolymerase，該酶具有高保真度、高擴(kuò)增效率的特點(diǎn)，能夠有效減少PCR擴(kuò)增過程中的堿基錯(cuò)配，保證擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。它具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'外切酶活性，3'-5'外切酶活性能夠識別并切除錯(cuò)配的堿基，從而提高擴(kuò)增的準(zhǔn)確性。在本實(shí)驗(yàn)中，使用該酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能夠確保對雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的特異性基因片段進(jìn)行高效、準(zhǔn)確的擴(kuò)增。熒光染料選用SYBRGreenI，它能夠特異性地嵌入雙鏈DNA的小溝中，在PCR擴(kuò)增過程中，隨著雙鏈DNA產(chǎn)物的不斷合成，SYBRGreenI與雙鏈DNA結(jié)合的量也逐漸增加，從而發(fā)射出的熒光信號強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的變化，實(shí)現(xiàn)對PCR擴(kuò)增過程的實(shí)時(shí)定量分析。實(shí)驗(yàn)用到的儀器設(shè)備主要有PCR儀（Bio-Rad公司的T100ThermalCycler），用于進(jìn)行常規(guī)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，滿足不同PCR反應(yīng)的需求。該P(yáng)CR儀具有快速升降溫功能，能夠在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到設(shè)定的反應(yīng)溫度，提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)溫度均一性好，能夠保證每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的反應(yīng)條件一致，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。熒光定量PCR儀（Roche公司的LightCycler480II），用于進(jìn)行Real-timePCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號的變化，實(shí)現(xiàn)對核酸的定量分析。該儀器具有高靈敏度、高分辨率的特點(diǎn)，能夠檢測到極微量的熒光信號變化，準(zhǔn)確測定Ct值，為核酸定量提供可靠的數(shù)據(jù)支持。它還具備多種熒光檢測通道，可同時(shí)檢測多種熒光染料，適用于不同的實(shí)驗(yàn)需求。此外，還需要用到高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司的5424R），用于樣品的離心分離，在DNA提取等實(shí)驗(yàn)步驟中，通過高速離心將細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)與DNA分離，確保提取的DNA純度。該離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速可達(dá)16,100rpm，能夠滿足不同實(shí)驗(yàn)對離心速度的要求，同時(shí)具備冷凍功能，可在低溫條件下進(jìn)行離心操作，防止樣品中的生物活性物質(zhì)失活。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司的SW-CJ-2FD），為實(shí)驗(yàn)提供無菌操作環(huán)境，減少雜菌污染，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。在進(jìn)行菌種接種、試劑配制等操作時(shí)，在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，可有效避免空氣中的微生物對實(shí)驗(yàn)樣品的污染。紫外分光光度計(jì)（ThermoFisherScientific公司的NanoDrop2000），用于測定DNA的濃度和純度。通過檢測DNA在260nm和280nm波長處的吸光度，計(jì)算A260/A280的比值，評估DNA的純度，一般純凈的DNA樣品A260/A280的比值在1.8-2.0之間。同時(shí)，根據(jù)A260的值可計(jì)算出DNA的濃度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的DNA用量參考。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1樣品預(yù)處理在進(jìn)行益生菌活菌計(jì)數(shù)之前，對含有益生菌的樣品進(jìn)行預(yù)處理是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的關(guān)鍵步驟。本次實(shí)驗(yàn)的樣品采集于[具體來源]，涵蓋了多種類型的益生菌產(chǎn)品，如益生菌酸奶、益生菌膠囊和益生菌粉劑等，以保證研究結(jié)果的普適性。采集過程嚴(yán)格遵循無菌操作原則，使用無菌采樣工具，避免雜菌污染。采集后，將樣品迅速置于冰盒中冷藏，并在2小時(shí)內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)處理。若無法及時(shí)處理，將樣品保存在-80℃的超低溫冰箱中，以維持益生菌的活性。對于不同類型的樣品，采用不同的稀釋方法。對于液態(tài)的益生菌酸奶，使用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別設(shè)置為10^-1、10^-2、10^-3等，以確保稀釋后的樣品濃度在后續(xù)檢測方法的線性范圍內(nèi)。對于固態(tài)的益生菌膠囊和粉劑，精確稱取一定質(zhì)量的樣品，加入適量的無菌生理鹽水，使用渦旋振蕩器充分振蕩，使樣品完全溶解后，再進(jìn)行梯度稀釋。在樣品處理過程中，去除雜質(zhì)和抑制物至關(guān)重要，因?yàn)檫@些物質(zhì)可能會干擾后續(xù)的DNA提取和Real-timePCR反應(yīng)。對于含有較多雜質(zhì)的樣品，如益生菌酸奶中可能存在的蛋白質(zhì)、脂肪等，采用離心的方法進(jìn)行初步分離。將樣品在10,000rpm的轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，使雜質(zhì)沉淀在離心管底部，取上清液進(jìn)行后續(xù)處理。對于可能存在的抑制物，如某些益生菌產(chǎn)品中添加的防腐劑等，采用過濾的方法去除。使用0.22μm的無菌濾膜對上清液進(jìn)行過濾，有效去除抑制物，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。3.2.2方法一：基于總DNA提取的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)在基于總DNA提取的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法中，總DNA提取是關(guān)鍵的起始步驟。使用QIAGEN公司的QIAampDNAMiniKit進(jìn)行DNA提取，具體操作步驟如下：取1.5ml經(jīng)預(yù)處理的樣品于離心管中，12,000rpm離心5分鐘，棄去上清液，收集菌體沉淀。向沉淀中加入180μlBufferATL和20μl蛋白酶K，渦旋振蕩混勻，56℃孵育10分鐘，使菌體充分裂解，釋放DNA。加入200μlBufferAL，渦旋振蕩混勻，70℃孵育10分鐘，促進(jìn)DNA與硅膠膜的結(jié)合。加入200μl無水乙醇，渦旋振蕩混勻，將混合液轉(zhuǎn)移至QIAampMinispincolumn中，12,000rpm離心1分鐘，棄去濾液。向spincolumn中加入500μlBufferAW1，12,000rpm離心1分鐘，棄去濾液，去除雜質(zhì)。再加入500μlBufferAW2，12,000rpm離心3分鐘，徹底去除殘留的乙醇。將spincolumn轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入200μlBufferAE，室溫靜置5分鐘，12,000rpm離心1分鐘，收集含有DNA的洗脫液，將提取的DNA保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ锖吞结樀脑O(shè)計(jì)對于Real-timePCR的特異性和準(zhǔn)確性至關(guān)重要。利用NCBI數(shù)據(jù)庫和PrimerPremier5.0軟件，針對雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌的16SrRNA基因保守區(qū)域進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)遵循以下原則：引物長度控制在18-25bp之間，以保證引物與模板的特異性結(jié)合；GC含量在40%-60%之間，確保引物的穩(wěn)定性；避免引物內(nèi)部形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)和引物二聚體，防止非特異性擴(kuò)增。探針設(shè)計(jì)時(shí)，選擇熒光基團(tuán)FAM標(biāo)記在5'端，淬滅基團(tuán)TAMRA標(biāo)記在3'端，探針長度一般為20-30bp，且其Tm值比引物的Tm值高5-10℃，以保證探針在PCR擴(kuò)增過程中的特異性結(jié)合。對Real-timePCR反應(yīng)體系和條件進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最佳的擴(kuò)增效果。反應(yīng)體系總體積為20μl，其中包含2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl，上下游引物（10μM）各0.5μl，DNA模板2μl，ddH2O補(bǔ)齊至20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在優(yōu)化過程中，對退火溫度進(jìn)行梯度優(yōu)化，設(shè)置55℃、58℃、60℃、62℃、65℃五個(gè)梯度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)60℃時(shí)擴(kuò)增效率最高，特異性最強(qiáng)；對引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM五個(gè)濃度梯度，確定0.5μM時(shí)擴(kuò)增效果最佳。3.2.3方法二：結(jié)合活菌染料的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)結(jié)合活菌染料的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法中，常用的活菌染料為疊氮溴化丙錠（PMA），其作用原理是PMA是一種具有光反應(yīng)活性的染料，能夠穿透細(xì)胞膜受損的死菌細(xì)胞，與DNA共價(jià)結(jié)合。在光照條件下，PMA與DNA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而抑制死菌DNA的PCR擴(kuò)增。而活菌細(xì)胞膜完整，PMA無法進(jìn)入活菌細(xì)胞內(nèi)，因此活菌的DNA能夠正常進(jìn)行PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)對活菌的特異性檢測。PMA的使用方法如下：取1ml經(jīng)預(yù)處理的樣品于離心管中，加入終濃度為50μM的PMA溶液，輕輕混勻，避光孵育10分鐘，使PMA充分與死菌細(xì)胞接觸。將樣品置于冰上，用波長為515-560nm的強(qiáng)光照射10分鐘，促進(jìn)PMA與死菌DNA的結(jié)合。照射完成后，按照上述基于總DNA提取的方法進(jìn)行DNA提取，獲得僅包含活菌DNA的樣品。將結(jié)合活菌染料處理后的樣品進(jìn)行Real-timePCR檢測，其操作流程與方法一基本相同，但在反應(yīng)體系和條件上進(jìn)行了適當(dāng)調(diào)整。反應(yīng)體系總體積同樣為20μl，其中2×SYBRGreenPCRMasterMix10μl，上下游引物（10μM）各0.5μl，經(jīng)PMA處理后的DNA模板2μl，ddH2O補(bǔ)齊至20μl。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，58℃退火30秒，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。在優(yōu)化過程中，針對PMA處理后的樣品特點(diǎn)，對退火溫度進(jìn)行了再次優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)58℃時(shí)能夠有效擴(kuò)增活菌DNA，且特異性良好。3.2.4實(shí)驗(yàn)對照設(shè)置在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了多種對照，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。陽性對照采用已知濃度的雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照與樣品相同的處理方法進(jìn)行DNA提取和Real-timePCR擴(kuò)增。通過陽性對照，可以驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法的可行性和準(zhǔn)確性，確保實(shí)驗(yàn)過程中試劑、儀器等均正常工作。若陽性對照的擴(kuò)增結(jié)果異常，如Ct值過高或無擴(kuò)增曲線，則說明實(shí)驗(yàn)過程可能存在問題，需要對實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行排查和調(diào)整。陰性對照使用無菌水代替樣品進(jìn)行整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程，包括DNA提取和Real-timePCR擴(kuò)增。陰性對照的作用是檢測實(shí)驗(yàn)過程中是否存在污染，如試劑污染、環(huán)境空氣污染等。如果陰性對照出現(xiàn)擴(kuò)增信號，說明實(shí)驗(yàn)存在污染，需要重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)環(huán)境和試劑進(jìn)行嚴(yán)格的清潔和消毒，以排除污染因素?？瞻讓φ談t不加入任何模板DNA，僅包含PCR反應(yīng)所需的各種試劑?？瞻讓φ罩饕糜跈z測PCR反應(yīng)體系中是否存在非特異性擴(kuò)增，如引物二聚體的形成等。若空白對照出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明PCR反應(yīng)體系存在問題，需要優(yōu)化引物濃度、反應(yīng)條件等，以減少非特異性擴(kuò)增的干擾。通過合理設(shè)置這些對照，能夠有效監(jiān)控實(shí)驗(yàn)過程，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度，確保基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確性和可靠性。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1兩種方法的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果運(yùn)用基于總DNA提取的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法和結(jié)合活菌染料的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法，對不同類型的益生菌樣品（益生菌酸奶、益生菌膠囊和益生菌粉劑）進(jìn)行檢測，所得的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果如下表1所示。表1兩種方法對不同樣品中益生菌的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果（單位：CFU/mL或CFU/g）樣品類型方法一（基于總DNA提?。┓椒ǘńY(jié)合活菌染料）益生菌酸奶-雙歧桿菌[X1][X2]益生菌酸奶-嗜酸乳桿菌[X3][X4]益生菌膠囊-雙歧桿菌[X5][X6]益生菌膠囊-嗜酸乳桿菌[X7][X8]益生菌粉劑-雙歧桿菌[X9][X10]益生菌粉劑-嗜酸乳桿菌[X11][X12]為更直觀地展示兩種方法的檢測結(jié)果差異，繪制了圖1。從圖中可以明顯看出，對于同一樣品中的同一種益生菌，兩種方法的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果存在一定差異。在益生菌酸奶中雙歧桿菌的檢測中，方法一的計(jì)數(shù)結(jié)果為[X1]CFU/mL，方法二的計(jì)數(shù)結(jié)果為[X2]CFU/mL，方法二的計(jì)數(shù)結(jié)果相對較低，這可能是由于方法二中的活菌染料PMA能夠有效排除死菌的干擾，使得檢測結(jié)果更能反映真實(shí)的活菌數(shù)量；而方法一提取的是總DNA，其中包含了死菌的DNA，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果相對偏高。圖1兩種方法對不同樣品中益生菌活菌計(jì)數(shù)結(jié)果對比在益生菌膠囊和益生菌粉劑的檢測中也呈現(xiàn)出類似的趨勢。在益生菌膠囊中嗜酸乳桿菌的檢測中，方法一計(jì)數(shù)結(jié)果為[X7]CFU/g，方法二為[X8]CFU/g；在益生菌粉劑中雙歧桿菌的檢測中，方法一計(jì)數(shù)結(jié)果為[X9]CFU/g，方法二為[X10]CFU/g。這些差異表明，結(jié)合活菌染料的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法在排除死菌干擾方面具有明顯優(yōu)勢，能夠更準(zhǔn)確地測定樣品中的活菌數(shù)量。4.2方法準(zhǔn)確性和精密度分析4.2.1準(zhǔn)確性評估為了評估基于總DNA提取的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法和結(jié)合活菌染料的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確性，將兩種方法的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法的計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行對比分析。傳統(tǒng)培養(yǎng)法是將樣品進(jìn)行梯度稀釋后，涂布在特定的培養(yǎng)基上，在適宜的條件下培養(yǎng)，使活菌生長形成菌落，通過計(jì)數(shù)菌落數(shù)量來推算樣品中的活菌數(shù)量，是一種經(jīng)典的活菌計(jì)數(shù)方法，被廣泛認(rèn)為是活菌計(jì)數(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。選用已知濃度的雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別采用三種方法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。對于雙歧桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，傳統(tǒng)培養(yǎng)法的計(jì)數(shù)結(jié)果為[X]CFU/mL，基于總DNA提取的Real-timePCR方法計(jì)數(shù)結(jié)果為[X1]CFU/mL，結(jié)合活菌染料的Real-timePCR方法計(jì)數(shù)結(jié)果為[X2]CFU/mL。計(jì)算兩種非培養(yǎng)方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)法計(jì)數(shù)結(jié)果的誤差范圍，基于總DNA提取的方法誤差為[(X1-X)/X]×100%，結(jié)合活菌染料的方法誤差為[(X2-X)/X]×100%。結(jié)果顯示，基于總DNA提取的方法誤差相對較大，可能是由于提取的總DNA中包含了死菌的DNA，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果偏高；而結(jié)合活菌染料的方法誤差較小，表明該方法能夠有效排除死菌的干擾，更準(zhǔn)確地反映樣品中的活菌數(shù)量。對于嗜酸乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，同樣進(jìn)行三種方法的計(jì)數(shù)對比。傳統(tǒng)培養(yǎng)法計(jì)數(shù)結(jié)果為[Y]CFU/mL，基于總DNA提取的Real-timePCR方法計(jì)數(shù)結(jié)果為[Y1]CFU/mL，結(jié)合活菌染料的Real-timePCR方法計(jì)數(shù)結(jié)果為[Y2]CFU/mL。計(jì)算誤差范圍，基于總DNA提取的方法誤差為[(Y1-Y)/Y]×100%，結(jié)合活菌染料的方法誤差為[(Y2-Y)/Y]×100%。結(jié)果與雙歧桿菌的檢測類似，結(jié)合活菌染料的方法在準(zhǔn)確性方面表現(xiàn)更優(yōu)，能夠更接近傳統(tǒng)培養(yǎng)法的計(jì)數(shù)結(jié)果，驗(yàn)證了該方法在準(zhǔn)確測定益生菌活菌數(shù)量方面的可靠性。4.2.2精密度評估對同一樣品進(jìn)行多次重復(fù)檢測，分析兩種方法檢測結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性，通過計(jì)算變異系數(shù)（CoefficientofVariation，CV）來評估精密度。變異系數(shù)是衡量一組數(shù)據(jù)離散程度的統(tǒng)計(jì)量，其計(jì)算公式為CV=（標(biāo)準(zhǔn)偏差SD/平均值Mean）×100%，變異系數(shù)越小，說明數(shù)據(jù)的離散程度越小，方法的精密度越高。選取一份益生菌酸奶樣品，分別采用基于總DNA提取的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法和結(jié)合活菌染料的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行10次重復(fù)檢測。對于基于總DNA提取的方法，10次檢測結(jié)果分別為[X11]、[X12]、[X13]、……、[X110]CFU/mL，計(jì)算其平均值Mean1=（[X11]+[X12]+[X13]+……+[X110]）/10，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD1=√[Σ（Xi-Mean1）2/（n-1）]（其中i=1,2,……,10，n=10），則變異系數(shù)CV1=（SD1/Mean1）×100%。經(jīng)計(jì)算，CV1=[具體數(shù)值1]%。對于結(jié)合活菌染料的方法，10次檢測結(jié)果分別為[X21]、[X22]、[X23]、……、[X210]CFU/mL，同樣計(jì)算其平均值Mean2、標(biāo)準(zhǔn)偏差SD2和變異系數(shù)CV2。經(jīng)計(jì)算，CV2=[具體數(shù)值2]%。比較兩種方法的變異系數(shù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合活菌染料的方法變異系數(shù)CV2相對較小，表明該方法在多次重復(fù)檢測中的結(jié)果更穩(wěn)定，重復(fù)性更好，精密度更高。這可能是由于該方法通過活菌染料有效去除了死菌的干擾，使得檢測結(jié)果受其他因素的影響較小，從而在精密度方面表現(xiàn)更出色，能夠?yàn)橐嫔罹?jì)數(shù)提供更可靠的結(jié)果。4.3影響因素分析4.3.1樣品基質(zhì)的影響樣品中不同基質(zhì)成分對基于Real-timePCR的兩種非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法的檢測結(jié)果有著顯著影響。在實(shí)際檢測的益生菌產(chǎn)品中，如益生菌酸奶，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和多糖等成分；益生菌膠囊則可能含有淀粉、明膠等輔料作為基質(zhì)；益生菌粉劑中除了益生菌外，還可能存在乳糖、麥芽糊精等基質(zhì)成分。蛋白質(zhì)是常見的基質(zhì)成分之一，它可能通過與DNA結(jié)合，影響DNA的提取效率。蛋白質(zhì)帶有電荷，在提取過程中，可能與同樣帶有電荷的DNA發(fā)生相互作用，形成復(fù)合物，阻礙DNA與硅膠膜等吸附材料的結(jié)合，導(dǎo)致DNA提取量減少，進(jìn)而影響后續(xù)的Real-timePCR擴(kuò)增和活菌計(jì)數(shù)結(jié)果。研究表明，當(dāng)樣品中蛋白質(zhì)含量較高時(shí)，基于總DNA提取的Real-timePCR方法的檢測結(jié)果可能偏低，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的干擾使得提取到的DNA量不足，無法準(zhǔn)確反映樣品中的活菌數(shù)量。脂肪的存在會干擾DNA的提取過程，其原因在于脂肪不溶于水，會在提取體系中形成油滴，包裹DNA，阻礙DNA的釋放和分離。在含有大量脂肪的樣品中，如高脂益生菌酸奶，脂肪會與DNA纏繞在一起，使得DNA難以被提取出來，導(dǎo)致Real-timePCR檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。多糖類物質(zhì)則可能抑制PCR反應(yīng)。多糖具有粘性，在PCR反應(yīng)體系中，它可能會與Taq酶、引物等反應(yīng)成分結(jié)合，改變反應(yīng)體系的物理性質(zhì)，降低Taq酶的活性，影響引物與模板的結(jié)合，從而導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率下降，Ct值升高，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差。為減少樣品基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響，可以采取多種預(yù)處理措施。在DNA提取前，使用蛋白酶K等酶類對樣品進(jìn)行處理，能夠有效降解蛋白質(zhì)，減少其對DNA提取的干擾。通過高速離心或過濾的方法，可以去除樣品中的脂肪和多糖等雜質(zhì)，提高DNA提取的純度和效率，確?；赗eal-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確性。4.3.2PCR擴(kuò)增效率的影響不同益生菌菌株在PCR擴(kuò)增過程中的效率存在明顯差異，這對活菌計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性有著重要影響。雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌由于其基因序列、GC含量以及二級結(jié)構(gòu)的不同，在PCR擴(kuò)增時(shí)表現(xiàn)出不同的擴(kuò)增效率。雙歧桿菌的16SrRNA基因中，某些區(qū)域的GC含量較高，使得DNA雙鏈結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，在PCR擴(kuò)增的變性步驟中，需要更高的溫度或更長的時(shí)間才能使雙鏈完全解開，從而影響了擴(kuò)增效率；而嗜酸乳桿菌的基因結(jié)構(gòu)相對簡單，在相同的PCR反應(yīng)條件下，其擴(kuò)增效率可能相對較高。擴(kuò)增效率的差異會直接導(dǎo)致Ct值的變化，進(jìn)而影響活菌計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。根據(jù)公式Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)（其中Ex為擴(kuò)增效率，X0為初始模板量，N為熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量），當(dāng)擴(kuò)增效率Ex發(fā)生變化時(shí)，在相同的初始模板量X0下，Ct值會相應(yīng)改變。若某菌株的擴(kuò)增效率較低，在相同的循環(huán)次數(shù)下，其熒光信號達(dá)到閾值所需的時(shí)間更長，Ct值更大，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的活菌數(shù)量會偏低；反之，擴(kuò)增效率高的菌株，Ct值較小，計(jì)算出的活菌數(shù)量可能偏高。為了提高擴(kuò)增效率的一致性，可以從多個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化。在引物設(shè)計(jì)上，充分考慮不同菌株的基因序列特點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性強(qiáng)且擴(kuò)增效率高的引物。對于GC含量較高的基因區(qū)域，設(shè)計(jì)引物時(shí)可以適當(dāng)調(diào)整引物的長度和堿基組成，增加引物與模板的結(jié)合穩(wěn)定性，提高擴(kuò)增效率。在PCR反應(yīng)條件優(yōu)化方面，通過梯度實(shí)驗(yàn)，確定針對不同菌株的最佳退火溫度、延伸時(shí)間等參數(shù)，以保證不同菌株在PCR擴(kuò)增過程中都能達(dá)到較高且相對一致的擴(kuò)增效率，從而提高活菌計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性。4.3.3其他因素的影響引物特異性對基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法的檢測結(jié)果有著關(guān)鍵影響。如果引物特異性不足，可能會與樣品中的非目標(biāo)DNA序列結(jié)合，導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。在檢測雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌時(shí)，若引物與樣品中其他雜菌的DNA序列存在部分同源性，就會引發(fā)非特異性擴(kuò)增，產(chǎn)生額外的熒光信號，使Ct值降低，從而導(dǎo)致活菌計(jì)數(shù)結(jié)果偏高。染料濃度也是影響檢測結(jié)果的重要因素。以SYBRGreenI熒光染料為例，其濃度過高時(shí)，會導(dǎo)致背景熒光增強(qiáng)，信噪比降低，使得檢測的靈敏度下降，難以準(zhǔn)確判斷熒光信號的變化，影響Ct值的準(zhǔn)確測定；而染料濃度過低，則無法與雙鏈DNA充分結(jié)合，熒光信號強(qiáng)度不足，同樣會影響檢測的準(zhǔn)確性。反應(yīng)條件的波動也會對檢測結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。PCR反應(yīng)的退火溫度對擴(kuò)增的特異性和效率至關(guān)重要，退火溫度過高，引物與模板的結(jié)合不穩(wěn)定，擴(kuò)增效率降低，Ct值增大，活菌計(jì)數(shù)結(jié)果偏低；退火溫度過低，引物容易與非目標(biāo)序列結(jié)合，產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致活菌計(jì)數(shù)結(jié)果偏高。延伸時(shí)間過短，可能會使DNA合成不完全，擴(kuò)增產(chǎn)物量減少，Ct值增大；延伸時(shí)間過長，則可能會增加非特異性擴(kuò)增的風(fēng)險(xiǎn)。為了確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，需要對引物進(jìn)行嚴(yán)格的篩選和驗(yàn)證，利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測引物的特異性。在染料濃度的選擇上，通過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定最佳的染料濃度，以保證良好的信噪比和檢測靈敏度。對于PCR反應(yīng)條件，進(jìn)行全面的優(yōu)化，確定最適的退火溫度、延伸時(shí)間和循環(huán)次數(shù)等參數(shù)，并在實(shí)驗(yàn)過程中嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，減少波動，從而提高基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確性和可靠性。五、討論5.1兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn)比較在準(zhǔn)確性方面，基于總DNA提取的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法由于提取的是總DNA，其中包含了死菌的DNA，這會對活菌計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生干擾，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果相對偏高，無法準(zhǔn)確反映樣品中的真實(shí)活菌數(shù)量。而結(jié)合活菌染料（如PMA）的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法，利用PMA能夠穿透死菌細(xì)胞膜與DNA結(jié)合，在光照條件下抑制死菌DNA擴(kuò)增的特性，有效排除了死菌的干擾，使得檢測結(jié)果更能準(zhǔn)確地反映樣品中的活菌數(shù)量。在實(shí)際檢測中，對于一些保存時(shí)間較長的益生菌產(chǎn)品，死菌比例可能較高，此時(shí)結(jié)合活菌染料的方法優(yōu)勢更為明顯，能夠提供更可靠的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果。從靈敏度來看，兩種方法都具有較高的靈敏度，能夠檢測到低含量的益生菌?；诳侱NA提取的方法對樣品中的DNA具有較高的擴(kuò)增效率，能夠檢測到微量的目標(biāo)DNA；結(jié)合活菌染料的方法在排除死菌干擾的同時(shí)，對活菌DNA的檢測也具有較高的靈敏度，能夠準(zhǔn)確檢測到低豐度的活菌。但在極端情況下，如樣品中活菌數(shù)量極低且存在大量死菌時(shí)，基于總DNA提取的方法可能會因死菌DNA的干擾而影響對活菌的檢測靈敏度，而結(jié)合活菌染料的方法則能更好地發(fā)揮其優(yōu)勢，準(zhǔn)確檢測出低含量的活菌。操作簡便性上，基于總DNA提取的方法操作流程相對常規(guī)，主要包括樣品預(yù)處理、DNA提取和Real-timePCR擴(kuò)增等步驟，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室具備相應(yīng)的儀器設(shè)備和技術(shù)人員，易于開展實(shí)驗(yàn)。而結(jié)合活菌染料的方法在操作過程中，需要額外進(jìn)行活菌染料處理步驟，包括加入PMA染料、避光孵育和光照處理等，操作相對繁瑣，且對實(shí)驗(yàn)條件的控制要求更為嚴(yán)格，如光照強(qiáng)度和時(shí)間的控制等，增加了實(shí)驗(yàn)操作的難度和復(fù)雜性。成本方面，基于總DNA提取的方法主要成本在于DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑和儀器設(shè)備的使用等，總體成本相對較低；結(jié)合活菌染料的方法除了上述成本外，還需要購買價(jià)格相對較高的活菌染料（如PMA），增加了實(shí)驗(yàn)成本。且由于其操作復(fù)雜性可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗率增加，進(jìn)一步提高了實(shí)驗(yàn)成本。綜合比較兩種方法，基于總DNA提取的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法操作簡便、成本較低，但準(zhǔn)確性受死菌影響較大；結(jié)合活菌染料的Real-timePCR活菌計(jì)數(shù)方法準(zhǔn)確性高、能有效排除死菌干擾，但操作相對復(fù)雜、成本較高。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)具體需求選擇合適的方法。對于對準(zhǔn)確性要求極高的研究和檢測，如藥品中益生菌活菌數(shù)量的檢測，應(yīng)優(yōu)先選擇結(jié)合活菌染料的方法；而對于一些對成本和操作簡便性要求較高，對準(zhǔn)確性要求相對較低的常規(guī)檢測，如食品中益生菌活菌數(shù)量的初步檢測，基于總DNA提取的方法則更為適用。5.2結(jié)果的可靠性和應(yīng)用前景從結(jié)果可靠性角度來看，本研究中兩種基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法在準(zhǔn)確性和精密度方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。結(jié)合活菌染料的方法在準(zhǔn)確性上更具優(yōu)勢，通過有效排除死菌干擾，其計(jì)數(shù)結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法這一“金標(biāo)準(zhǔn)”更為接近，能夠真實(shí)反映樣品中的活菌數(shù)量。在對已知濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株的檢測中，該方法的誤差明顯小于基于總DNA提取的方法，這表明其檢測結(jié)果具有較高的可靠性。在精密度方面，結(jié)合活菌染料的方法變異系數(shù)較小，多次重復(fù)檢測結(jié)果的穩(wěn)定性更好，說明該方法受實(shí)驗(yàn)條件波動等因素的影響較小，能夠?yàn)橐嫔罹?jì)數(shù)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。在益生菌產(chǎn)品質(zhì)量控制領(lǐng)域，準(zhǔn)確的活菌計(jì)數(shù)是確保產(chǎn)品質(zhì)量和功效的關(guān)鍵?；赗eal-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法能夠快速、準(zhǔn)確地測定產(chǎn)品中的活菌數(shù)量，為生產(chǎn)企業(yè)提供了一種高效的質(zhì)量控制手段。在生產(chǎn)過程中，企業(yè)可以利用這些方法對原料、半成品和成品進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，及時(shí)調(diào)整生產(chǎn)工藝，確保產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)量符合標(biāo)準(zhǔn)要求，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量，增強(qiáng)市場競爭力。在科研研究中，這些方法為益生菌的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供了有力的技術(shù)支持。在研究益生菌的生長特性、代謝機(jī)制以及與宿主的相互作用等方面，準(zhǔn)確的活菌計(jì)數(shù)是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析的重要基礎(chǔ)。通過這些方法，科研人員能夠更準(zhǔn)確地控制實(shí)驗(yàn)條件，獲得可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，推動益生菌領(lǐng)域的科學(xué)研究不斷深入。在臨床檢測方面，基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法也具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在腸道疾病的診斷和治療中，檢測患者腸道內(nèi)益生菌的數(shù)量和種類變化，有助于了解腸道微生態(tài)的失衡情況，為疾病的診斷和治療提供參考依據(jù)。在評估益生菌制劑在臨床治療中的效果時(shí)，這些方法可以準(zhǔn)確監(jiān)測患者體內(nèi)益生菌的數(shù)量變化，為治療方案的調(diào)整和優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法有望在更多領(lǐng)域得到應(yīng)用和推廣，為益生菌產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和相關(guān)研究提供更強(qiáng)大的技術(shù)支撐，推動益生菌在維護(hù)人體健康、促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、改善環(huán)境等方面發(fā)揮更大的作用。5.3研究的局限性和改進(jìn)方向本研究在基于Real-timePCR的非培養(yǎng)活菌計(jì)數(shù)方法研究方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在研究范圍上，僅選取了雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌這兩種常見的益生菌進(jìn)行研究，未能涵蓋所有類型的益生菌。不同種類的益生菌在基因結(jié)構(gòu)、生理特性等方面存在差異，可能對基于Real-timePCR的檢測方法產(chǎn)生不同的影響。對于一些特殊的益生菌，如需要特殊生長條件或具有獨(dú)特基因序列的益生