基于PTEN信號(hào)通路研究丹酚酸A對(duì)肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及分子機(jī)制一、研究背景肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率極高的惡性腫瘤。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程在肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等方面起著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。PTEN信號(hào)通路是重要的抑癌通路，其功能異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PTEN通過負(fù)向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）等下游信號(hào)，影響細(xì)胞的增殖、存活、遷移等過程。已有研究表明，PTEN信號(hào)通路的失活與肺癌EMT的促進(jìn)相關(guān)。丹酚酸A是中藥丹參的主要水溶性成分之一，具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤等。然而，丹酚酸A對(duì)肺癌EMT的影響及是否通過PTEN信號(hào)通路發(fā)揮作用尚不清楚。深入探究丹酚酸A對(duì)肺癌EMT的作用及分子機(jī)制，有望為肺癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略。二、研究目的明確丹酚酸A對(duì)肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。探究丹酚酸A影響肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是否通過PTEN信號(hào)通路介導(dǎo)。為肺癌的治療提供基于丹酚酸A靶向干預(yù)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。三、研究方法（一）細(xì)胞培養(yǎng)選取人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。（二）藥物處理將丹酚酸A用DMSO溶解并配制成不同濃度（0μM、10μM、20μM、40μM）的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺癌細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的丹酚酸A處理24h、48h和72h。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組（僅加入等體積的DMSO）。（三）細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察在光學(xué)顯微鏡下觀察不同處理組肺癌細(xì)胞的形態(tài)變化，比較對(duì)照組和丹酚酸A處理組細(xì)胞形態(tài)的差異，記錄上皮樣細(xì)胞和間質(zhì)樣細(xì)胞的比例。（四）蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）檢測(cè)EMT相關(guān)蛋白及PTEN信號(hào)通路蛋白表達(dá)提取不同處理組肺癌細(xì)胞的總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行SDS電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，加入一抗（包括上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、PTEN、PI3K、Akt以及磷酸化的Akt（p-Akt）等），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗膜，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h。用化學(xué)發(fā)光底物顯色，曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。（五）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)EMT相關(guān)基因及PTEN信號(hào)通路相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平提取不同處理組肺癌細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列如下：E-cadherin：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；N-cadherin：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Vimentin：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；PTEN：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；PI3K：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Akt：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。（六）PTEN基因沉默實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PTEN基因的小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞。將細(xì)胞分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA）、siRNA-PTEN組（轉(zhuǎn)染PTENsiRNA）、丹酚酸A組（加入20μM丹酚酸A處理）、丹酚酸A+siRNA-PTEN組（轉(zhuǎn)染PTENsiRNA后加入20μM丹酚酸A處理）。轉(zhuǎn)染48h后，采用Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)PTEN的沉默效率，以及EMT相關(guān)蛋白和PTEN信號(hào)通路蛋白的表達(dá)變化。（七）細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。Transwell小室的上室鋪Matrigel膠模擬細(xì)胞外基質(zhì)，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。將不同處理組的肺癌細(xì)胞接種于上室，培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽擦去上室未侵襲的細(xì)胞，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量，比較不同組細(xì)胞的侵襲能力。（八）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。四、預(yù)期結(jié)果細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果：對(duì)照組肺癌細(xì)胞呈典型的上皮樣形態(tài)，丹酚酸A處理組細(xì)胞隨著藥物濃度增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸由上皮樣形態(tài)向間質(zhì)樣形態(tài)轉(zhuǎn)變減少，細(xì)胞間連接更加緊密，呈現(xiàn)出上皮樣細(xì)胞增多的趨勢(shì)。Westernblot和qRT-PCR結(jié)果：與對(duì)照組相比，丹酚酸A處理組肺癌細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-cadherin的蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的蛋白和mRNA表達(dá)水平降低，且呈濃度和時(shí)間依賴性。同時(shí)，丹酚酸A處理組PTEN蛋白和mRNA表達(dá)水平升高，PI3K、Akt以及p-Akt的蛋白表達(dá)水平降低。PTEN基因沉默實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組相比，siRNA-PTEN組PTEN的蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著降低，EMT相關(guān)蛋白E-cadherin表達(dá)降低，N-cadherin和Vimentin表達(dá)升高，PI3K、Akt以及p-Akt表達(dá)升高。丹酚酸A+siRNA-PTEN組中，丹酚酸A對(duì)EMT相關(guān)蛋白和PTEN信號(hào)通路蛋白的調(diào)節(jié)作用被部分逆轉(zhuǎn)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與對(duì)照組相比，丹酚酸A處理組肺癌細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯減少。而在丹酚酸A+siRNA-PTEN組中，細(xì)胞侵襲能力較丹酚酸A組有所增強(qiáng)。五、討論本研究結(jié)果表明，丹酚酸A能夠抑制肺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞形態(tài)向上皮樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變，同時(shí)上調(diào)上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸A可能通過激活PTEN信號(hào)通路，抑制PI3K/Akt的活性，從而發(fā)揮對(duì)肺癌EMT的抑制作用。PTEN基因沉默實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，PTEN在丹酚酸A調(diào)控肺癌EMT過程中發(fā)揮重要作用。丹酚酸A對(duì)肺癌EMT的抑制作用可能為肺癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)。然而，本研究?jī)H在細(xì)胞水平進(jìn)行，后續(xù)還需開展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證丹酚酸A在體內(nèi)對(duì)肺癌EMT的影響及分子機(jī)制。此外，丹酚酸A與PTEN信號(hào)通路之間是否存在其他調(diào)控環(huán)節(jié)，以及丹酚酸A在肺癌治療中的最