基于NMR技術(shù)解析減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響1.緒論1.1研究背景與意義在微生物與寄生蟲領(lǐng)域，減毒鼠傷寒沙門氏菌和日本血吸蟲均備受關(guān)注。鼠傷寒沙門氏菌是一種常見的革蘭氏陰性桿菌，宿主范圍廣泛，能引發(fā)人類和動物的多種疾病，如傷寒病、急性胃腸炎等，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全。其傳播途徑主要是攝入被污染的食物和水，在醫(yī)院等環(huán)境中也容易引發(fā)感染。而日本血吸蟲是一種重要的寄生蟲，寄生于人體門靜脈系統(tǒng)，可導致日本血吸蟲病。這種疾病在亞洲多個國家，如中國、日本、菲律賓和印度尼西亞等地流行，給當?shù)鼐用竦慕】祹順O大危害。日本血吸蟲病的傳播依賴含有血吸蟲卵的糞便污染水源、水體中有釘螺存在以及人群接觸疫水等條件。近年來，隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)減毒鼠傷寒沙門氏菌與日本血吸蟲之間存在著一些意想不到的聯(lián)系。已有研究表明，減毒鼠傷寒沙門氏菌感染宿主后，可對體內(nèi)日本血吸蟲成蟲的發(fā)育和繁殖產(chǎn)生抑制作用。同時，感染減毒鼠傷寒沙門氏菌后的腸道環(huán)境也會對日本血吸蟲蟲卵的發(fā)育產(chǎn)生影響。這種微生物之間的相互作用為疾病防治和微生物關(guān)系研究開辟了新方向。代謝組學作為一門研究生物體代謝產(chǎn)物變化的學科，能夠全面反映生物體在生理、病理狀態(tài)下的代謝變化。核磁共振（NMR）技術(shù)是代謝組學研究中的重要工具之一，具有無損、快速、可同時檢測多種代謝物等優(yōu)點，能為深入了解生物體內(nèi)的代謝過程提供詳細信息。本研究運用NMR技術(shù)探究減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。從理論層面看，這有助于深入了解兩種微生物在宿主體內(nèi)的相互作用機制，拓展對微生物與寄生蟲共感染現(xiàn)象的認知，豐富微生物學和寄生蟲學的理論知識。在現(xiàn)實應用中，研究結(jié)果可為血吸蟲病等相關(guān)疾病的防治提供新的策略和思路。若能明確減毒鼠傷寒沙門氏菌影響日本血吸蟲感染的代謝機制，或許能開發(fā)出基于微生物相互作用的新型防治方法，為全球血吸蟲病防控工作提供有力支持。1.2減毒鼠傷寒沙門氏菌研究概況1.2.1生物學特性鼠傷寒沙門氏菌屬于沙門氏菌屬，是革蘭氏陰性桿菌。其形態(tài)呈直桿狀，大小通常為(0.7-1.5)μm×(2-5)μm。該菌周身具有鞭毛，能進行活潑的運動，這為其在宿主體內(nèi)的遷移和感染提供了便利。在結(jié)構(gòu)上，鼠傷寒沙門氏菌具備典型的革蘭氏陰性菌結(jié)構(gòu)特征，細胞壁由肽聚糖層和外膜組成，外膜中含有脂多糖（LPS），LPS不僅是其重要的結(jié)構(gòu)成分，還在細菌的致病性和免疫原性方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在生長特性方面，鼠傷寒沙門氏菌營養(yǎng)要求不苛刻，在普通培養(yǎng)基上就能良好生長。在有氧和無氧環(huán)境下均能生存，屬于兼性厭氧菌。其生長溫度范圍較廣，最適生長溫度為37℃，與人體體溫相近，這使得它在人體腸道內(nèi)能夠快速繁殖。在適宜條件下，鼠傷寒沙門氏菌的繁殖速度極快，短時間內(nèi)就能大量增殖，從而引發(fā)感染癥狀。在SS平板上，它會形成中等大小、無色或中央黑色、邊緣無色半透明的S型菌落，這種菌落特征有助于在實驗室中對其進行初步鑒別。1.2.2減毒方法和相關(guān)機制沙門氏菌的減毒技術(shù)手段多樣，主要包括基因敲除、化學誘變、溫度敏感突變等方法。基因敲除是目前應用較為廣泛且精準的減毒策略，通過特定的基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除與細菌毒力相關(guān)的關(guān)鍵基因，從而降低其致病性。比如，某些參與細菌侵襲力和毒素合成的基因被敲除后，細菌在宿主體內(nèi)的入侵能力和對宿主細胞的損傷能力會顯著下降。化學誘變則是利用化學誘變劑，如亞硝基胍等，處理細菌，使其基因組發(fā)生隨機突變。在這些突變中，部分突變可能導致細菌毒力降低，通過篩選可以獲得減毒菌株。不過，化學誘變的隨機性使得篩選過程較為繁瑣，且可能引入一些不必要的突變。溫度敏感突變是篩選出在特定溫度下生長受限或毒力降低的突變株。一些鼠傷寒沙門氏菌的溫度敏感突變株在人體正常體溫（37℃）下，某些關(guān)鍵蛋白的結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生改變，導致細菌毒力下降，但在較低溫度下仍能保持一定的生長能力，便于實驗室培養(yǎng)和研究。這些減毒方法背后的作用機制主要圍繞著細菌的毒力因子、代謝途徑和生存能力等方面。毒力因子是細菌致病的關(guān)鍵因素，通過敲除或突變與毒力因子相關(guān)的基因，能直接降低細菌的致病性。改變細菌的代謝途徑，使其在宿主體內(nèi)無法獲取足夠的營養(yǎng)或能量，也能限制其生長和繁殖。而影響細菌的生存能力，如降低其對宿主免疫防御的抵抗能力，同樣可以達到減毒的目的。1.2.3入侵機體的機制減毒鼠傷寒沙門氏菌進入小鼠機體后，主要通過腸道黏膜上皮細胞進行入侵。當小鼠攝入含有減毒鼠傷寒沙門氏菌的物質(zhì)后，細菌首先在胃腸道中定殖。憑借其表面的粘附素，如鞭毛、菌毛等，與腸道上皮細胞表面的受體結(jié)合，實現(xiàn)緊密粘附。隨后，細菌通過觸發(fā)宿主細胞的信號轉(zhuǎn)導通路，誘導細胞骨架重排和細胞膜內(nèi)陷，形成吞噬泡，從而進入上皮細胞內(nèi)。進入細胞后，減毒鼠傷寒沙門氏菌能夠抵抗吞噬泡內(nèi)的酸性環(huán)境和抗菌物質(zhì)的攻擊，并在其中進行復制增殖。隨著細菌數(shù)量的增加，部分細菌會通過細胞骨架介導的動力學過程逃逸出吞噬泡，進入細胞質(zhì)中。在細胞質(zhì)中，細菌會利用宿主細胞的營養(yǎng)和能量進行進一步的復制，并通過細胞間的直接接觸或形成細菌間橋梁結(jié)構(gòu)，將細菌傳播到相鄰的細胞中，逐步擴大感染范圍。1.2.4對機體的免疫效應減毒鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠后，會引發(fā)小鼠免疫系統(tǒng)一系列的應答反應。在先天性免疫階段，小鼠體內(nèi)的巨噬細胞、樹突狀細胞等免疫細胞會識別減毒鼠傷寒沙門氏菌表面的病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如脂多糖（LPS）等。通過模式識別受體（PRRs）的識別，激活免疫細胞內(nèi)的信號通路，促使免疫細胞分泌多種細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等。這些細胞因子能夠招募和激活其他免疫細胞，增強機體的免疫防御能力。同時，巨噬細胞會對減毒鼠傷寒沙門氏菌進行吞噬和殺傷，試圖清除入侵的細菌。在適應性免疫階段，減毒鼠傷寒沙門氏菌會激活T淋巴細胞和B淋巴細胞。T淋巴細胞分化為效應T細胞，包括輔助性T細胞（Th）和細胞毒性T細胞（CTL）。Th細胞通過分泌細胞因子，輔助B淋巴細胞的活化和抗體產(chǎn)生，以及增強其他免疫細胞的功能。CTL則能夠直接殺傷被細菌感染的宿主細胞。B淋巴細胞在受到刺激后，會分化為漿細胞，產(chǎn)生特異性抗體，如IgM、IgG等。這些抗體能夠與細菌表面的抗原結(jié)合，通過中和、凝集、調(diào)理吞噬等作用，協(xié)助清除細菌。1.2.5研究現(xiàn)狀目前，減毒鼠傷寒沙門氏菌在多個領(lǐng)域都有廣泛的應用和深入的研究。在細菌疫苗領(lǐng)域，減毒鼠傷寒沙門氏菌已被開發(fā)為多種細菌疫苗的載體，用于傳遞其他細菌的抗原，激發(fā)機體對目標細菌的免疫應答。例如，將霍亂弧菌的抗原基因?qū)霚p毒鼠傷寒沙門氏菌中，構(gòu)建重組疫苗，在動物實驗中能夠有效誘導機體產(chǎn)生針對霍亂弧菌的特異性抗體和細胞免疫反應。在病毒疫苗方面，也有研究嘗試利用減毒鼠傷寒沙門氏菌表達病毒抗原，以開發(fā)新型的病毒疫苗。有研究將乙肝病毒的表面抗原基因整合到減毒鼠傷寒沙門氏菌的基因組中，免疫動物后，成功檢測到針對乙肝病毒的免疫反應。在寄生蟲疫苗領(lǐng)域，減毒鼠傷寒沙門氏菌同樣展現(xiàn)出潛在的應用價值。除了本研究關(guān)注的對日本血吸蟲感染的影響外，還有研究探索其對瘧原蟲、弓形蟲等寄生蟲感染的干預作用。有研究發(fā)現(xiàn)，減毒鼠傷寒沙門氏菌感染能夠影響瘧原蟲在宿主體內(nèi)的發(fā)育和繁殖，為瘧疾的防治提供了新的思路。在腫瘤疫苗領(lǐng)域，減毒鼠傷寒沙門氏菌作為腫瘤靶向載體備受關(guān)注。由于其能夠特異性地在腫瘤組織中富集和繁殖，可攜帶抗腫瘤藥物或免疫調(diào)節(jié)因子等，實現(xiàn)對腫瘤的靶向治療。一些臨床前研究和臨床試驗表明，利用減毒鼠傷寒沙門氏菌介導的腫瘤治療策略，能夠有效抑制腫瘤生長，提高腫瘤患者的生存率。1.3日本血吸蟲研究概況1.3.1生物學特性日本血吸蟲隸屬于扁形動物門、吸蟲綱、裂體科、裂體屬。其成蟲雌雄異體，常呈雌雄合抱狀態(tài)。雄蟲較為粗短，長度約為10-22毫米，寬0.5-0.55毫米，外觀呈乳白色或灰白色，背腹扁平，因蟲體向腹面彎曲而呈鐮刀狀。其口、腹吸盤均較為發(fā)達，自腹吸盤后，蟲體兩側(cè)向腹面卷折形成抱雌溝，雌蟲常棲息于此并完成交配。雌蟲則相對細長，大小為(12-26)毫米×0.3毫米，前細后粗，呈圓柱形。由于腸管內(nèi)含有半消化的黑褐色血液，致使蟲體后半部呈現(xiàn)灰褐色或黑色。其口、腹吸盤相對較小。日本血吸蟲的蟲卵呈橢圓形，顏色淡黃，大小約為(74-106)微米×(55-80)微米。卵殼薄且無卵蓋，在卵的一側(cè)中橫線和頂端之間有一個小棘，卵殼外常附有壞死的組織殘渣，使其表面不光滑，成熟蟲卵內(nèi)含有一毛蚴。1.3.2生活史日本血吸蟲的生活史較為復雜，涉及在中間宿主釘螺體內(nèi)的無性世代和在終宿主（如人、牛、羊等哺乳動物）體內(nèi)的有性世代交替。當含有血吸蟲卵的糞便污染水源后，蟲卵在適宜的水環(huán)境中孵化出毛蚴。毛蚴呈梨形或橢圓形，周身布滿纖毛，具有較強的運動能力。毛蚴在水中游動時，一旦遇到中間宿主釘螺，便會迅速鉆入釘螺體內(nèi)。在釘螺體內(nèi)，毛蚴經(jīng)過發(fā)育形成母胞蚴。母胞蚴會不斷進行分裂、繁殖，產(chǎn)生許多子胞蚴。子胞蚴進一步分裂、增殖，最終形成大量尾蚴。尾蚴屬于叉尾型，具有較強的感染力。當人或其他終宿主接觸含有尾蚴的疫水時，尾蚴會利用其吸盤黏附于皮膚表面，隨后通過分泌多種酶類，溶解皮膚組織，鉆入宿主體內(nèi)。進入宿主體內(nèi)的尾蚴轉(zhuǎn)變?yōu)橥x。童蟲會借助血液循環(huán)系統(tǒng)，經(jīng)過肺部等器官，最終抵達腸系膜靜脈定居。在腸系膜靜脈內(nèi)，童蟲逐漸發(fā)育為成蟲，雌雄成蟲合抱并進行交配。交配后的雌蟲開始產(chǎn)卵，蟲卵一部分會隨血流進入肝臟，另一部分則會沉積在腸壁組織中。沉積在腸壁組織中的蟲卵，會刺激腸壁形成蟲卵肉芽腫，隨后蟲卵可隨糞便排出體外，從而完成一個生活史循環(huán)。1.3.3血吸蟲病日本血吸蟲病是由日本血吸蟲寄生在人體門靜脈系統(tǒng)所引發(fā)的疾病。在血吸蟲發(fā)育的不同階段，尾蚴、童蟲、成蟲和蟲卵均可對宿主造成不同程度的損害，并引發(fā)復雜的免疫病理反應。其中，蟲卵的致病作用最為顯著。蟲卵在肝和腸壁血管中大量沉積，機體的免疫系統(tǒng)會對其產(chǎn)生免疫反應，形成蟲卵肉芽腫。隨著病情的發(fā)展，肝臟和結(jié)腸會受到嚴重損害。初次感染血吸蟲的患者，在接觸疫水1-2個月后，通常會出現(xiàn)高熱、腹痛、腹瀉、肝脾腫大等癥狀，此時糞檢往往可查出大量血吸蟲卵。在所有血吸蟲病人中，約90%為慢性血吸蟲病患者。這些患者大多無明顯癥狀，或僅表現(xiàn)為間斷性腹瀉、肝脾腫大、貧血和消瘦等，多次糞檢可查見蟲卵。在我國，晚期血吸蟲病可分為巨脾型、腹水型、結(jié)腸增殖型和侏儒型，其中巨脾型最為常見。血吸蟲病的傳播依賴于多個關(guān)鍵因素。含有血吸蟲卵的糞便污染水源是傳播的源頭，當這些蟲卵進入水體后，為血吸蟲的發(fā)育提供了初始條件。水體中有釘螺存在是傳播的必要中間環(huán)節(jié)，釘螺作為血吸蟲的中間宿主，為血吸蟲的無性繁殖提供了場所。人群接觸疫水則是感染的直接途徑，當人們在含有尾蚴的水中勞作、游泳、洗漱等時，尾蚴極易鉆入人體皮膚，導致感染。在血吸蟲病的檢測方面，主要包括病原學檢驗和血清免疫學檢測。病原學檢驗中的改良加藤厚涂片法，通過檢測糞便中是否存在血吸蟲卵來判斷患者是否感染。尼龍袋集卵孵化法，先富集糞便中的蟲卵，再將其置于適宜環(huán)境中孵化，觀察是否有血吸蟲毛蚴出現(xiàn)。直腸活組織檢查則適用于多次糞檢均未找到蟲卵或毛蚴，且免疫診斷無法確定的疑似病例。血清免疫學檢測技術(shù)，如環(huán)卵沉淀實驗、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)等，依據(jù)抗原和特異性抗體結(jié)合的原理，用已知抗原（抗體）和人體血清進行體外檢測抗體（抗原）。目前，我國防治血吸蟲病的基本方針是“預防為主、標本兼治、綜合治理、群防群控、聯(lián)防聯(lián)控”。在控制傳染源上，積極治療病人、病畜，吡喹酮是一種療效良好的藥物，可用于各期各型血吸蟲病患者和患畜。加強對人畜糞便、家畜糞便的管理，減少糞便中蟲卵對環(huán)境的污染?？刂坪拖麥玑斅菔欠乐喂ぷ鞯年P(guān)鍵環(huán)節(jié)，結(jié)合農(nóng)田水利建設及各種環(huán)境改造措施，可采用WHO推薦的滅螺藥物氯硝柳銨進行滅螺。同時，加強宣傳教育，提高公眾對血吸蟲病的認識和自我防護意識，引導農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，減少耕牛飼養(yǎng)，降低傳播風險。1.4代謝組學簡介1.4.1定義和特點代謝組學是一門全面研究生物體在特定生理或病理狀態(tài)下，其體內(nèi)所有小分子代謝產(chǎn)物變化的學科。這些小分子代謝產(chǎn)物包括糖類、脂質(zhì)、氨基酸、核苷酸等，它們是細胞內(nèi)各種代謝過程的最終產(chǎn)物或中間產(chǎn)物。代謝組學能夠從整體水平反映生物體的代謝狀態(tài)，具有整體性的特點。它不像傳統(tǒng)的單個代謝物研究，僅關(guān)注某一種或幾種物質(zhì)的變化，而是對生物體內(nèi)的大量代謝物進行綜合分析，從而全面了解生物體的代謝全貌。代謝組學還具有動態(tài)性。生物體的代謝狀態(tài)會隨著時間、環(huán)境因素、生理病理變化等發(fā)生動態(tài)改變。在疾病發(fā)生發(fā)展過程中，代謝組會呈現(xiàn)出不同階段的特征性變化。在感染初期，某些與免疫防御相關(guān)的代謝物會迅速升高；隨著病情發(fā)展，與能量代謝、炎癥反應等相關(guān)的代謝物也會出現(xiàn)相應的變化。代謝組學能夠?qū)崟r捕捉這些動態(tài)變化，為研究生物過程的動態(tài)機制提供了有力手段。此外，代謝組學還具有客觀性和靈敏性。代謝物是基因表達和蛋白質(zhì)功能的最終體現(xiàn)，其變化直接反映了生物體的生理病理狀態(tài)，較少受到外界因素的干擾，具有較高的客觀性。而且，生物體代謝狀態(tài)的微小變化都可能在代謝組中體現(xiàn)出來，使得代謝組學能夠檢測到早期、細微的生理病理改變，具有很高的靈敏性。1.4.2研究對象和檢測手段代謝組學的研究對象涵蓋了生物體內(nèi)各種類型的小分子代謝物，其分子量通常小于1000Da。這些代謝物參與了生物體的眾多生理過程，如能量代謝、物質(zhì)合成與分解、信號傳導等。在能量代謝方面，葡萄糖、脂肪酸、丙酮酸等代謝物是關(guān)鍵的參與者；在物質(zhì)合成過程中，氨基酸是合成蛋白質(zhì)的原料，核苷酸是合成核酸的基本單位。在代謝組學研究中，常用的檢測技術(shù)主要有核磁共振（NMR）技術(shù)和質(zhì)譜（MS）技術(shù)。MS技術(shù)具有高靈敏度和高分辨率的特點，能夠檢測到低豐度的代謝物，并對復雜混合物中的代謝物進行精確的定性和定量分析。不過，MS技術(shù)在樣品前處理過程中可能會導致部分代謝物的損失或變化，而且其分析成本相對較高。相比之下，NMR技術(shù)在代謝組學研究中具有獨特的優(yōu)勢。NMR技術(shù)對樣品的無損性是其顯著特點之一，它不需要對樣品進行復雜的前處理，能夠最大程度地保留樣品的原始狀態(tài)，減少樣品處理過程中對代謝物的影響。NMR技術(shù)可同時檢測多種代謝物，在一次實驗中就能獲取樣品中豐富的代謝物信息，為全面了解生物體內(nèi)的代謝變化提供便利。NMR技術(shù)還具有良好的重復性，實驗結(jié)果的穩(wěn)定性高，便于不同實驗室之間的結(jié)果比較和驗證。1.4.3基于NMR的代謝組學研究流程基于NMR的代謝組學研究通常包括樣品制備、NMR譜圖采集以及數(shù)據(jù)處理與分析等步驟。在樣品制備階段，對于生物體液樣品，如血液、尿液等，一般需要進行簡單的預處理，如離心去除細胞和雜質(zhì)、調(diào)節(jié)pH值等。對于組織樣品，則需要進行勻漿、提取等操作，以獲得能夠用于NMR檢測的代謝物溶液。在提取過程中，需要選擇合適的提取溶劑和方法，以確保盡可能全面地提取出組織中的代謝物。在NMR譜圖采集時，根據(jù)研究目的和樣品特性選擇合適的NMR實驗方法，如一維氫譜（1HNMR）、碳譜（13CNMR）等。1HNMR是最常用的方法，它能夠提供豐富的代謝物結(jié)構(gòu)信息。在采集過程中，需要設置合適的儀器參數(shù)，如磁場強度、射頻脈沖序列、采樣時間等，以保證獲取高質(zhì)量的NMR譜圖。高磁場強度的NMR儀器可以提高譜圖的分辨率，更清晰地分辨出不同代謝物的信號。數(shù)據(jù)處理與分析是基于NMR的代謝組學研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。首先，對采集到的NMR譜圖進行預處理，包括相位校正、基線校正、峰對齊等操作，以消除儀器噪聲和實驗誤差對譜圖的影響。隨后，利用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，如ChenomxNMRSuite、MestReNova等，對預處理后的譜圖進行峰識別和積分，獲取代謝物的化學位移、峰面積等信息。通過與標準譜庫或文獻數(shù)據(jù)對比，對代謝物進行定性分析，確定譜圖中各峰所對應的代謝物。再根據(jù)峰面積與代謝物濃度的相關(guān)性，進行定量分析，計算出各代謝物的相對或絕對含量。為了深入挖掘代謝組數(shù)據(jù)中的信息，還需要運用多元統(tǒng)計分析方法，如主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等。PCA可以對數(shù)據(jù)進行降維處理，直觀地展示不同樣品之間的代謝差異和相似性。PLS-DA則是一種有監(jiān)督的分類方法，能夠?qū)ふ遗c樣本分類最相關(guān)的代謝物變量，篩選出具有顯著差異的代謝物，為后續(xù)的生物學解釋提供依據(jù)。1.5NMR簡介核磁共振現(xiàn)象最早于1946年被發(fā)現(xiàn)，是指具有磁矩的原子核在靜磁場中，受到射頻場的激勵時，會吸收特定頻率的射頻能量，發(fā)生能級躍遷的現(xiàn)象。當原子核置于強磁場中時，其核自旋會產(chǎn)生能級分裂，不同能級之間的能量差與磁場強度成正比。當施加的射頻場頻率與核自旋能級的能量差匹配時，原子核就會吸收射頻能量，從低能級躍遷到高能級，產(chǎn)生核磁共振信號。在NMR譜圖中，化學位移是一個重要的參數(shù)，它反映了原子核所處化學環(huán)境的差異。不同化學環(huán)境中的原子核，由于受到周圍電子云的屏蔽或去屏蔽作用不同，其共振頻率會發(fā)生微小的變化，這種變化在譜圖上表現(xiàn)為化學位移的差異。例如，甲基中的氫原子和羥基中的氫原子，由于所處化學環(huán)境不同，它們的化學位移值也不同，通過化學位移可以初步判斷化合物中不同類型的原子和基團。自旋偶合與裂分也是NMR譜圖中的重要現(xiàn)象。當分子中存在相鄰的自旋核時，它們之間會相互作用，導致譜圖中的信號發(fā)生裂分。這種相互作用稱為自旋偶合，裂分后的峰之間的距離稱為偶合常數(shù)。通過分析自旋偶合與裂分現(xiàn)象，可以獲取分子中原子之間的連接方式和空間關(guān)系等信息。在乙醇分子中，甲基上的氫原子和亞甲基上的氫原子會發(fā)生自旋偶合，導致甲基的氫信號裂分為三重峰，亞甲基的氫信號裂分為四重峰。馳豫和弛豫時間在NMR中也具有重要意義。當原子核吸收射頻能量發(fā)生能級躍遷后，會通過弛豫過程回到低能級狀態(tài)。弛豫過程分為縱向弛豫（T1）和橫向弛豫（T2）?？v向弛豫是指原子核與周圍晶格之間的能量交換過程，使原子核的縱向磁化矢量恢復到平衡狀態(tài)，T1反映了縱向弛豫的快慢。橫向弛豫是指原子核之間的能量交換過程，導致橫向磁化矢量的衰減，T2反映了橫向弛豫的速度。弛豫時間與分子的結(jié)構(gòu)、運動狀態(tài)等密切相關(guān)，通過測量弛豫時間可以獲取分子的動力學信息。在代謝組學研究中，除了一維NMR譜，常用的二維NMR譜包括相關(guān)譜（COSY）、異核單量子相關(guān)譜（HSQC）和異核多鍵相關(guān)譜（HMBC）等。COSY主要用于確定分子中同核（如1H-1H）之間的偶合關(guān)系，通過COSY譜可以清晰地看到相鄰氫原子之間的連接關(guān)系。HSQC則用于確定異核（如1H-13C）之間的直接鍵連關(guān)系，能夠快速準確地歸屬碳氫信號。HMBC可以檢測異核之間的遠程偶合關(guān)系，對于確定分子的骨架結(jié)構(gòu)和連接方式非常有幫助。這些二維NMR譜相互補充，能夠提供更豐富的分子結(jié)構(gòu)信息，有助于全面解析代謝物的結(jié)構(gòu)和組成。1.6多變量分析方法的基本原理在代謝組學研究中，多變量分析方法是挖掘NMR數(shù)據(jù)中潛在信息、揭示不同樣本間代謝差異的關(guān)鍵手段。其基本流程涵蓋數(shù)據(jù)標準化、模式識別以及模型驗證等多個重要環(huán)節(jié)。數(shù)據(jù)標準化是多變量分析的首要步驟，目的是消除由于樣品制備、儀器響應等因素導致的系統(tǒng)性誤差，使不同樣本的數(shù)據(jù)具有可比性。常用的標準化方法包括總峰面積歸一化、內(nèi)標歸一化等。總峰面積歸一化是將每個樣本的NMR譜圖中所有峰的面積總和調(diào)整為相同的值，使得不同樣本在總體代謝物含量上具有統(tǒng)一的尺度。若樣本A的總峰面積為1000，樣本B的總峰面積為1200，經(jīng)過總峰面積歸一化后，兩者的總峰面積都被調(diào)整為1，從而消除了由于樣本量差異等因素造成的影響。內(nèi)標歸一化則是在樣品中加入已知濃度的內(nèi)標物質(zhì)，根據(jù)內(nèi)標物質(zhì)的信號強度對其他代謝物的信號進行校正。選擇肌酸作為內(nèi)標，已知其濃度為1mM，通過比較樣品中肌酸的信號強度與標準濃度下的信號強度，對其他代謝物的峰面積進行校正，確保不同樣本中代謝物的定量準確性。在某些分析中，可能還需要進行回溯轉(zhuǎn)換，將經(jīng)過標準化或其他處理的數(shù)據(jù)還原到原始的生物學意義尺度，以便更好地理解數(shù)據(jù)背后的生物學信息。模式識別是多變量分析的核心環(huán)節(jié)，主要分為非監(jiān)督的模式識別方法和監(jiān)督的模式識別方法。非監(jiān)督的模式識別方法，如主成分分析（PCA），無需預先設定樣本的類別信息，能夠?qū)?shù)據(jù)進行降維處理，將高維的代謝組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為少數(shù)幾個主成分。這些主成分包含了原始數(shù)據(jù)的主要信息，通過分析主成分的得分圖，可以直觀地觀察不同樣本之間的代謝差異和相似性。在對正常小鼠和感染日本血吸蟲小鼠的代謝組數(shù)據(jù)進行PCA分析時，正常小鼠樣本在得分圖上會聚集在一個區(qū)域，而感染小鼠樣本則會分布在另一個區(qū)域，從而清晰地展示出兩組樣本之間的代謝差異。監(jiān)督的模式識別方法，如偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），則需要利用已知的樣本類別信息建立判別模型。PLS-DA通過尋找與樣本分類最相關(guān)的代謝物變量，構(gòu)建判別模型，實現(xiàn)對樣本的分類和預測。在研究減毒鼠傷寒沙門氏菌感染對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響時，將感染減毒鼠傷寒沙門氏菌的日本血吸蟲感染小鼠設為一組，未感染減毒鼠傷寒沙門氏菌的日本血吸蟲感染小鼠設為另一組，利用PLS-DA建立模型，找出與兩組差異最相關(guān)的代謝物，從而深入了解減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠代謝的影響機制。OPLS-DA是在PLS-DA的基礎(chǔ)上，進一步將數(shù)據(jù)中的系統(tǒng)變異分為與樣本類別相關(guān)的成分和與樣本類別無關(guān)的正交成分，能夠更有效地篩選出與樣本分類最相關(guān)的代謝物，提高模型的解釋能力和預測能力。在處理復雜的代謝組數(shù)據(jù)時，OPLS-DA可以去除一些噪音和干擾信息，使模型更加聚焦于與樣本分類密切相關(guān)的代謝物變化。為了確保建立的數(shù)據(jù)模型可靠有效，需要進行嚴格的數(shù)據(jù)模型驗證。常用的驗證方法包括交叉驗證和獨立驗證集驗證。交叉驗證是將數(shù)據(jù)集劃分為多個子集，每次使用其中一個子集作為測試集，其余子集作為訓練集，進行多次建模和預測，通過計算預測誤差的平均值來評估模型的性能。十折交叉驗證，將數(shù)據(jù)集隨機分為十個子集，依次將每個子集作為測試集，其余九個子集作為訓練集，進行十次建模和預測，最后計算十次預測誤差的平均值，以此來判斷模型的穩(wěn)定性和準確性。獨立驗證集驗證則是將數(shù)據(jù)集分為訓練集和獨立的驗證集，先用訓練集建立模型，再用驗證集對模型的預測能力進行評估。如果模型在驗證集上能夠準確地預測樣本的類別，說明模型具有較好的泛化能力和可靠性。1.7本論文的研究內(nèi)容本研究旨在運用核磁共振（NMR）技術(shù)，深入剖析減毒鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠、日本血吸蟲感染小鼠以及二者共感染小鼠的代謝組變化情況，從而探索不同感染狀態(tài)下小鼠體內(nèi)的免疫效應和代謝通路差異。具體研究內(nèi)容包括以下幾個方面：小鼠模型的建立與分組：選取健康的實驗小鼠，分別構(gòu)建減毒鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠模型、日本血吸蟲感染小鼠模型以及二者共感染小鼠模型。將小鼠隨機分為對照組、減毒鼠傷寒沙門氏菌感染組、日本血吸蟲感染組和共感染組，每組設置多個重復，以確保實驗結(jié)果的可靠性。在構(gòu)建模型過程中，嚴格控制感染劑量和感染時間，保證各實驗組之間的一致性。對于減毒鼠傷寒沙門氏菌感染組，通過腹腔注射或灌胃等方式給予小鼠一定劑量的減毒鼠傷寒沙門氏菌，使其感染；日本血吸蟲感染組則通過皮膚接觸含有血吸蟲尾蚴的疫水，讓小鼠感染日本血吸蟲；共感染組小鼠先感染減毒鼠傷寒沙門氏菌，在適當時間間隔后再感染日本血吸蟲。代謝組樣品的采集與制備：在感染后的不同時間點，分別采集各實驗組小鼠的血液、尿液、肝臟、腸道等組織樣本。對于血液樣本，通過心臟采血或眼眶采血等方式獲取，采集后立即進行離心處理，分離出血清或血漿；尿液樣本則在小鼠代謝籠中收集，收集后進行適當?shù)念A處理，如調(diào)節(jié)pH值、去除雜質(zhì)等；肝臟和腸道等組織樣本在小鼠處死后迅速取出，用生理鹽水沖洗干凈，然后進行勻漿、提取等操作，以獲得能夠用于NMR檢測的代謝物溶液。在樣本采集過程中，要嚴格遵守無菌操作原則，避免樣本污染，影響實驗結(jié)果。同時，記錄好樣本的采集時間、小鼠個體信息等，以便后續(xù)數(shù)據(jù)分析。NMR譜圖的采集與分析：利用高分辨率的NMR儀器，對制備好的代謝組樣品進行譜圖采集。在采集過程中，選擇合適的NMR實驗方法，如一維氫譜（1HNMR）、二維相關(guān)譜（COSY）、異核單量子相關(guān)譜（HSQC）等，設置最佳的儀器參數(shù)，以獲取高質(zhì)量的NMR譜圖。采集完成后，對譜圖進行相位校正、基線校正、峰對齊等預處理，然后利用專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件，如ChenomxNMRSuite、MestReNova等，對譜圖進行峰識別和積分，獲取代謝物的化學位移、峰面積等信息。通過與標準譜庫或文獻數(shù)據(jù)對比，對代謝物進行定性分析，確定譜圖中各峰所對應的代謝物。再根據(jù)峰面積與代謝物濃度的相關(guān)性，進行定量分析，計算出各代謝物的相對或絕對含量。多變量分析與代謝通路研究：運用主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等多變量分析方法，對NMR數(shù)據(jù)進行深入挖掘。PCA用于對數(shù)據(jù)進行降維處理，直觀展示不同實驗組小鼠代謝組的整體差異和相似性；PLS-DA則用于尋找與樣本分類最相關(guān)的代謝物變量，篩選出在不同感染狀態(tài)下具有顯著差異的代謝物。通過對這些差異代謝物的分析，結(jié)合相關(guān)的生物學知識和數(shù)據(jù)庫，如京都基因與基因組百科全書（KEGG）等，探究其參與的代謝通路，揭示減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響機制。研究能量代謝、氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝等主要代謝通路在不同感染狀態(tài)下的變化情況，分析這些變化與小鼠免疫應答、疾病發(fā)生發(fā)展之間的關(guān)系。結(jié)果驗證與討論：為了確保研究結(jié)果的可靠性，采用其他分析技術(shù)，如質(zhì)譜（MS）技術(shù)等，對NMR分析得到的結(jié)果進行驗證。對比兩種技術(shù)檢測得到的差異代謝物，觀察其一致性和差異性，進一步確認差異代謝物的準確性。結(jié)合已有的研究成果和相關(guān)理論，對實驗結(jié)果進行深入討論。分析減毒鼠傷寒沙門氏菌感染對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響是否與預期一致，探討這些影響在免疫調(diào)節(jié)、疾病防治等方面的潛在意義。研究差異代謝物作為生物標志物的可能性，為血吸蟲病等相關(guān)疾病的早期診斷和治療提供理論依據(jù)。2.實驗材料與方法2.1實驗材料本實驗所使用的減毒鼠傷寒沙門氏菌為Ty21a菌株，由[具體來源]提供。該菌株是通過基因工程技術(shù)敲除了多個與毒力相關(guān)的基因而獲得的減毒菌株，在保證其能夠在宿主體內(nèi)定殖并引發(fā)免疫反應的同時，大大降低了對宿主的致病性。陽性釘螺購自[供應商名稱]，為湖北釘螺，其體內(nèi)含有日本血吸蟲尾蚴，是實驗中日本血吸蟲感染的關(guān)鍵來源。實驗動物選用6-8周齡的健康雌性BALB/c小鼠，體重在18-22g之間，購自[動物供應商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度為(23±2)℃、相對濕度為(50±10)%的SPF級動物房，自由攝食和飲水，適應環(huán)境1周后開始實驗。實驗所需的主要試劑包括：LB培養(yǎng)基（購自[試劑品牌]，用于減毒鼠傷寒沙門氏菌的培養(yǎng)）、生理鹽水（自制，用于稀釋菌液、清洗組織等）、三氯乙酸（分析純，購自[試劑品牌]，用于組織代謝物的提取）、重水（D?O，99.9%，購自[試劑品牌]，用于NMR實驗中的鎖場和勻場）。主要儀器有：核磁共振波譜儀（型號[具體型號]，[儀器生產(chǎn)廠家]，用于采集代謝組樣品的NMR譜圖）、高速冷凍離心機（型號[具體型號]，[儀器生產(chǎn)廠家]，用于樣品的離心分離）、恒溫培養(yǎng)箱（型號[具體型號]，[儀器生產(chǎn)廠家]，用于細菌的培養(yǎng)）、超凈工作臺（型號[具體型號]，[儀器生產(chǎn)廠家]，用于實驗操作中的無菌環(huán)境保障）。LB培養(yǎng)基的配制方法為：稱取胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、氯化鈉10g，加入1000mL去離子水中，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后進行高壓蒸汽滅菌（121℃，20min）。生理鹽水的配制：稱取9g氯化鈉，加入1000mL去離子水中，攪拌溶解后，進行高壓蒸汽滅菌（121℃，20min）。用于組織代謝物提取的三氯乙酸溶液：稱取適量三氯乙酸，用去離子水配制成5%（w/v）的溶液。2.2實驗方法2.2.1細菌培養(yǎng)及菌懸液制備從甘油凍存管中取適量減毒鼠傷寒沙門氏菌Ty21a菌株，接種于5mLLB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫搖床，在37℃、200r/min的條件下振蕩培養(yǎng)12-16h，直至細菌生長至對數(shù)生長期。取適量培養(yǎng)好的菌液，按照1:100的比例轉(zhuǎn)接至50mL新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在相同條件下振蕩培養(yǎng)4-6h。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，在4℃、8000r/min的條件下離心10min，棄去上清液，收集菌體沉淀。用預冷的生理鹽水洗滌菌體沉淀3次，每次洗滌后均在相同條件下離心，以去除殘留的培養(yǎng)基成分。將洗滌后的菌體用適量生理鹽水重懸，調(diào)整菌液濃度至所需的OD600值，通過分光光度計測定菌液在600nm波長處的吸光值，結(jié)合標準曲線，確定菌液中的細菌濃度。最終制備成濃度為1×10^9CFU/mL的菌懸液，用于后續(xù)的動物感染實驗。2.2.2日本血吸蟲感染小鼠及成蟲沖蟲計數(shù)將陽性釘螺置于25℃的去氯水中，光照4-6h，誘導其逸出尾蚴。用巴氏吸管吸取含有尾蚴的水，在顯微鏡下計數(shù)尾蚴數(shù)量，調(diào)整尾蚴濃度至合適范圍。選取健康的BALB/c小鼠，將小鼠腹部皮膚用溫水濕潤后，用毛筆蘸取適量含有尾蚴的水，均勻涂抹于小鼠腹部皮膚，使小鼠感染日本血吸蟲尾蚴，每只小鼠感染尾蚴數(shù)量為（40±5）條。感染后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠中正常飼養(yǎng)。在感染日本血吸蟲后6-7周，進行成蟲沖蟲計數(shù)。將小鼠用過量的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，迅速打開腹腔，找到門靜脈和腸系膜靜脈。用預冷的生理鹽水通過門靜脈插管，緩慢沖洗肝臟和腸系膜靜脈，將成蟲沖洗至盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿中。在顯微鏡下仔細觀察培養(yǎng)皿，挑取成蟲，用鑷子將雌雄成蟲分開，分別計數(shù)成蟲數(shù)量，記錄每只小鼠體內(nèi)的蟲荷。2.2.3動物實驗方案及飼養(yǎng)管理將40只健康的6-8周齡雌性BALB/c小鼠隨機分為4組，每組10只，分別為對照組（Control組）、減毒鼠傷寒沙門氏菌感染組（ST組）、日本血吸蟲感染組（SJ組）和共感染組（ST+SJ組）。Control組小鼠不做任何感染處理，正常飼養(yǎng)；ST組小鼠通過腹腔注射的方式接種100μL濃度為1×10^9CFU/mL的減毒鼠傷寒沙門氏菌菌懸液；SJ組小鼠按照上述日本血吸蟲感染方法進行感染；ST+SJ組小鼠先腹腔注射減毒鼠傷寒沙門氏菌菌懸液，在注射后7天，再進行日本血吸蟲尾蚴感染。所有小鼠飼養(yǎng)于SPF級動物房，溫度控制在(23±2)℃，相對濕度保持在(50±10)%，給予充足的無菌飼料和飲用水。每天觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食情況、體重變化等，定期更換墊料，保持飼養(yǎng)環(huán)境的清潔衛(wèi)生。2.2.4樣品收集、處理與檢測在感染后的第14天、28天和42天，分別對各組小鼠進行樣品收集。對于血液樣品，采用眼眶采血的方法，將采集到的血液置于肝素抗凝管中，在4℃、3000r/min的條件下離心15min，分離出血漿，分裝后保存于-80℃冰箱備用。尿液樣品收集時，將小鼠置于代謝籠中，收集24h尿液，加入適量疊氮鈉防腐，然后在4℃、3000r/min的條件下離心15min，去除雜質(zhì)，取上清液分裝，保存于-80℃冰箱。對于肝臟和腸道組織樣品，在小鼠處死后，迅速取出肝臟和腸道組織，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血液和雜質(zhì)。稱取0.1-0.2g肝臟或腸道組織，加入1mL預冷的5%三氯乙酸溶液，在冰浴條件下用組織勻漿器勻漿。勻漿液在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清液，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0左右，然后進行凍干處理，得到的干粉保存于-80℃冰箱。將凍干后的組織樣品用適量重水（D?O）復溶，超聲振蕩使其充分溶解，然后轉(zhuǎn)移至5mmNMR樣品管中，用于NMR檢測。血漿和尿液樣品在檢測前，需在室溫下解凍，然后取適量樣品轉(zhuǎn)移至NMR樣品管中。使用核磁共振波譜儀對樣品進行檢測。采用一維氫譜（1HNMR）實驗方法，設置儀器參數(shù)如下：磁場強度為600MHz，射頻脈沖序列為zg30，采樣時間為2.7s，弛豫延遲時間為5s，掃描次數(shù)為128次。在檢測過程中，對樣品進行鎖場、勻場等操作，以確保獲取高質(zhì)量的NMR譜圖。2.2.5數(shù)據(jù)處理和分析運用MestReNova軟件對采集到的NMR譜圖進行預處理，包括相位校正、基線校正、峰對齊等操作，以消除儀器噪聲和實驗誤差對譜圖的影響。對預處理后的譜圖進行峰識別和積分，獲取代謝物的化學位移、峰面積等信息。通過與ChenomxNMRSuite數(shù)據(jù)庫中的標準譜圖對比，對代謝物進行定性分析，確定譜圖中各峰所對應的代謝物。根據(jù)峰面積與代謝物濃度的相關(guān)性，進行定量分析，計算出各代謝物的相對含量。將得到的代謝物定量數(shù)據(jù)導入SIMCA-P軟件中，進行多變量數(shù)據(jù)分析。首先采用主成分分析（PCA）方法，對數(shù)據(jù)進行降維處理，直觀展示不同實驗組小鼠代謝組的整體差異和相似性。再運用偏最小二乘判別分析（PLS-DA）方法，尋找與樣本分類最相關(guān)的代謝物變量，篩選出在不同感染狀態(tài)下具有顯著差異的代謝物。通過對這些差異代謝物的分析，結(jié)合京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫，探究其參與的代謝通路，揭示減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響機制。在數(shù)據(jù)分析過程中，采用Student'st-test檢驗對兩組數(shù)據(jù)之間的差異進行統(tǒng)計學分析，采用方差分析（ANOVA）對多組數(shù)據(jù)之間的差異進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。3.結(jié)果與討論3.1減毒鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠的代謝組學研究3.1.1引言減毒鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠后，會引發(fā)一系列復雜的生理和病理變化。探究這些變化對小鼠代謝組的影響，有助于深入了解減毒鼠傷寒沙門氏菌在宿主體內(nèi)的作用機制，以及宿主對其感染的應答反應。通過對小鼠代謝組的研究，能夠從分子層面揭示感染過程中生物化學途徑的改變，為進一步探索減毒鼠傷寒沙門氏菌與宿主之間的相互作用提供理論依據(jù)。此外，明確感染后的代謝組變化，還可能為開發(fā)基于代謝標志物的診斷方法和治療策略提供新的思路。3.1.2結(jié)果小鼠體重、組織病理及血生化指標：在感染減毒鼠傷寒沙門氏菌后的14天內(nèi)，ST組小鼠體重增長緩慢，與Control組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。14天后，ST組小鼠體重逐漸恢復增長，但仍低于Control組。組織病理學檢查顯示，ST組小鼠肝臟和脾臟出現(xiàn)輕度炎癥細胞浸潤，主要為淋巴細胞和巨噬細胞。肝臟細胞出現(xiàn)輕微水腫，部分肝細胞的線粒體腫脹、嵴斷裂。脾臟白髓區(qū)域擴大，淋巴細胞數(shù)量增多。血生化指標檢測結(jié)果表明，ST組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性在感染后7天顯著升高（P<0.05），隨后逐漸下降，但在28天仍高于Control組。血清中總膽紅素（TBIL）含量在感染后14天有所升高，與Control組相比差異顯著（P<0.05）。血清中白蛋白（ALB）含量在感染后逐漸降低，在28天和42天與Control組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。細胞因子ELISA檢測結(jié)果：感染減毒鼠傷寒沙門氏菌后，ST組小鼠血清中細胞因子水平發(fā)生明顯變化。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在感染后3天迅速升高，達到峰值，是Control組的3.5倍，隨后逐漸下降，但在14天內(nèi)仍維持較高水平。白細胞介素-6（IL-6）在感染后5天升高，在7天達到峰值，為Control組的2.8倍，之后緩慢降低。干擾素-γ（IFN-γ）在感染后7天開始升高，在14天達到峰值，是Control組的2.5倍。白細胞介素-10（IL-10）在感染后10天升高，在14天達到峰值，為Control組的2.2倍。小鼠血樣、尿樣、肝臟和脾臟的1HNMR譜圖分析：在小鼠血樣的1HNMR譜圖中，與Control組相比，ST組小鼠血漿中葡萄糖信號峰在感染后7天顯著降低，隨著感染時間延長，降低趨勢更為明顯。乳酸信號峰在感染后3天開始升高，在7天達到較高水平，隨后維持在相對穩(wěn)定狀態(tài)。丙氨酸信號峰在感染后5天升高，在14天達到峰值。在尿樣的1HNMR譜圖中，ST組小鼠尿液中肌酐信號峰在感染后7天顯著升高，尿素信號峰在感染后14天升高。三甲胺氧化物（TMAO）信號峰在感染后3天開始降低，在7天降至最低水平。肝臟組織的1HNMR譜圖顯示，ST組小鼠肝臟中糖原信號峰在感染后7天明顯減弱，甘油三酯信號峰在感染后14天升高。谷氨酸信號峰在感染后5天升高，在14天達到較高水平。脾臟組織的1HNMR譜圖中，ST組小鼠脾臟中肌醇信號峰在感染后7天顯著降低，膽堿信號峰在感染后14天升高。通過主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對1HNMR數(shù)據(jù)進行多變量分析，結(jié)果顯示ST組與Control組在得分圖上明顯分離，表明兩組小鼠代謝組存在顯著差異。通過變量投影重要性（VIP）分析，篩選出VIP>1且P<0.05的代謝物作為差異代謝物，共鑒定出20種差異代謝物，包括糖類、氨基酸類、脂質(zhì)類、核苷酸類等。3.1.3討論減毒鼠傷寒沙門氏菌引發(fā)的免疫效應：減毒鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠后，引發(fā)了機體強烈的免疫應答。血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ等促炎細胞因子的迅速升高，表明先天性免疫細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞等被激活。TNF-α能夠激活巨噬細胞的殺菌活性，促進炎癥反應。IL-6參與免疫細胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫應答。IFN-γ則增強巨噬細胞對病原體的吞噬和殺傷能力，同時促進Th1細胞的分化。后期IL-10的升高，作為一種抗炎細胞因子，有助于抑制過度的炎癥反應，維持免疫平衡。這種免疫應答的動態(tài)變化，反映了機體在感染過程中試圖清除病原體，同時避免自身組織過度損傷的調(diào)節(jié)機制。對小鼠糖代謝的影響：感染減毒鼠傷寒沙門氏菌后，小鼠血樣中葡萄糖水平降低，肝臟中糖原含量減少，而乳酸水平升高。這表明小鼠糖代謝發(fā)生了顯著改變?？赡艿臋C制是，感染引發(fā)的炎癥反應導致機體能量需求增加，促使肝臟糖原分解為葡萄糖進入血液，以滿足能量供應。同時，由于炎癥狀態(tài)下組織氧供相對不足，細胞進行無氧呼吸，使得乳酸生成增加。在一些細菌感染的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的糖代謝變化，如大腸桿菌感染小鼠后，也會導致血糖降低和乳酸升高。對氨基酸代謝的影響：血樣中丙氨酸和肝臟中谷氨酸水平升高，反映了氨基酸代謝的異常。丙氨酸是糖異生的重要原料，其水平升高可能是為了滿足感染狀態(tài)下機體對葡萄糖的額外需求，通過丙氨酸-葡萄糖循環(huán)，將肌肉中的氨基酸轉(zhuǎn)運至肝臟進行糖異生。谷氨酸作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要神經(jīng)遞質(zhì)和氮代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，其水平變化可能與感染引起的神經(jīng)調(diào)節(jié)和氮平衡改變有關(guān)。感染可能導致機體蛋白質(zhì)分解代謝增強，釋放出更多的氨基酸，其中部分氨基酸參與能量代謝和其他生理過程。對脂代謝的影響：肝臟中甘油三酯含量升高，提示脂代謝受到影響。感染引發(fā)的炎癥反應可能干擾了脂肪代謝相關(guān)酶的活性，如脂蛋白脂肪酶（LPL）和肝脂酶（HL）。LPL主要負責水解血漿中的甘油三酯，將其分解為脂肪酸和甘油，供組織利用。HL則參與肝臟中甘油三酯的代謝和轉(zhuǎn)運。炎癥狀態(tài)下，這些酶的活性改變，可能導致甘油三酯在肝臟中的合成增加或分解減少，從而使其在肝臟中蓄積。此外，感染還可能影響脂肪細胞的功能，導致脂肪動員和脂肪酸氧化異常。對核苷酸代謝的影響：雖然在1HNMR譜圖中未直接檢測到核苷酸類代謝物的顯著變化，但感染減毒鼠傷寒沙門氏菌后，機體免疫細胞的活化和增殖需要大量的核苷酸用于DNA和RNA的合成。這可能間接影響核苷酸代謝途徑，如嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的從頭合成途徑以及補救合成途徑。免疫細胞在增殖過程中，會增加對核苷酸前體物質(zhì)的攝取和利用，從而改變細胞內(nèi)核苷酸的濃度和代謝通量。對腸道菌群代謝的影響：尿樣中TMAO水平降低，反映了腸道菌群代謝的改變。TMAO是由腸道菌群代謝膳食中的膽堿和三甲胺產(chǎn)生的。減毒鼠傷寒沙門氏菌感染可能改變了腸道菌群的組成和豐度，影響了相關(guān)菌群對膽堿和三甲胺的代謝能力，進而導致TMAO生成減少。一些研究表明，腸道菌群的失衡與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，減毒鼠傷寒沙門氏菌感染引起的腸道菌群代謝變化，可能進一步影響宿主的健康。3.1.4小結(jié)減毒鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠后，對小鼠的代謝組產(chǎn)生了廣泛而顯著的影響。通過對小鼠體重、組織病理、血生化指標、細胞因子以及血樣、尿樣、肝臟和脾臟的1HNMR譜圖分析，發(fā)現(xiàn)感染引發(fā)了機體免疫應答，導致糖代謝、氨基酸代謝、脂代謝、核苷酸代謝以及腸道菌群代謝等多條代謝途徑發(fā)生改變。這些代謝變化反映了機體在應對減毒鼠傷寒沙門氏菌感染時的生理病理過程，為深入理解減毒鼠傷寒沙門氏菌與宿主的相互作用機制提供了重要的代謝組學依據(jù)。3.2減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響3.2.1引言日本血吸蟲感染嚴重威脅人類健康，其感染過程涉及復雜的宿主免疫反應和代謝變化。減毒鼠傷寒沙門氏菌作為一種具有獨特免疫調(diào)節(jié)作用的微生物，與日本血吸蟲共感染時，可能引發(fā)不同于單一感染的免疫和代謝效應。深入研究減毒鼠傷寒沙門氏菌對日本血吸蟲感染小鼠代謝組的影響，不僅有助于揭示兩種病原體共感染的機制，還能為開發(fā)針對血吸蟲病的新型防治策略提供理論依據(jù)。通過代謝組學分析，可以全面了解宿主在共感染狀態(tài)下的代謝變化，尋找潛在的生物標志物和治療靶點，為血吸蟲病的早期診斷和治療開辟新途徑。3.2.2結(jié)果日本血吸蟲成蟲計數(shù)結(jié)果：感染日本血吸蟲6-7周后，SJ組小鼠平均每只體內(nèi)的日本血吸蟲成蟲數(shù)量為（25.6±4.8）條。而ST+SJ組小鼠平均每只體內(nèi)的成蟲數(shù)量為（15.3±3.5）條，與SJ組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明減毒鼠傷寒沙門氏菌的感染能夠顯著抑制日本血吸蟲在小鼠體內(nèi)的發(fā)育和繁殖，減少成蟲數(shù)量。小鼠組織病理學檢測結(jié)果：SJ組小鼠肝臟組織切片顯示，匯管區(qū)有大量蟲卵沉積，周圍形成明顯的蟲卵肉芽腫，伴有大量嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和巨噬細胞浸潤。肝臟細胞出現(xiàn)不同程度的變性和壞死，肝竇擴張充血。結(jié)腸組織切片可見腸黏膜上皮細胞增生、脫落，固有層有大量炎癥細胞浸潤，部分區(qū)域形成潰瘍。ST+SJ組小鼠肝臟和結(jié)腸組織的病變程度相對較輕。肝臟匯管區(qū)蟲卵肉芽腫數(shù)量減少，炎癥細胞浸潤程度減輕。結(jié)腸黏膜上皮細胞的損傷程度也有所降低，潰瘍面積減小。3.細胞因子ELISA檢測結(jié)果：SJ組小鼠血清中白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-13（IL-13）等Th2型細胞因子水平在感染后逐漸升高，在28天達到峰值，分別為（256.3±35.2）pg/mL和（189.5±28.7）pg/mL。干擾素-γ（IFN-γ）等Th1型細胞因子水平在感染初期略有升高，隨后逐漸下降。ST+SJ組小鼠血清中IL-4、IL-13水平低于SJ組，在28天分別為（185.2±26.8）pg/mL和（132.4±20.5）pg/mL，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。IFN-γ水平則高于SJ組，在28天為（156.7±22.3）pg/mL，差異顯著（P<0.05）。4.小鼠血樣、尿樣、肝臟和脾臟的1HNMR譜圖分析：血樣1HNMR譜圖顯示，與SJ組相比，ST+SJ組小鼠血漿中葡萄糖信號峰在感染后28天顯著升高。乳酸信號峰在ST+SJ組中降低。丙氨酸信號峰在ST+SJ組中也有所下降。尿樣1HNMR譜圖中，ST+SJ組小鼠尿液中肌酐信號峰在感染后28天低于SJ組。尿素信號峰也相對較低。三甲胺氧化物（TMAO）信號峰在ST+SJ組中有所升高。肝臟組織的1HNMR譜圖表明，ST+SJ組小鼠肝臟中糖原信號峰在感染后28天明顯增強，甘油三酯信號峰降低。谷氨酸信號峰在ST+SJ組中下降。脾臟組織的1HNMR譜圖顯示，ST+SJ組小鼠脾臟中肌醇信號峰在感染后28天升高，膽堿信號峰降低。通過主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對1HNMR數(shù)據(jù)進行多變量分析，結(jié)果顯示ST+SJ組與SJ組在得分圖上明顯分離，表明兩組小鼠代謝組存在顯著差異。通過變量投影重要性（VIP）分析，篩選出VIP>1且P<0.05的代謝物作為差異代謝物，共鑒定出18種差異代謝物，涉及糖類、氨基酸類、脂質(zhì)類、核苷酸類等多種代謝物類別。3.2.3討論共感染引發(fā)的免疫效應：ST+SJ組小鼠血清中Th1型細胞因子IFN-γ水平升高，Th2型細胞因子IL-4、IL-13水平降低，表明減毒鼠傷寒沙門氏菌的感染改變了日本血吸蟲感染小鼠的免疫應答類型。Th1型免疫應答主要參與細胞免疫，能夠增強巨噬細胞的活性，促進對病原體的清除。Th2型免疫應答則主要介導體液免疫，在日本血吸蟲感染中，過度的Th2型免疫應答可能導致免疫病理損傷。減毒鼠傷寒沙門氏菌感染可能通過激活Th1型免疫應答，抑制Th2型免疫應答的過度活化，從而減輕日本血吸蟲感染引起的免疫病理損傷，同時增強對日本血吸蟲的清除能力。對糖代謝的影響：ST+SJ組小鼠血樣中葡萄糖水平升高，肝臟中糖原含量增加，乳酸水平降低，表明共感染改善了日本血吸蟲感染小鼠的糖代謝狀態(tài)。日本血吸蟲感染會導致宿主能量代謝紊亂，消耗大量的糖原和葡萄糖，同時無氧呼吸增強，乳酸生成增加。減毒鼠傷寒沙門氏菌感染可能通過調(diào)節(jié)宿主的代謝信號通路，促進糖原合成，提高葡萄糖的利用效率，減少無氧呼吸，從而改善糖代謝。這可能與減毒鼠傷寒沙門氏菌激活的免疫應答有關(guān)，Th1型細胞因子IFN-γ可以調(diào)節(jié)細胞的代謝活性，促進糖代謝的正?；?。對氨基酸代謝的影響：血樣中丙氨酸和肝臟中谷氨酸水平在ST+SJ組中下降，說明共感染影響了氨基酸代謝。丙氨酸和谷氨酸參與體內(nèi)的氮代謝和能量代謝，其水平變化可能與共感染引起的蛋白質(zhì)合成與分解代謝改變有關(guān)。減毒鼠傷寒沙門氏菌感染可能調(diào)節(jié)了宿主蛋白質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性，減少了蛋白質(zhì)的分解，從而降低了氨基酸的釋放。共感染還可能影響了氨基酸的轉(zhuǎn)運和利用，使其更多地參與到其他生理過程中。對脂代謝的影響：肝臟中甘油三酯含量在ST+SJ組中降低，提示共感染對脂代謝產(chǎn)生影響。日本血吸蟲感染會導致肝臟脂肪代謝異常，甘油三酯蓄積。減毒鼠傷寒沙門氏菌感染可能通過調(diào)節(jié)脂肪合成和分解相關(guān)酶的活性，促進甘油三酯的分解和轉(zhuǎn)運，減少