-紡織染整團(tuán)隊(duì)今天熒光顯微鏡技術(shù)的根本原理是借助熒光劑讓細(xì)胞成分呈現(xiàn)高度具體的可視化效果，比方在目的蛋白后面連一個(gè)通用的熒光蛋白—GFP。在組織樣本中，目的基因無法進(jìn)展克隆，則需要用免疫熒光染色等其他技術(shù)手段來觀察目的蛋白。為此，就需要利用抗體，這些抗體連接各種不同的熒光染料，直接或間接地與相應(yīng)的靶構(gòu)造相結(jié)合。此外，借助熒光染料，熒光顯微鏡技術(shù)不只局限于蛋白質(zhì)，它還可以對(duì)核酸、聚糖等其他構(gòu)造進(jìn)展染色，即便鈣離子等非生物物質(zhì)也可以檢測(cè)出來。在熒光顯微鏡技術(shù)中，可以通過兩種方式觀察到你的目的蛋白：利用源熒光信號(hào)，即通過克隆手段，用遺傳學(xué)方法將熒光蛋白與目的蛋白相連；或利用熒光標(biāo)記的抗體特異性結(jié)合目的蛋白。有些生物學(xué)問題采用第二種方法會(huì)更有用或更有必要。比方，組織學(xué)樣品無法使用熒光蛋白，因?yàn)橥ǔ碚f，標(biāo)本都是從無法保存熒光蛋白的生物體中獲取。此外，當(dāng)有一個(gè)有功能的抗體可用時(shí)，免疫熒光法會(huì)比熒光蛋白技術(shù)快很多，因?yàn)楹笳弑仨毾瓤寺∧康幕蛟賹NA轉(zhuǎn)染到適當(dāng)?shù)募?xì)胞中。熒光蛋白的另一項(xiàng)劣勢(shì)在于其本身屬于蛋白質(zhì)。因此，細(xì)胞的這些熒光蛋白具有特定的蛋白質(zhì)特性，其會(huì)導(dǎo)致附著的目的蛋白質(zhì)發(fā)生功能紊亂或出現(xiàn)誤釋的情況。然而，熒光蛋白技術(shù)仍然是觀察活細(xì)胞的首選方法。免疫熒光法利用了抗體可以和相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的這個(gè)特性，對(duì)此它還有兩種不同的表現(xiàn)形式。最簡(jiǎn)單的方式是使用可與目的蛋白相結(jié)合的熒光標(biāo)記抗體。這種方法被稱為"直接免疫熒光法〞。在很多情況下，我們可以利用兩種不同特性的抗體。第一種抗體可以結(jié)合目的蛋白，但其本身并未進(jìn)展熒光標(biāo)記〔一抗〕。第二種抗體本身就攜帶熒光染料〔二抗〕，并且可以特異性結(jié)合一抗。這種方法被稱為"間接免疫熒光法〞。這種方法存在諸多優(yōu)勢(shì)。一方面，它會(huì)產(chǎn)生放大效應(yīng)，因?yàn)椴恢灰粋€(gè)二抗可以與一抗相結(jié)合。另一方面，沒有必要始終用熒光染料標(biāo)記目的蛋白的每個(gè)抗體，但可以使用市售熒光標(biāo)記的二抗。免疫熒光中廣泛使用的熒光染料包括FITC、TRITC或一些FITC和TRITC異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機(jī)熒光染料，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中。在495/517nm處，該染料會(huì)產(chǎn)生激發(fā)/發(fā)射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反響基團(tuán)與不同抗體結(jié)合，該基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)上的氨基、巰基、咪唑、酪氨酰、羰基等基團(tuán)相結(jié)合。染料，且其被當(dāng)成Ale*aFluor?488等后續(xù)熒光染料的發(fā)端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統(tǒng)，而該系統(tǒng)受藍(lán)色光譜中的光所激發(fā)。經(jīng)常與FITC同時(shí)使用的另一種染料是與其相似的TRITC[四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與FITC相反，TRITC并非熒光素，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個(gè)大的共軛芳香電子系統(tǒng)，正是該系統(tǒng)引發(fā)了它們的熒光行為。蛋白質(zhì)〔例如，抗體〕結(jié)合也基于異硫氰酸鹽反響基團(tuán)。雖然FITC和TRITC仍在使用，但由于它們屬于發(fā)光相對(duì)較弱的熒光染料且它們的優(yōu)勢(shì)僅僅是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因此，在最新的顯微鏡技術(shù)中并不推薦。圖1：果蠅胚胎發(fā)育，綠色：FITC；紅色：TRITC這類熒光染料相對(duì)較少，從青色素衍生而來，也是其名稱的由來：Cy2、Cy3、Cy5和Cy7。上述所有青色素均可以通過其反響基團(tuán)與核酸或蛋白相連。例如，采用了蛋白標(biāo)記的馬來酰亞胺基團(tuán)。有趣的是，對(duì)于熒光，Cy5對(duì)其周邊電子環(huán)境非常敏感，該特征可用于酶測(cè)定。-附著蛋白質(zhì)的構(gòu)象改變會(huì)導(dǎo)致熒光發(fā)射產(chǎn)生陽(yáng)性或陰性變化。此外，Cy3和Cy5還可用于FRET試驗(yàn)。青色素染料是一種相較老的熒光染料，但卻是其他熒光染料在亮度、耐光性、量子產(chǎn)率等方面得以改善的根底。Ale*aFluor?染料是帶負(fù)電荷且親水的熒光染料系列，該系列染料囊括圍較廣，且經(jīng)常用于熒光顯微鏡技術(shù)之中。這些產(chǎn)品標(biāo)識(shí)中也涵蓋了相應(yīng)的激光激發(fā)波長(zhǎng)。盡管Ale*aFluor?488是一種熒光素衍生物，但與FITC相反，它擁有更佳的穩(wěn)定性和熒光亮度，且pH敏感度也更低。所有色素或羅丹明，它們的摩爾質(zhì)量在410至在熒光顯微鏡技術(shù)中，不只研究蛋白構(gòu)造，核酸同樣具有重要的研究意義。有時(shí)候，必須通過檢測(cè)細(xì)胞核來確定細(xì)胞的準(zhǔn)確位置及其數(shù)量。最常用的一種DNA染色劑當(dāng)屬DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲如果DAPI附著到DNA上，其熒光強(qiáng)度將比游離狀態(tài)要高。該染色劑受最大波長(zhǎng)為358nm的紫外光激發(fā)，其發(fā)射光譜非常寬，在461nm處到達(dá)峰值。此外，還可對(duì)弱熒光進(jìn)展RNA結(jié)合檢測(cè)。在這種情況下，發(fā)射波長(zhǎng)將轉(zhuǎn)移至500nm。有趣的是，DAPI能夠穿透整個(gè)細(xì)胞膜。因此，它可以用于固定和活細(xì)胞之中。似，這三種染色劑都可受最大發(fā)射波長(zhǎng)為455nm的紫外光激發(fā)，而未被結(jié)合的染色劑，其最大發(fā)射波長(zhǎng)在510–540nm之間。Hoechst染色劑還具有細(xì)胞滲透性，因此可用于活細(xì)胞或已固定的細(xì)胞中。該染色劑與DAPI的不同之處在于，它們的毒性較碘化丙啶〔Propidium-Iodide，PI〕是一種不能透過細(xì)胞膜的DNA染色劑。由于具備上述特性，該染色劑無法進(jìn)入完整的細(xì)胞中，因此，該染色劑常用于區(qū)分細(xì)胞群中的活細(xì)胞和死細(xì)胞。此外，碘化丙啶還是一種嵌入劑，但對(duì)于不同的堿基并不存在結(jié)合的差異性。該染色劑與核酸結(jié)合后，最大激發(fā)波長(zhǎng)為538nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為617nm。未結(jié)合PI的最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)和光強(qiáng)會(huì)更低一些。PI還可結(jié)合RNA，同時(shí)無需改變自身的熒光特性。有時(shí)候?yàn)榱藚^(qū)分DNA和RNA，有必要使用適當(dāng)?shù)暮怂峤Y(jié)合后，最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為460nm/650nm。此外，它還能夠進(jìn)入溶酶體等酸性區(qū)室。在這里，陽(yáng)離子染料被質(zhì)子化。在這種酸性環(huán)境下，吖啶橙由藍(lán)色光譜中的光激發(fā)，但發(fā)射波長(zhǎng)在橙色區(qū)域到達(dá)最大。由于凋亡細(xì)胞具有大量被吞噬的酸性區(qū)室，在熒光顯微鏡技術(shù)中，往往要對(duì)溶酶體、核體等細(xì)胞區(qū)室以及線粒體等細(xì)胞器進(jìn)展染色。為此，該局部介紹了一系列可供選擇使用的特異性染料。-觀察線粒體最常用的方法就是利用MitoTracker?,它是一種可透過細(xì)胞的染料，包含輕度巰基化的氯甲基活性局部。正因如此，它可與半胱氨酸殘基的游離硫醇基反響，從而與基質(zhì)蛋白實(shí)現(xiàn)共價(jià)結(jié)合。MitoTracker?有不同的顏色和修飾類型〔參見表1〕，依據(jù)線粒體染色劑，還有些染料可以標(biāo)記溶酶體等酸性區(qū)室，這類染料被稱為L(zhǎng)ysoTracker。它們由連接一個(gè)熒光基團(tuán)的弱堿基團(tuán)組成，具有膜穿透性。最有可能的情況是，這些堿基因質(zhì)子化作用的影響而對(duì)酸性區(qū)室具有親和性。LysoTracker具有多種不同的顏色可供選擇〔參見表1〕。與溶酶體相似的區(qū)室是釀酒酵母等真菌中的液泡，這種膜密閉空間也是一種酸性環(huán)境。如果要在熒光顯微鏡下觀察上述區(qū)室，對(duì)于蛋白質(zhì)分泌實(shí)驗(yàn)，質(zhì)網(wǎng)(ER)具有重要的研究意義。對(duì)上述區(qū)室進(jìn)展染色的一種典型染料為DiOC6(3)。該染料雖然偏好ER，但仍會(huì)結(jié)合線粒體等其他細(xì)胞器膜。對(duì)ER進(jìn)展特異性染色的另一種方法是，使用ER-TrackerGreen和Red等ER-Tracker，而ER-TrackerGreen和Red是基于BODIPY的兩種染料，其與格列本脲〔一種磺?；迕浮尺B接，并可與僅存于質(zhì)網(wǎng)膜上的料基團(tuán)，該染料對(duì)蛋白質(zhì)標(biāo)記沒太大用處，但卻是脂質(zhì)和膜標(biāo)記的良好工具。對(duì)于與ER相鄰的高爾基體，可以用神經(jīng)酰胺為鞘脂類，其在高爾基體中高度富集。除了使用特異性非蛋白熒光染料對(duì)細(xì)胞區(qū)室進(jìn)展標(biāo)記之外，還可以借助對(duì)細(xì)胞中不同位置有偏好的蛋白質(zhì)對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)展染色。這些蛋白質(zhì)可以和熒光染料相連，并可通過熒光顯微鏡進(jìn)展觀察。運(yùn)用這種方法的一個(gè)實(shí)例是：麥胚凝集素(WGA)可以與細(xì)胞質(zhì)膜中的唾液酸和N-乙酰葡萄糖胺基特異性結(jié)合，將WGA與熒光染料偶聯(lián)，這樣我們就可以觀察到細(xì)胞質(zhì)膜了。狀肌動(dòng)蛋白；藍(lán)色：用DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核。使用三維盲反褶積可以改善該圖像的質(zhì)量。在有關(guān)神經(jīng)元方面的研究中，觀察基因活性或細(xì)胞運(yùn)動(dòng)等對(duì)于了解細(xì)胞的離子濃度具有重要意義。鈉、鈣、氯或鎂離子對(duì)很多不同的細(xì)胞活動(dòng)都具有較大影響。一般情況下，借助熒光標(biāo)記的螯合劑可將離子困住，螯合劑在結(jié)合相應(yīng)離子后會(huì)改變離子的有趣的是，還存在以蛋白質(zhì)為主的鈣指示劑，其中一種是基于水母化學(xué)發(fā)光蛋白—水母素。水母素、發(fā)光體腔腸素、分子氧和Ca2+相互作用會(huì)釋放藍(lán)光，這是在熒光蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)過程中非常著名的機(jī)制。原來高品質(zhì)的熒光單子也是則容易搞定的我們先來看下這組熒光料分散熒光染料在紡織領(lǐng)域的應(yīng)用局限于滌綸錦綸等合成纖維及其混紡織物的染色。分散熒光染料的品類也相對(duì)越來越豐富，一般有熒光黃系列，例如：熒光黃10GN,熒光黃8GFF。熒光紅系列，例如：熒光桃紅BG，熒光桃紅FBS，分散熒光紅G等等。在熒光藍(lán)的領(lǐng)域相對(duì)還是有點(diǎn)空缺的。下面以熒光紅G〔DISPERSEREDG.CAS:70294-19-8〕為例跟大家探討染色過程中所需要注意的幾個(gè)問題。1，PH值對(duì)分散熒光紅G上染情況的影響。-在pH值偏堿時(shí)，布樣的ks值很低，G紅上色很淺且發(fā)蘭不夠鮮艷。ph值偏酸時(shí)，布樣的ks值也不是最大，色光偏蘭，同樣不夠鮮艷。pH值在左右時(shí)，上色最好.所以分散熒光紅G上色的pH與一般分散染料有所不同，它對(duì)PH的要求更高，染液偏堿或偏酸都會(huì)影響其上色效果。2，水質(zhì)對(duì)G紅上色的影響。眾所周知，織布染色的勻染性和通透性與水質(zhì)息息相關(guān)，螯合分散劑的應(yīng)用中越來越重要。通過實(shí)踐，螯合分散劑的參加對(duì)布樣ks值的影響不是很大。說明對(duì)顏色的深淺沒有太大的影響。通過布樣色光的比照，螯合分散劑的添加使得布樣的顏色更加鮮艷，不加螯合分散劑的布樣明顯發(fā)蘭，發(fā)舊，不能充分發(fā)揮分散熒光紅G的熒光效果。布樣的ks值接近，在生產(chǎn)過程中，考慮到本錢和其它因素影響，選擇13O度上染。這個(gè)跟常規(guī)分散染料的數(shù)據(jù)根本吻合。布樣的KS值隨著保溫的時(shí)間增加而變大，保溫60分時(shí)，KS值最大。保溫90分時(shí)，ks值變小。這是因?yàn)槿玖仙先究椢锸俏胶徒馕倪^程。保溫時(shí)間過長(zhǎng)，解吸到染夜中的染料越多，ks值越小。說明分散熒光紅G保溫60分鐘時(shí)，得色率最高，染色最上文提到的所有染料在下表中均有統(tǒng)計(jì)。此外，還涵蓋了其他熒光染料及其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)峰值。熒光染料例如激發(fā)光-熒光染料例如DAPI-DNADAPI激發(fā)光-熒光染料例如DiO激發(fā)光-熒光染料例如激發(fā)光FDADTAFCFDAFITC-熒光染料例如激發(fā)光2++-熒光染料例如激發(fā)光