ICS65.120DB43液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法2012-07-24發(fā)布2012-12-10實(shí)施IDB43/T687—2012 Ⅱ 12規(guī)范性引用文件 13方法提要 14試劑與材料 15儀器與設(shè)備 26試樣制備 27分析測定 28方法的線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度 4附錄A(資料性附錄)七種化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖(MRM色譜圖) 6DB43/T687—2012Ⅱ本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009的規(guī)則編制。本標(biāo)準(zhǔn)由長沙市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省畜牧水產(chǎn)局歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：長沙市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：盧艷芬、王輝、徐麗君、顏克旭、唐巍、漆亮、楊輝、尹雯婕、薛爽。DB43/T687—20121飼料中福莫特羅、苯乙醇胺A、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西馬特羅的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中福莫特羅(Formoterol)、苯乙醇胺A(PhenylethanolamineA)、克侖特羅(Clenbuterol)、萊克多巴胺(Ractopamine)、沙丁胺醇(Salbutamol)、特布它林(Terbutaline)、西馬特羅(Cimaterol)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的測定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于預(yù)混合飼料、濃縮飼料和配合飼料中福莫特羅、苯乙醇胺A、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西馬特羅的測定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T14699.1飼料采樣GB/T20195動物飼料試樣的制備3方法提要試樣用鹽酸-甲醇溶液提取，調(diào)pH后經(jīng)混合型陽離子固相萃取小柱凈化，用帶有電噴霧離子源的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定，外標(biāo)法定量。4試劑與材料本法所用試劑除另有說明外，均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級水。4.1甲醇：色譜純。4.2甲酸：色譜純。4.3鹽酸。4.4氨水。4.5氫氧化鈉。4.6提取液：0.1mol/L鹽酸+甲醇=8+2(V+V)。4.70.1mol/L鹽酸：取鹽酸9mL,用水稀釋至1000mL。4.80.1%甲酸溶液：取甲酸1mL,加水稀釋至1000mL。4.910mol/L氫氧化鈉：稱取40g氫氧化鈉，用適量水溶解冷卻后，用水稀釋至100mL。4.105%氨化甲醇溶液：取5mL氨水用甲醇稀釋到100mL。4.11溶解液：0.1%甲酸溶液(4.8)+甲醇=5+95(V+V)。4.12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：福莫特羅、苯乙醇胺A、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西馬特羅，2純度均應(yīng)大于98.0%。4.13標(biāo)準(zhǔn)儲備液(100μg/mL):分別準(zhǔn)確稱取適量的福莫特羅、苯乙醇胺A、克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布它林、西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇分別配制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，4℃冰箱中避光保存。保存期不超過6個月。4.14混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液(1μg/mL):分別準(zhǔn)確吸取1.0mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇稀釋定容至100mL,置4℃冰箱中避光保存。保存期不超過6個月。4.15混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，用溶解液稀釋成濃度分別為0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。使用前配制。4.16微孔有機(jī)過濾膜，0.22μm。5儀器與設(shè)備5.1分析天平：感量0.01mg、0.01g。5.2離心管：5mL,50mL。5.3水浴超聲器。5.4高速離心機(jī)：5000r/min。5.5氮吹儀。5.6渦旋振蕩器。5.7固相萃取裝置。5.8高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。5.9混合型陽離子固相萃取小柱：60mg/3mL,使用前活化。6試樣制備按GB/T14699.1采樣。選取有代表性飼料樣品至少500g,按GB/T20195制備試樣。7分析測定7.1樣品制備稱取試樣2g(精確到0.01g)于50mL離心管中，準(zhǔn)確加入10mL提取液(4.6);充分振蕩后超聲10min,5000r/min高速離心5min。上清液全部轉(zhuǎn)移到另一離心管中。殘渣用上述方法重復(fù)提取一次。合并上清液，用10mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至4,待用。7.1.2凈化依次用3mL甲醇，3mL水活化固相萃取小柱，準(zhǔn)確移取5mL上清液上柱。再依次用3mL0.1mol/L鹽酸溶液、3mL甲醇淋洗，抽干，用3mL5%氦化甲醇洗脫，收集洗脫液于5mL離心管中，45℃下用氮?dú)獯蹈?。?.0mL溶解液溶解；渦旋混勻后過有機(jī)微孔濾膜，上機(jī)測定。若試樣溶液中含有的被測物質(zhì)濃度超出儀器線性范圍，可用一定體積溶解液稀釋后進(jìn)樣。7.2液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定DB43/T687—201237.2.1液相色譜參考條件色譜柱：C18(50×2.1mm,粒徑1.7μm),或相當(dāng)者。流動相：A相：0.1%甲酸水溶液；B相：甲醇。流動相梯度洗脫條件參見表1流動相梯度洗脫條件。表1流動相梯度洗脫條件時間(min)A(%)B(%)0556.78.05流速：0.3mL/min。柱溫：35℃。7.2.2質(zhì)譜參考條件離子源：電噴霧離子源。掃描方式：正離子掃描。檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測。電離電壓：3.0KV。離子源溫度：120℃。霧化溫度：350℃。錐孔氣流速：50L/h。霧化氣流速：580L/h。各化合物保留時間、定性定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量參見表2七種化合物的保留時間、定性定量離子對及錐孔電壓、碰撞能量?；衔锉Ａ魰r間定性離子對定量離子對錐孔電壓碰撞能量西馬特羅2.18220.1/160.1220.1/202.1220.1/160.1特布他林2.70226.1/125.0226.1/152.0226.1/152.0沙丁胺醇3.23240.1/148.1240.1/222.2240.1/148.1萊克多巴胺4.70302.2/107.1302.2/164.1302.2/164.1克倫特羅5.10277.1/203.0277.1/259.1277.1/203.0福莫特羅(Form)5.33345.2/149.1345.2/121.2345.2/149.1苯乙醇胺A6.32345.5/327.2345.5/150.2345.5/150.24DB43/T687—20127.2.3液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定取適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及試樣溶液注入液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，各被測物質(zhì)的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測的線性范圍內(nèi)。7.2.3.1定性測定每種化合物的質(zhì)譜定性離子必須出現(xiàn)，至少應(yīng)包括一個母離子和兩個以上子離子，在相同的試驗(yàn)條件下，試樣中被測化合物色譜峰的保留時間與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時間一致，變化范圍應(yīng)在±2.5%.之內(nèi)。而且試樣中被測化合物的定性離子的相對豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液中對應(yīng)的定性離子的相對豐度相比，其允許偏差不超過表3定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差規(guī)定的范圍。相對離子豐度20%~50%10%～20%允許的相對偏差7.2.3.2定量測定以各化合物質(zhì)量色譜峰峰面積按外標(biāo)法進(jìn)行單點(diǎn)或多點(diǎn)校準(zhǔn)測定。在上述參考條件下，七種化合物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖(MRM色譜圖)參見附錄A。7.2.4空白試驗(yàn)除不加樣品外，采用完全相同的分析測定步驟進(jìn)行操作。7.3結(jié)果計算試樣中各被測化合物的含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/kg)表示，其結(jié)果可由計算機(jī)外標(biāo)法自動計算獲得，也可按下式計算：X——試樣中各化合物的質(zhì)量，單位為亳克每千克(mg/kg);A——樣品溶液中各化合物的峰面積；Cs——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各化合物的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL);V——樣品最終定容體積，單位為毫升(mL);As——標(biāo)準(zhǔn)工作溶液中各化合物的峰面積；m—試樣的質(zhì)量，單位為克(g);f——稀釋倍數(shù)。平行測定用算術(shù)平均值表示，計算結(jié)果應(yīng)扣除空白值，結(jié)果保留3位有效數(shù)字。8方法的線性范圍、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度8.1線性范圍各化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的線性范圍為0.5μg/L～50μg/L。DB43/T687—20125本方法中各化合物的定量限均為0.05mg/kg。8.3準(zhǔn)確度本方法中，各化合物在添加濃度為0.05mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg時，回收率范圍為65%~8.4精密度批內(nèi)變異系數(shù)≤15%,批間變異系數(shù)≤15%。6DB43/T687—2012附錄A(資料性附錄)七種化合物的液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜圖(MRM色譜圖)003MRMof14ChannelsES+345.5>327.2PhenA)6.301.74e4oL oL003MRMof14ChannelsES+D030o2003003D03003003DD2003003of14ES+÷of