ICS65.020.202301IDB2301/T151—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些部分可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由哈爾濱市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：陳秋明、田甜、于松濤、王杰、盛慧、李慧、陳剛、李亮、張金鳳、雷娜、劉斯斯、劉志洋、曹廣祿、陳曦。DB2301/T151—20231大豆疫霉根腐病菌生理小種鑒定技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了大豆疫霉根腐病菌生理小種鑒定技術(shù)規(guī)程的術(shù)語(yǔ)和定義、接種前準(zhǔn)備、接種體制備、鑒別寄主的培育、接種、病情調(diào)查、生理小種鑒定、滅活、建立鑒定檔案。本文件適用于大豆疫霉根腐病菌生理小種的室內(nèi)鑒定與評(píng)價(jià)。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB5084農(nóng)田灌溉水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)NY/T496肥料合理使用準(zhǔn)則通則NY/T2114大豆疫霉病菌檢疫檢測(cè)與鑒定方法3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1下胚軸傷口接種大豆生長(zhǎng)至真葉完全展開后，用滅菌解剖刀在大豆苗下胚軸處輕劃1個(gè)傷口（寬度不超過(guò)莖粗1/3、長(zhǎng)度1cm左右），將接種體貼于傷口處。4接種前準(zhǔn)備4.1蛭石的滅菌新蛭石經(jīng)121℃濕熱滅菌2h。4.2鑒別寄主準(zhǔn)備國(guó)際通用的大豆疫霉根腐病菌生理小種8個(gè)鑒別寄主為Harlon（Rps1aHarosoy13XX（Rps1bWilliams79（Rps1cPI103091（Rps1dWilliams82（Rps1kChapman（Rps3aHarosoy62XX（Rps6）和Harosoy（Rps7），以Sloan（rps）為感病對(duì)照。5接種體制備5.1病樣的采集2DB2301/T151—2023在大豆疫霉根腐病發(fā)生或流行時(shí)期，采集具有典型癥狀的大豆疫霉根腐病病株莖部，用滅菌后牛皮紙袋帶回實(shí)驗(yàn)室，并將采樣信息錄入大豆疫霉根腐病田間病樣采集信息表（見附錄A表A.1）。5.2培養(yǎng)基V8培養(yǎng)基：100mlV8汁，去離子水900ml,碳酸鈣0.2g，瓊脂粉15g～20g，121℃滅菌20min。5.3病原菌分離純化將采回的新鮮病組織用自來(lái)水沖洗干凈，75%乙醇溶液浸泡30s～40s后取出，無(wú)菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干表面水分，并在次氯酸鈉消毒液中浸泡3min，再用滅菌濾紙吸干表面水分，用滅菌解剖刀切取0.5cm2大小的病健交界處組織置于V8培養(yǎng)基上進(jìn)行分離培養(yǎng)，在培養(yǎng)皿上注明菌株編號(hào)、培養(yǎng)日期。25℃培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)3d～5d后，取菌落邊緣菌絲10×10倍顯微鏡下觀察，若菌絲無(wú)隔，直角分支，平均寬3.5μm，產(chǎn)生球形菌絲膨大體（平均直徑23μm）和同宗配合卵孢子（直徑30μm～35μm在水中產(chǎn)生無(wú)乳突、不脫落、倒m），則認(rèn)定為該菌絲為大豆疫霉根腐病菌。無(wú)法判斷的，按照NY/T2114的規(guī)定進(jìn)行PCR檢測(cè)。將目標(biāo)菌落轉(zhuǎn)移至V8培養(yǎng)基上純化4次～6次。5.4病原菌保存挑取大豆疫霉根腐病菌菌落邊緣的菌絲體，置于V8培養(yǎng)基試管斜面上，25℃恒溫下黑暗培養(yǎng)7d，當(dāng)試管斜面培養(yǎng)基長(zhǎng)滿菌絲后，置于10℃~17℃冰箱中保存（3個(gè)月～4個(gè)月傳代一次）或-80℃冰箱長(zhǎng)期保存。5.5接種體的制備將供試菌株置于V8培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上，25℃恒溫下黑暗培養(yǎng)8d，用滅菌解剖刀將含有大豆疫霉根腐病菌菌絲的培養(yǎng)基切成小方塊（3mm×3mm）。接種體在接種當(dāng)天制備。6鑒別寄主的培育將8個(gè)鑒別寄主和感病品種的種子播種于9cm×12.5cm×12.5cm（底徑×高×口徑）的盆缽中，以滅菌蛭石做為基質(zhì)，播種量為15粒/盆，出苗后間苗至10株/盆，3次重復(fù)/處理，播種后置于18℃~26℃的日光溫室中培養(yǎng)。肥料的使用按NY/T496的規(guī)定執(zhí)行、灌溉水質(zhì)按GB5084的規(guī)定執(zhí)行。7接種7.1接種時(shí)間大豆真葉期。7.2接種方法下胚軸傷口接種法。7.3接種后管理DB2301/T151—20233將人工接種后的大豆苗置于相對(duì)濕度90%以上、溫度為20℃~25℃環(huán)境48h后，轉(zhuǎn)入20℃~30℃溫室正常管理，保持土壤含水量達(dá)到70%～80%。8病情調(diào)查8.1調(diào)查時(shí)間接種后5d～7d進(jìn)行病情調(diào)查。8.2調(diào)查方法按照附錄B中規(guī)定的鑒別寄主對(duì)大豆疫霉根腐病菌生理小種反應(yīng)類型進(jìn)行調(diào)查記載。8.3無(wú)效數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定若某菌株對(duì)某鑒別寄主出現(xiàn)“中間類型（IRT）”反應(yīng)，或某菌株對(duì)所有鑒別寄主無(wú)致病力，則不能定類群，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或不計(jì)結(jié)果。9生理小種鑒定調(diào)查供試菌株與8個(gè)鑒別寄主互作反應(yīng)結(jié)果，列出感病互作中Rps基因，即為該菌株致病型。按照大豆疫霉根腐病菌55個(gè)國(guó)際通用的生理小種表（見附錄C）確定生理小種。將接種鑒定的接種體、基質(zhì)等在121℃經(jīng)20min滅活處理，將生理小種鑒定后的病株集中焚燒處理，用于栽培應(yīng)用的盆缽80℃水浴處理2h以上。11建立鑒定檔案建立鑒定檔案，內(nèi)容包括大豆疫霉根腐病樣品采集、接種前準(zhǔn)備、鑒別寄主培育、接種、調(diào)查、生理小種鑒定、滅活及建立鑒定檔案。檔案保存3年以上，建檔備查。DB2301/T151—20234（資料性）大豆疫霉根腐病田間病樣采集信息表A.1大豆疫霉根腐病田間病樣采集信息表見表A.1。表A.1大豆疫霉根腐病田間病樣采集信息表1234DB2301/T151—20235（規(guī)范性）鑒別寄主對(duì)大豆疫霉根腐病菌生理小種反應(yīng)類型B.1鑒別寄主對(duì)大豆疫霉根腐病菌生理小種反應(yīng)類型見表B.1。表B.1鑒別寄主對(duì)大豆疫霉根腐病菌生理小種反應(yīng)類型1