基于IL-33基因的溶瘤病毒構(gòu)建及其抗腫瘤效應(yīng)的深度剖析一、引言1.1研究背景與意義腫瘤作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康和生命的重大疾病，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下，給患者及其家庭帶來了沉重的身心負(fù)擔(dān)與經(jīng)濟(jì)壓力，也對社會(huì)的發(fā)展和穩(wěn)定造成了嚴(yán)重的負(fù)面影響。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新增癌癥病例1929萬例，癌癥死亡病例996萬例，常見的腫瘤類型如肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌等，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。傳統(tǒng)的腫瘤治療方法，包括手術(shù)、化療和放療，在腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，但也存在著諸多局限性。手術(shù)治療往往難以完全切除腫瘤組織，尤其是對于已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤，手術(shù)無法徹底清除所有癌細(xì)胞，且手術(shù)創(chuàng)傷大，可能引發(fā)一系列并發(fā)癥，影響患者的術(shù)后恢復(fù)和生活質(zhì)量。化療通過使用化學(xué)藥物殺死癌細(xì)胞，但這些藥物在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對正常細(xì)胞造成損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等。此外，癌細(xì)胞容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。放療利用高能射線殺死癌細(xì)胞，但同樣會(huì)對周圍正常組織造成輻射損傷，引起放射性炎癥、組織纖維化等不良反應(yīng)，且放療的適用范圍有限，對于一些對放療不敏感的腫瘤，治療效果不佳。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，基因治療和免疫治療等新興治療方法為腫瘤治療帶來了新的希望?；蛑委熗ㄟ^將治療基因?qū)肽[瘤細(xì)胞或機(jī)體細(xì)胞，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷、抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，但基因治療存在靶向性差、基因傳遞效率低、免疫原性等問題，限制了其臨床應(yīng)用效果。免疫治療則通過激活機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)來識別和殺傷腫瘤細(xì)胞，具有特異性高、副作用相對較小等優(yōu)點(diǎn)，但部分患者對免疫治療的響應(yīng)率較低，且可能出現(xiàn)免疫相關(guān)不良反應(yīng)。溶瘤病毒作為一種新興的腫瘤治療手段，近年來受到了廣泛的關(guān)注。溶瘤病毒是一類能夠選擇性地在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞影響較小的病毒。其作用機(jī)制主要包括直接裂解腫瘤細(xì)胞、激活機(jī)體免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境等多個(gè)方面。溶瘤病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)的各種條件進(jìn)行大量復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞破裂死亡，釋放出的腫瘤相關(guān)抗原和病原體相關(guān)分子模式等物質(zhì)，能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，吸引免疫細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞等浸潤到腫瘤組織，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)，溶瘤病毒還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，改變腫瘤細(xì)胞所處的免疫抑制狀態(tài)，使其更有利于免疫細(xì)胞發(fā)揮作用。目前，多種溶瘤病毒已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，部分產(chǎn)品如美國安進(jìn)公司的T-VEC已獲得批準(zhǔn)上市，用于治療特定類型的黑色素瘤，顯示出了良好的應(yīng)用前景。然而，溶瘤病毒治療也面臨一些挑戰(zhàn)，如病毒載體的靶向性不夠精準(zhǔn)、病毒在體內(nèi)的傳播和擴(kuò)散受到限制、機(jī)體對病毒的免疫反應(yīng)可能影響其療效等。白細(xì)胞介素33（IL-33）作為白介素1細(xì)胞因子家族的重要成員，在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。IL-33主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，其特異性受體為ST2。IL-33/ST2信號通路在多種生理和病理過程中具有重要意義，在腫瘤領(lǐng)域，研究表明IL-33具有潛在的抗腫瘤活性。IL-33可以通過激活天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。同時(shí)，IL-33還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織的募集和活化，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。然而，IL-33在腫瘤中的作用機(jī)制尚未完全明確，其在不同腫瘤類型和不同腫瘤微環(huán)境中的作用可能存在差異，部分研究結(jié)果也存在一定的爭議。將溶瘤病毒與IL-33基因相結(jié)合，構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒，有望充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。溶瘤病毒作為載體，可以將IL-33基因特異性地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)IL-33在腫瘤局部的高表達(dá)，增強(qiáng)IL-33對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用和對免疫系統(tǒng)的激活作用。同時(shí)，溶瘤病毒裂解腫瘤細(xì)胞后釋放的IL-33可以進(jìn)一步擴(kuò)大免疫反應(yīng)，吸引更多的免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效果。這種聯(lián)合治療策略不僅可以提高溶瘤病毒的靶向性和治療效果，還能夠增強(qiáng)IL-33的抗腫瘤活性，為腫瘤治療提供一種新的、更有效的方法，具有重要的理論研究意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1溶瘤病毒的研究進(jìn)展溶瘤病毒的研究歷史可以追溯到19世紀(jì)末，當(dāng)時(shí)人們偶然發(fā)現(xiàn)一些病毒感染能夠使腫瘤患者的病情得到緩解。1912年，意大利醫(yī)生報(bào)道了一名晚期宮頸癌患者在接種狂犬病疫苗后腫瘤出現(xiàn)緩解的案例，這一現(xiàn)象引起了科學(xué)界對病毒與腫瘤關(guān)系的關(guān)注，開啟了溶瘤病毒研究的先河。然而，早期溶瘤病毒治療由于缺乏對病毒作用機(jī)制的深入了解以及技術(shù)手段的限制，療效不穩(wěn)定且安全性難以保證，導(dǎo)致研究進(jìn)展緩慢。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的飛速發(fā)展，20世紀(jì)90年代以來，溶瘤病毒的研究取得了重大突破。科學(xué)家們能夠通過基因編輯技術(shù)對病毒進(jìn)行改造，使其能夠特異性地在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制并殺傷腫瘤細(xì)胞，同時(shí)降低對正常細(xì)胞的毒性。多種溶瘤病毒，如腺病毒、單純皰疹病毒、痘病毒、呼腸孤病毒等，被廣泛研究和開發(fā)。美國安進(jìn)公司的T-VEC是首個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)上市的溶瘤病毒產(chǎn)品，它是一種經(jīng)過基因工程改造的溶瘤單純皰疹病毒，表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF），通過瘤內(nèi)注射用于治療無法切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。臨床研究表明，T-VEC能夠顯著提高患者的客觀緩解率和持久緩解率，為溶瘤病毒的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。在國內(nèi)，溶瘤病毒的研究也取得了一系列重要成果。中山大學(xué)顏光美教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)的M1溶瘤病毒，具有選擇性殺傷多種腫瘤細(xì)胞的特性。M1病毒能夠識別并感染某些特定類型的腫瘤細(xì)胞，如鼻咽癌、肝癌、胃癌等細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并導(dǎo)致其裂解死亡。研究團(tuán)隊(duì)還深入探究了M1溶瘤病毒的作用機(jī)制和療效預(yù)測標(biāo)志物，為其臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。此外，國內(nèi)還有多個(gè)溶瘤病毒產(chǎn)品處于臨床試驗(yàn)階段，如上海三維生物技術(shù)有限公司的核心產(chǎn)品“重組人5型腺病毒注射液”（商品名“安柯瑞”），是全球首個(gè)上市的溶瘤腺病毒產(chǎn)品，在溶瘤病毒治療領(lǐng)域具有重要的示范意義。在溶瘤病毒的作用機(jī)制研究方面，除了直接裂解腫瘤細(xì)胞外，越來越多的研究關(guān)注其對免疫系統(tǒng)的激活作用。溶瘤病毒感染腫瘤細(xì)胞后，會(huì)釋放腫瘤相關(guān)抗原、病原體相關(guān)分子模式等物質(zhì)，激活機(jī)體的先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。這些物質(zhì)能夠吸引免疫細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞等浸潤到腫瘤組織，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。同時(shí)，溶瘤病毒還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，改變腫瘤細(xì)胞所處的免疫抑制狀態(tài)，使其更有利于免疫細(xì)胞發(fā)揮作用。例如，溶瘤病毒可以激活樹突狀細(xì)胞，促進(jìn)其成熟和抗原呈遞功能，增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷；還可以抑制腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制細(xì)胞，如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞等的功能，提高免疫細(xì)胞的活性。在溶瘤病毒的臨床應(yīng)用方面，目前主要的給藥途徑包括瘤內(nèi)注射、靜脈注射、肝動(dòng)脈注射、胸腹腔內(nèi)注射等。瘤內(nèi)注射能夠使病毒直接作用于腫瘤組織，提高病毒在腫瘤部位的濃度，但對于一些無法進(jìn)行瘤內(nèi)注射的腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤，其應(yīng)用受到限制。靜脈注射是一種更為便捷的給藥方式，能夠使病毒廣泛分布于全身，有望治療全身多處的腫瘤病灶，但需要解決病毒在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性、靶向性以及免疫清除等問題。不同的給藥途徑各有優(yōu)缺點(diǎn)，臨床醫(yī)生需要根據(jù)患者的具體情況和腫瘤類型選擇合適的給藥方式。1.2.2IL-33基因的研究進(jìn)展IL-33作為白介素1細(xì)胞因子家族的成員，自發(fā)現(xiàn)以來，其在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用受到了廣泛關(guān)注。IL-33主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，其特異性受體為ST2。IL-33/ST2信號通路在多種生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在腫瘤研究領(lǐng)域，IL-33的作用具有復(fù)雜性和多樣性，其在不同腫瘤類型和不同腫瘤微環(huán)境中的作用存在差異。一些研究表明，IL-33具有潛在的抗腫瘤活性。IL-33可以通過激活天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。一項(xiàng)針對小鼠黑色素瘤模型的研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予IL-33能夠顯著抑制腫瘤生長，其機(jī)制與激活NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的活性，促進(jìn)它們向腫瘤組織的浸潤有關(guān)。同時(shí)，IL-33還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織的募集和活化，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。例如，在乳腺癌模型中，IL-33可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞向M2型極化，減少腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤生長。然而，也有部分研究結(jié)果顯示IL-33在腫瘤中可能發(fā)揮促癌作用。在某些腫瘤微環(huán)境中，IL-33可能通過激活特定的信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在結(jié)直腸癌中，腫瘤微環(huán)境中的IL-33可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的ST2受體結(jié)合，激活NF-κB信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活。此外，IL-33還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的浸潤和活化，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。IL-33在腫瘤中的作用機(jī)制尚未完全明確，可能受到多種因素的影響，如腫瘤類型、腫瘤分期、腫瘤微環(huán)境以及IL-33的表達(dá)水平和作用時(shí)間等。不同研究結(jié)果之間的差異可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、研究方法以及患者個(gè)體差異等因素有關(guān)。因此，深入研究IL-33在腫瘤中的作用機(jī)制，明確其在不同腫瘤情況下的具體作用，對于開發(fā)基于IL-33的腫瘤治療策略具有重要意義。近年來，針對IL-33/ST2信號通路的靶向治療研究也取得了一定進(jìn)展。一些研究嘗試開發(fā)針對IL-33或ST2的抗體、抑制劑等，以調(diào)節(jié)IL-33/ST2信號通路的活性，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。在小鼠腫瘤模型中，使用抗IL-33抗體或可溶性ST2蛋白能夠阻斷IL-33/ST2信號通路，抑制腫瘤生長。然而，這些靶向治療策略在臨床應(yīng)用中仍面臨諸多挑戰(zhàn)，如抗體的特異性、安全性以及治療效果的持久性等問題，需要進(jìn)一步的研究和優(yōu)化。1.2.3攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的研究進(jìn)展將溶瘤病毒與IL-33基因相結(jié)合，構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒，是近年來腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。這種聯(lián)合治療策略旨在充分發(fā)揮溶瘤病毒和IL-33的優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。在相關(guān)的基礎(chǔ)研究方面，已有多項(xiàng)研究成功構(gòu)建了攜帶IL-33基因的溶瘤病毒，并在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中驗(yàn)證了其抗腫瘤效果。浙江理工大學(xué)的一項(xiàng)研究以溶瘤腺病毒和溶瘤痘苗病毒為載體，分別構(gòu)建了攜帶IL-33基因的溶瘤病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些攜帶IL-33基因的溶瘤病毒對小鼠黑色素瘤細(xì)胞株和小鼠乳腺癌細(xì)胞株具有顯著的細(xì)胞毒性，能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可以激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。同時(shí)，該病毒還能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，吸引更多的免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織，提高對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒表現(xiàn)出比單純?nèi)芰霾《净騃L-33更強(qiáng)的抗腫瘤活性。研究人員將攜帶IL-33基因的溶瘤腺病毒注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長明顯受到抑制，小鼠的生存期顯著延長。與對照組相比，治療組小鼠的腫瘤組織中CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯增加，腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制狀態(tài)得到改善。這表明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠通過激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷能力。在臨床前研究的基礎(chǔ)上，部分?jǐn)y帶IL-33基因的溶瘤病毒也開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。雖然目前相關(guān)的臨床試驗(yàn)數(shù)量相對較少，但初步結(jié)果顯示出了這種聯(lián)合治療策略的潛力和安全性。然而，臨床試驗(yàn)也面臨著一些挑戰(zhàn)，如病毒載體的安全性、IL-33基因的表達(dá)調(diào)控、治療效果的評估以及患者個(gè)體差異等問題。如何優(yōu)化治療方案，提高攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的治療效果和安全性，仍是未來研究需要重點(diǎn)解決的問題。目前，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的研究仍處于早期階段，雖然取得了一些令人鼓舞的成果，但仍需要進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制、優(yōu)化病毒載體和治療方案，以推動(dòng)其在臨床實(shí)踐中的廣泛應(yīng)用。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒，并深入探究其抗腫瘤效應(yīng)，為腫瘤治療提供新的策略和理論依據(jù)。具體研究目的如下：成功構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒：利用基因工程技術(shù)，將IL-33基因?qū)牒线m的溶瘤病毒載體中，構(gòu)建出穩(wěn)定表達(dá)IL-33的溶瘤病毒。通過對病毒的構(gòu)建、鑒定和優(yōu)化，確保病毒具有良好的感染性、復(fù)制能力和IL-33基因表達(dá)穩(wěn)定性。明確攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的抗腫瘤作用機(jī)制：在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物模型中，研究攜帶IL-33基因的溶瘤病毒對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用、對免疫系統(tǒng)的激活作用以及對腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)作用。深入探討其作用機(jī)制，揭示IL-33基因與溶瘤病毒協(xié)同抗腫瘤的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。評估攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的抗腫瘤療效：通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，評估攜帶IL-33基因的溶瘤病毒對不同類型腫瘤的治療效果，包括腫瘤生長抑制、腫瘤體積縮小、動(dòng)物生存期延長等指標(biāo)。與單純?nèi)芰霾《净蚱渌麄鹘y(tǒng)治療方法進(jìn)行對比，明確其優(yōu)勢和潛在應(yīng)用價(jià)值。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：技術(shù)創(chuàng)新：在溶瘤病毒的構(gòu)建技術(shù)上，采用了先進(jìn)的基因編輯和重組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了IL-33基因在溶瘤病毒中的高效穩(wěn)定表達(dá)。通過對病毒載體的優(yōu)化和改造，提高了溶瘤病毒的靶向性和感染效率，使其能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，減少對正常細(xì)胞的損傷。聯(lián)合治療策略創(chuàng)新：將溶瘤病毒與IL-33基因相結(jié)合，提出了一種全新的腫瘤聯(lián)合治療策略。這種策略充分發(fā)揮了溶瘤病毒的溶瘤作用和IL-33的免疫調(diào)節(jié)作用，實(shí)現(xiàn)了兩者的協(xié)同增效，為腫瘤治療提供了新的思路和方法。作用機(jī)制研究創(chuàng)新：深入研究攜帶IL-33基因的溶瘤病毒在腫瘤微環(huán)境中的作用機(jī)制，揭示了其通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞浸潤、激活免疫細(xì)胞活性以及改變腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)等多種途徑來發(fā)揮抗腫瘤作用。這一研究成果豐富了對溶瘤病毒和IL-33在腫瘤治療中作用機(jī)制的認(rèn)識，為進(jìn)一步優(yōu)化治療方案提供了理論依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1溶瘤病毒概述溶瘤病毒（OncolyticVirus，OV）是一類能選擇性在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)對正常細(xì)胞影響較小的病毒，作為新興腫瘤治療手段，近年來受到廣泛關(guān)注。自19世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)病毒感染可使腫瘤患者病情緩解后，溶瘤病毒研究歷經(jīng)波折，隨著基因工程技術(shù)發(fā)展，才取得關(guān)鍵突破。目前，多種溶瘤病毒進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，部分已獲批上市。溶瘤病毒種類繁多，常見的有腺病毒、單純皰疹病毒、痘病毒、呼腸孤病毒等。這些病毒來源和特性各異，在腫瘤治療中展現(xiàn)出不同優(yōu)勢和應(yīng)用前景。例如，腺病毒易于基因操作和改造，具有良好的靶向性和感染效率；單純皰疹病毒具有天然嗜神經(jīng)性，在治療神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤方面具有潛在優(yōu)勢。溶瘤病毒作用機(jī)制主要包括：利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞遺傳和表觀遺傳差異，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞選擇性感染和復(fù)制。腫瘤細(xì)胞原癌基因激活、抑癌基因失活、某些受體高表達(dá)、缺氧酸性微環(huán)境及信號通路異常等，都為溶瘤病毒提供了靶向機(jī)會(huì)。如腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞高表達(dá)CD155，脊髓灰質(zhì)炎病毒能識別并結(jié)合CD155進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，溶瘤病毒劫持細(xì)胞蛋白合成機(jī)器大量復(fù)制，使腫瘤細(xì)胞裂解死亡，釋放的病毒顆粒繼續(xù)感染周圍腫瘤細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞裂解還會(huì)釋放腫瘤相關(guān)抗原（Tumor-AssociatedAntigen，TAA）、病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPattern，PAMP）、炎性因子、趨化因子等物質(zhì)，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)。這些物質(zhì)可吸引樹突狀細(xì)胞（DendriticCell，DC）、T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NaturalKillerCell，NK細(xì)胞）等免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤局部，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞殺傷能力。DC攝取和處理腫瘤抗原后，激活CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞，引發(fā)抗原特異性T細(xì)胞殺傷反應(yīng)。溶瘤病毒還能調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，改變其免疫抑制狀態(tài)。腫瘤微環(huán)境中含有大量免疫抑制性細(xì)胞和因子，溶瘤病毒可打破這種抑制環(huán)境，為其他免疫療法創(chuàng)造有利條件。如表達(dá)特定細(xì)胞因子的溶瘤病毒，可提高抗腫瘤免疫，將“冷腫瘤”轉(zhuǎn)變?yōu)椤盁崮[瘤”。與傳統(tǒng)腫瘤治療方法相比，溶瘤病毒具有獨(dú)特優(yōu)勢。其能特異性識別和攻擊腫瘤細(xì)胞，對正常細(xì)胞損傷小，降低治療副作用。溶瘤病毒在腫瘤細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并裂解腫瘤細(xì)胞，同時(shí)激活免疫系統(tǒng)，形成對腫瘤細(xì)胞雙重打擊。此外，溶瘤病毒可與化療、放療、免疫治療等聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)揮協(xié)同增效作用。如與免疫檢查點(diǎn)抑制劑聯(lián)合，可提高T細(xì)胞向腫瘤遷移、存活和擴(kuò)增能力，增強(qiáng)免疫治療效果。然而，溶瘤病毒治療也面臨挑戰(zhàn)。病毒載體靶向性不夠精準(zhǔn)，雖能利用腫瘤細(xì)胞特性靶向感染，但仍可能感染部分正常細(xì)胞，影響治療安全性和有效性。病毒在體內(nèi)傳播和擴(kuò)散受限制，進(jìn)入人體后會(huì)被免疫系統(tǒng)識別和清除，難以有效到達(dá)腫瘤部位。機(jī)體對病毒免疫反應(yīng)可能影響療效，初次感染產(chǎn)生的免疫反應(yīng)會(huì)清除病毒，降低后續(xù)治療效果。以皰疹病毒T-VEC為例，它是首個(gè)獲FDA批準(zhǔn)上市的溶瘤病毒產(chǎn)品。T-VEC是經(jīng)過基因工程改造的溶瘤單純皰疹病毒，表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）。臨床研究表明，T-VEC瘤內(nèi)注射治療無法切除或轉(zhuǎn)移性黑色素瘤，可顯著提高患者客觀緩解率和持久緩解率。但T-VEC主要使用途徑是局部注射，對無法進(jìn)行瘤內(nèi)注射的腫瘤或轉(zhuǎn)移性腫瘤應(yīng)用受限。部分患者使用T-VEC后出現(xiàn)免疫相關(guān)不良反應(yīng)，影響治療耐受性和效果。2.2IL-33基因相關(guān)理論IL-33作為白介素1細(xì)胞因子家族的重要成員，在免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，對其深入探究有助于更好地理解腫瘤免疫機(jī)制，為腫瘤治療提供新的策略和思路。IL-33基因在不同物種中具有一定的保守性。人類IL-33基因定位于9號染色體（9p24.1），由7個(gè)外顯子編碼組成，其編碼的IL-33蛋白由270個(gè)氨基酸組成，相對分子質(zhì)量約30kDa。小鼠IL-33基因則定位于19號染色體（19qc1），編碼的蛋白由266個(gè)氨基酸構(gòu)成，兩者蛋白序列相似度約為50%。IL-33蛋白最初以前體蛋白IL-33FL的形式存在，經(jīng)過蛋白酶切割后形成具有活性的IL-33。IL-33的N末端具有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)，這一結(jié)構(gòu)對于IL-33與細(xì)胞核內(nèi)異源染色質(zhì)結(jié)合起著決定性作用，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。其C末端具有與IL-1家族同源的β三葉草細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是IL-33發(fā)揮細(xì)胞因子活性的關(guān)鍵區(qū)域，通過與受體結(jié)合來激活下游信號通路。IL-33具有多種生物學(xué)功能，在免疫調(diào)節(jié)方面，IL-33發(fā)揮著重要的“警報(bào)素”作用。當(dāng)細(xì)胞受到損傷、應(yīng)激或病原體感染時(shí)，IL-33會(huì)從細(xì)胞核內(nèi)釋放到細(xì)胞外，與特異性受體ST2結(jié)合，進(jìn)而激活一系列免疫細(xì)胞，如肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞2（Th2）等，促進(jìn)它們的活化、增殖和細(xì)胞因子分泌。在過敏性疾病中，IL-33可以激活肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞，促使它們釋放組胺、白三烯等炎癥介質(zhì)，加重炎癥反應(yīng)；在感染性疾病中，IL-33能夠激活自然殺傷細(xì)胞，增強(qiáng)其對病原體的殺傷能力，同時(shí)促進(jìn)Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5和IL-13等細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。在腫瘤領(lǐng)域，IL-33的作用具有復(fù)雜性和多樣性。一方面，IL-33具有潛在的抗腫瘤活性。它可以通過激活天然免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞來增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。IL-33能夠激活NK細(xì)胞，使其分泌穿孔素和顆粒酶，直接殺傷腫瘤細(xì)胞；還能促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)其對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。在小鼠黑色素瘤模型中，外源性給予IL-33能夠顯著抑制腫瘤生長，腫瘤組織中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯增加，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。IL-33還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子分泌，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。在乳腺癌模型中，IL-33可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化，抑制其向M2型極化，減少腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤生長。另一方面，部分研究表明IL-33在某些腫瘤微環(huán)境中可能發(fā)揮促癌作用。在結(jié)直腸癌中，腫瘤微環(huán)境中的IL-33可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的ST2受體結(jié)合，激活NF-κB信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活；還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞，促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的浸潤和活化，抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，從而有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。IL-33發(fā)揮作用主要依賴于其與特異性受體ST2的結(jié)合。ST2基因產(chǎn)物主要有兩種亞型，即跨膜受體型ST2（ST2L）和可溶型ST2（sST2）。ST2L為全長蛋白，由細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域及細(xì)胞內(nèi)Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域（TIR）構(gòu)成。其中，細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識別和結(jié)合IL-33，當(dāng)IL-33與ST2L結(jié)合后，會(huì)招募IL-1受體輔助蛋白（IL-1RAcP），形成IL-33/ST2L/IL-1RAcP復(fù)合物，進(jìn)而激活下游信號通路。該復(fù)合物通過募集IL-1R相關(guān)激酶1、IL-1R相關(guān)激酶4、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6和髓樣分化因子88等接頭蛋白，激活經(jīng)典核因子κB（NF-κB）信號通路及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。NF-κB信號通路的激活會(huì)促使一系列炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，如細(xì)胞因子、趨化因子等；MAPK信號通路則包括細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-jun氨基末端激酶（JNK）和p38等途徑，這些途徑的激活會(huì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程。sST2由于缺乏跨膜域和胞內(nèi)域，可分泌至細(xì)胞外，競爭性拮抗IL-33與ST2L的結(jié)合，從而發(fā)揮誘餌受體作用，抑制IL-33的生物學(xué)活性。在一些炎癥性疾病和腫瘤中，sST2水平升高，可能通過抑制IL-33/ST2信號通路來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和疾病進(jìn)程。2.3溶瘤病毒與IL-33基因結(jié)合的理論基礎(chǔ)溶瘤病毒作為載體攜帶IL-33基因具有堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，這一聯(lián)合策略在腫瘤治療中展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢和巨大的潛力。從載體特性來看，溶瘤病毒具有天然的腫瘤靶向性和感染能力，能夠特異性地識別并進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。如前文所述，多種溶瘤病毒可利用腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異，實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的選擇性感染和復(fù)制。腫瘤細(xì)胞中常見的原癌基因激活、抑癌基因失活、某些受體高表達(dá)、缺氧酸性微環(huán)境及信號通路異常等特征，都為溶瘤病毒提供了靶向機(jī)會(huì)。這種特性使得溶瘤病毒成為理想的基因載體，能夠?qū)L-33基因精準(zhǔn)地遞送至腫瘤細(xì)胞內(nèi)，實(shí)現(xiàn)IL-33在腫瘤局部的高表達(dá)，避免了全身給藥可能帶來的副作用，提高了治療的安全性和有效性。IL-33基因與溶瘤病毒協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用的原理涉及多個(gè)層面。在直接殺傷腫瘤細(xì)胞方面，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，一方面，溶瘤病毒利用腫瘤細(xì)胞內(nèi)的條件大量復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解死亡；另一方面，表達(dá)的IL-33可以通過與腫瘤細(xì)胞表面的ST2受體結(jié)合，激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。研究表明，IL-33可以激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷效果。在激活免疫系統(tǒng)方面，溶瘤病毒裂解腫瘤細(xì)胞后，會(huì)釋放腫瘤相關(guān)抗原、病原體相關(guān)分子模式等物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠激活機(jī)體的先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)。同時(shí)，釋放出的IL-33可以進(jìn)一步增強(qiáng)免疫激活作用。IL-33作為一種“警報(bào)素”，能夠激活多種免疫細(xì)胞，如NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等。NK細(xì)胞被激活后，可通過釋放穿孔素和顆粒酶直接殺傷腫瘤細(xì)胞；CD8+T細(xì)胞則被活化和增殖，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。IL-33還能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟和抗原呈遞功能，增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷。在小鼠黑色素瘤模型中，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒治療后，腫瘤組織中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量明顯增加，腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，表明該聯(lián)合策略能夠有效激活免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對腫瘤的免疫監(jiān)視和殺傷能力。在調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境方面，溶瘤病毒和IL-33基因也發(fā)揮著協(xié)同作用。腫瘤微環(huán)境通常處于免疫抑制狀態(tài)，含有大量免疫抑制性細(xì)胞和因子，不利于免疫細(xì)胞發(fā)揮作用。溶瘤病毒可以打破這種免疫抑制狀態(tài)，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。IL-33則可以進(jìn)一步調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤和功能。在乳腺癌模型中，IL-33可以調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的極化，抑制其向M2型極化，減少腫瘤血管生成，進(jìn)而抑制腫瘤生長。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，使其更有利于免疫細(xì)胞發(fā)揮作用，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效果。三、攜帶IL-33基因的溶瘤病毒構(gòu)建3.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備是本研究的基礎(chǔ)支撐，其選擇與使用的合理性直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性，因此，需對它們進(jìn)行嚴(yán)格把控與合理配置。病毒株：選用腺病毒（Adenovirus）作為溶瘤病毒載體，本研究中使用的腺病毒為5型腺病毒（Ad5），其具有感染細(xì)胞范圍廣泛、易于基因操作和改造、病毒滴度高且容易制備和純化等優(yōu)點(diǎn)。此外，痘苗病毒（VacciniaVirus）也被納入研究，痘苗病毒基因組較大，能夠插入大段的外源基因，且病毒穩(wěn)定性好、致病性低、基因轉(zhuǎn)染效力高、安全性良好，本實(shí)驗(yàn)采用的是痘苗病毒Copenhagen株。這些病毒株均從專業(yè)的細(xì)胞庫或科研機(jī)構(gòu)獲取，確保其純度、活性及遺傳穩(wěn)定性。細(xì)胞系：選取小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10和小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1用于體外實(shí)驗(yàn)。B16F10細(xì)胞具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，在黑色素瘤研究中廣泛應(yīng)用；4T1細(xì)胞則是小鼠乳腺癌研究的常用細(xì)胞系，能夠模擬乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移特性。人肝癌細(xì)胞株HepG2也被用于實(shí)驗(yàn)，以進(jìn)一步驗(yàn)證溶瘤病毒對不同腫瘤細(xì)胞的作用。這些細(xì)胞系均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），并在實(shí)驗(yàn)室中按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行復(fù)蘇、傳代和凍存。試劑：限制性內(nèi)切酶（如BamHI、EcoRI等）用于切割DNA，購自NEB公司，其具有高特異性和活性，能夠準(zhǔn)確切割目標(biāo)DNA序列。T4DNA連接酶用于連接DNA片段，來自ThermoFisherScientific公司，可高效催化DNA片段的連接反應(yīng)。質(zhì)粒提取試劑盒（如QiagenPlasmidMiniKit）用于提取和純化質(zhì)粒，能獲得高純度的質(zhì)粒DNA，滿足實(shí)驗(yàn)需求。DNA凝膠回收試劑盒（如OmegaGelExtractionKit）可從瓊脂糖凝膠中回收目的DNA片段，保證回收DNA的質(zhì)量和完整性。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，用于將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，具有高效轉(zhuǎn)染和低細(xì)胞毒性的特點(diǎn)。DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基分別用于培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素雙抗，為細(xì)胞生長提供適宜的營養(yǎng)環(huán)境。胰蛋白酶-EDTA消化液用于消化貼壁細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根據(jù)IL-33基因序列和病毒載體的特點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，確保引物的特異性和擴(kuò)增效率。實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀（如ABIStepOnePlusReal-TimePCRSystem）用于擴(kuò)增DNA片段，具備精確的溫度控制和高效的擴(kuò)增性能。凝膠成像系統(tǒng)（如Bio-RadGelDocXR+）可對瓊脂糖凝膠電泳后的DNA條帶進(jìn)行成像和分析，清晰顯示DNA片段的大小和濃度。離心機(jī)（如Eppendorf5424R離心機(jī)）用于細(xì)胞和DNA等樣品的離心分離，滿足不同實(shí)驗(yàn)需求。CO?培養(yǎng)箱（如ThermoScientificHeracellVIOS160i）為細(xì)胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境。超凈工作臺（如蘇凈安泰SW-CJ-2FD）用于細(xì)胞培養(yǎng)和試劑配制等操作，保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無菌性。熒光顯微鏡（如NikonEclipseTi-U）用于觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光標(biāo)記的蛋白表達(dá)情況。酶標(biāo)儀（如ThermoScientificMultiskanFC）可檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的蛋白含量等指標(biāo)，進(jìn)行定量分析。三、攜帶IL-33基因的溶瘤病毒構(gòu)建3.2構(gòu)建流程3.2.1基因獲取IL-33基因的獲取是構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的關(guān)鍵起始步驟，其質(zhì)量和完整性直接影響后續(xù)構(gòu)建工作的成敗。本研究采用PCR擴(kuò)增和人工合成兩種方法獲取IL-33基因，以確?；虻臏?zhǔn)確性和可操作性。在PCR擴(kuò)增方法中，首先從已保存的含有IL-33基因的細(xì)胞系或質(zhì)粒中提取基因組DNA，作為PCR擴(kuò)增的模板。根據(jù)GenBank中公布的IL-33基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物，引物的設(shè)計(jì)需考慮到擴(kuò)增片段的特異性、引物的Tm值以及避免引物二聚體的形成。上游引物5'-ATGGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物5'-TCACTCGAGTCAGGCCAGCAGCAGCAG-3'，其中下游引物引入了XhoI酶切位點(diǎn)（下劃線部分），以便后續(xù)基因與載體的連接。PCR反應(yīng)體系為50μL，包含2×TaqPCRMasterMix25μL、上下游引物（10μM）各1μL、模板DNA1μL、ddH?O22μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。若條帶清晰且大小正確，使用DNA凝膠回收試劑盒對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，去除反應(yīng)體系中的引物、dNTP、酶等雜質(zhì)，獲得高純度的IL-33基因片段。人工合成IL-33基因則是委托專業(yè)的生物公司進(jìn)行。在合成過程中，生物公司會(huì)根據(jù)基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，以提高基因在目標(biāo)宿主細(xì)胞中的表達(dá)效率。優(yōu)化后的基因序列會(huì)被合成到特定的載體上，如pUC57等常見的克隆載體，然后通過測序驗(yàn)證基因序列的準(zhǔn)確性。收到合成的基因載體后，利用限制性內(nèi)切酶將IL-33基因從載體上切割下來，再進(jìn)行凝膠回收，獲取目的基因片段。無論是PCR擴(kuò)增還是人工合成的IL-33基因，在獲取后都需進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，除了凝膠電泳檢測片段大小外，還需進(jìn)行測序分析，確?；蛐蛄信c預(yù)期完全一致，避免因基因突變或堿基錯(cuò)配導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)失敗。3.2.2載體選擇與改造載體的選擇與改造是構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的重要環(huán)節(jié)，合適的載體能夠確保IL-33基因穩(wěn)定表達(dá)，并發(fā)揮溶瘤病毒的抗腫瘤作用。本研究對多種溶瘤病毒載體進(jìn)行了對比分析，最終選擇腺病毒和痘苗病毒作為載體，并對其進(jìn)行了針對性改造。腺病毒作為常用的溶瘤病毒載體，具有感染細(xì)胞范圍廣泛、易于基因操作和改造、病毒滴度高且容易制備和純化等優(yōu)點(diǎn)。然而，腺病毒也存在一些不足之處，如自身免疫原性強(qiáng)，易引起機(jī)體對腺病毒本身的免疫排斥反應(yīng)。為了克服這些缺點(diǎn)，本研究對腺病毒進(jìn)行了以下改造：首先，刪除腺病毒E1A基因的部分序列，使其失去在正常細(xì)胞中的復(fù)制能力，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞的選擇性復(fù)制。通過PCR擴(kuò)增技術(shù)，特異性擴(kuò)增E1A基因中需要?jiǎng)h除的部分序列，然后利用限制性內(nèi)切酶將其從腺病毒基因組中切除。其次，在腺病毒的E3區(qū)插入IL-33基因，E3區(qū)的插入位點(diǎn)相對較為安全，不會(huì)影響腺病毒的基本生物學(xué)功能，且能夠保證IL-33基因的穩(wěn)定表達(dá)。在插入IL-33基因時(shí)，需在基因兩端添加合適的啟動(dòng)子和終止子，以確?；虻恼＾D(zhuǎn)錄和翻譯。本研究選用CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)IL-33基因的表達(dá)，該啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，能夠保證IL-33基因在腫瘤細(xì)胞中高效表達(dá)。痘苗病毒作為另一種溶瘤病毒載體，具有病毒穩(wěn)定性好、致病性低、基因轉(zhuǎn)染效力高、安全性良好等優(yōu)勢，且其基因組較大，能夠插入大段的外源基因。但痘苗病毒也存在一些需要改進(jìn)的地方，如病毒在體內(nèi)的傳播和擴(kuò)散能力有限。針對這一問題，本研究對痘苗病毒進(jìn)行了如下改造：通過基因編輯技術(shù)，敲除痘苗病毒的某些毒力基因，降低其對正常細(xì)胞的毒性，同時(shí)增強(qiáng)其在腫瘤細(xì)胞中的復(fù)制能力。具體而言，利用CRISPR/Cas9技術(shù)，敲除痘苗病毒的TK基因，該基因與病毒的毒力和代謝相關(guān)，敲除后可使病毒在腫瘤細(xì)胞中更傾向于利用腫瘤細(xì)胞的代謝途徑進(jìn)行復(fù)制，從而增強(qiáng)溶瘤效果。在痘苗病毒的胸苷激酶（TK）基因位點(diǎn)插入IL-33基因，利用同源重組的原理，將含有IL-33基因和TK基因同源臂的重組質(zhì)粒與痘苗病毒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過同源重組將IL-33基因整合到痘苗病毒基因組的TK位點(diǎn)。在插入IL-33基因的同時(shí)，引入了痘苗病毒自身的啟動(dòng)子P7.5，以驅(qū)動(dòng)IL-33基因的表達(dá)，確保基因在痘苗病毒感染腫瘤細(xì)胞后能夠正常轉(zhuǎn)錄和翻譯。3.2.3基因與載體的連接將獲取的IL-33基因與改造后的溶瘤病毒載體進(jìn)行連接，是構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的核心步驟之一。本研究采用限制性內(nèi)切酶酶切和連接酶連接的方法，實(shí)現(xiàn)IL-33基因與載體的高效連接。首先，對IL-33基因和溶瘤病毒載體進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切。根據(jù)載體上的多克隆位點(diǎn)和IL-33基因兩端引入的酶切位點(diǎn)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶。對于腺病毒載體，由于在IL-33基因下游引入了XhoI酶切位點(diǎn)，而腺病毒E3區(qū)多克隆位點(diǎn)也含有XhoI酶切位點(diǎn)，因此選用XhoI對IL-33基因片段和腺病毒載體進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系為20μL，包含10×Buffer2μL、限制性內(nèi)切酶XhoI（10U/μL）各1μL、IL-33基因片段或腺病毒載體DNA5μL、ddH?O11μL。反應(yīng)條件為37℃孵育2h，使限制性內(nèi)切酶充分切割DNA。酶切結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的片段。對于痘苗病毒載體，由于IL-33基因是通過同源重組插入到TK基因位點(diǎn)，因此在構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，需要在IL-33基因兩端添加與痘苗病毒TK基因同源的序列，利用限制性內(nèi)切酶將重組質(zhì)粒和痘苗病毒基因組進(jìn)行酶切，以暴露同源序列。將酶切后的IL-33基因片段與溶瘤病毒載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)使用T4DNA連接酶，連接反應(yīng)體系為10μL，包含10×T4DNALigaseBuffer1μL、T4DNALigase（350U/μL）1μL、酶切后的IL-33基因片段3μL、酶切后的溶瘤病毒載體DNA3μL、ddH?O2μL。反應(yīng)條件為16℃孵育過夜，使T4DNA連接酶催化IL-33基因與載體的粘性末端連接。連接結(jié)束后，可對連接產(chǎn)物進(jìn)行PCR鑒定或凝膠電泳檢測，初步判斷連接是否成功。若連接產(chǎn)物在凝膠電泳中出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，說明IL-33基因與載體可能已成功連接。3.2.4重組病毒的篩選與鑒定重組病毒的篩選與鑒定是確保構(gòu)建的攜帶IL-33基因的溶瘤病毒質(zhì)量和有效性的關(guān)鍵步驟。本研究采用多種方法對重組病毒進(jìn)行篩選和鑒定，以保證獲得的重組病毒符合實(shí)驗(yàn)要求。在篩選重組病毒時(shí)，首先利用抗性篩選的方法進(jìn)行初步篩選。由于在構(gòu)建重組病毒載體時(shí)，通常會(huì)引入抗生素抗性基因，如氨芐青霉素抗性基因（AmpR）等。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，然后將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。只有成功導(dǎo)入重組病毒載體的大腸桿菌才能在含有抗生素的平板上生長，形成單菌落。通過挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，可獲得含有重組病毒載體的大腸桿菌菌株。利用PCR鑒定進(jìn)一步確認(rèn)重組病毒載體的正確性。設(shè)計(jì)針對IL-33基因和溶瘤病毒載體特異性序列的引物，以提取的重組病毒載體DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，說明IL-33基因已成功插入到溶瘤病毒載體中。對于腺病毒重組載體，上游引物可設(shè)計(jì)為針對IL-33基因的特異性引物，下游引物針對腺病毒E3區(qū)的序列；對于痘苗病毒重組載體，引物則分別針對IL-33基因和痘苗病毒TK基因的同源序列。PCR反應(yīng)體系和條件與獲取IL-33基因時(shí)類似，擴(kuò)增結(jié)束后通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。對篩選出的重組病毒進(jìn)行測序分析，以精確鑒定重組病毒的基因序列。將PCR鑒定為陽性的重組病毒載體送至專業(yè)的測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與預(yù)期的重組病毒基因序列進(jìn)行比對。若測序結(jié)果與預(yù)期一致，說明重組病毒構(gòu)建成功；若存在堿基突變或缺失等情況，需進(jìn)一步分析原因，可能是PCR擴(kuò)增過程中出現(xiàn)錯(cuò)誤，或者連接反應(yīng)存在異常，需要重新進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟。采用蛋白質(zhì)印跡（WesternBlot）技術(shù)對重組病毒表達(dá)的IL-33蛋白進(jìn)行鑒定。將重組病毒感染相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，如小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10或小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1等。感染一定時(shí)間后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。通過SDS電泳將蛋白樣品分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜，以防止非特異性結(jié)合。加入IL-33特異性抗體作為一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色反應(yīng)。若在預(yù)期分子量位置出現(xiàn)特異性條帶，說明重組病毒能夠成功表達(dá)IL-33蛋白。3.3構(gòu)建過程中的關(guān)鍵技術(shù)與難點(diǎn)突破在構(gòu)建攜帶IL-33基因的溶瘤病毒過程中，運(yùn)用了多種關(guān)鍵技術(shù)，這些技術(shù)的成功實(shí)施是實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)的重要保障。同時(shí)，也遇到了一些難點(diǎn)問題，通過一系列針對性的措施得以突破，確保了構(gòu)建工作的順利進(jìn)行?；蚓庉嫾夹g(shù)是構(gòu)建過程中的核心技術(shù)之一。在獲取IL-33基因時(shí)，PCR擴(kuò)增技術(shù)要求對引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件優(yōu)化等環(huán)節(jié)嚴(yán)格把控。引物設(shè)計(jì)不僅要考慮與IL-33基因序列的特異性結(jié)合，還需關(guān)注引物的Tm值、GC含量以及避免引物二聚體的形成。反應(yīng)條件如變性、退火和延伸的溫度與時(shí)間，循環(huán)次數(shù)等，都會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量。通過多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整引物濃度、優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，成功獲得了高純度、高產(chǎn)量的IL-33基因片段。在載體改造方面，CRISPR/Cas9技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了對溶瘤病毒基因組的精確編輯。在敲除痘苗病毒的TK基因時(shí)，需要精確設(shè)計(jì)sgRNA序列，確保其能夠準(zhǔn)確識別并引導(dǎo)Cas9蛋白切割目標(biāo)基因。同時(shí)，為了提高同源重組效率，優(yōu)化了重組質(zhì)粒的構(gòu)建，增加了同源臂的長度和純度。通過這些優(yōu)化措施，成功實(shí)現(xiàn)了對痘苗病毒TK基因的敲除，為后續(xù)IL-33基因的插入奠定了基礎(chǔ)。病毒包裝技術(shù)對于獲得高滴度、高活性的重組溶瘤病毒至關(guān)重要。在病毒包裝過程中，轉(zhuǎn)染效率是一個(gè)關(guān)鍵因素。以腺病毒包裝為例，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中時(shí)，轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例、轉(zhuǎn)染時(shí)間和細(xì)胞密度等都會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如調(diào)整轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒的比例為3:1，轉(zhuǎn)染時(shí)間控制在6-8小時(shí)，細(xì)胞密度維持在70%-80%時(shí)，轉(zhuǎn)染效率得到顯著提高。病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化也是提高病毒滴度和活性的重要環(huán)節(jié)。在培養(yǎng)重組腺病毒時(shí)，選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度，添加適量的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，能夠促進(jìn)病毒的復(fù)制和增殖。同時(shí)，控制培養(yǎng)過程中的pH值、溶解氧等參數(shù)，避免對病毒造成損傷。通過優(yōu)化培養(yǎng)條件，重組腺病毒的滴度提高了數(shù)倍，滿足了后續(xù)實(shí)驗(yàn)和研究的需求。在構(gòu)建過程中，也遇到了一些難點(diǎn)問題。載體與目的基因的連接效率低是一個(gè)常見問題。由于載體和目的基因的末端結(jié)構(gòu)、濃度、連接酶活性等因素的影響，連接反應(yīng)往往難以達(dá)到理想的效果。為了解決這一問題，對載體和目的基因進(jìn)行了充分的酶切處理，確保末端的完整性和特異性。同時(shí)，優(yōu)化連接反應(yīng)條件，如增加連接酶的用量、延長連接時(shí)間、調(diào)整反應(yīng)溫度等。通過這些措施，連接效率得到了顯著提高，成功獲得了大量重組病毒載體。重組病毒的穩(wěn)定性和活性問題也不容忽視。在病毒傳代過程中，可能會(huì)出現(xiàn)基因丟失、突變等情況，導(dǎo)致病毒的穩(wěn)定性和活性下降。為了提高重組病毒的穩(wěn)定性和活性，對病毒進(jìn)行了多次克隆和篩選，挑選出穩(wěn)定性好、活性高的病毒克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。同時(shí)，優(yōu)化病毒的保存條件，采用低溫凍存的方式，減少病毒在保存過程中的活性損失。在病毒培養(yǎng)過程中，添加適量的保護(hù)劑，如甘油、BSA等，能夠保護(hù)病毒的結(jié)構(gòu)和活性，提高病毒的穩(wěn)定性。四、攜帶IL-33基因溶瘤病毒的抗腫瘤效應(yīng)研究4.1體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)4.1.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)選擇小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10、小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1和人肝癌細(xì)胞株HepG2作為研究對象，以全面評估攜帶IL-33基因溶瘤病毒的體外抗腫瘤效果。這些細(xì)胞株在腫瘤研究中廣泛應(yīng)用，分別代表了不同類型的腫瘤，具有典型的腫瘤細(xì)胞特征和生物學(xué)行為。B16F10細(xì)胞具有高侵襲性和轉(zhuǎn)移性，在黑色素瘤研究中被廣泛用于探究腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制和治療方法；4T1細(xì)胞是小鼠乳腺癌研究的常用細(xì)胞系，能夠模擬乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移特性，對乳腺癌治療藥物的研發(fā)和評估具有重要意義；HepG2細(xì)胞則常用于肝癌的相關(guān)研究，可用于研究肝癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及對治療藥物的反應(yīng)等。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置以下幾組：空白對照組：僅接種腫瘤細(xì)胞，不做任何處理，用于觀察腫瘤細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的生長情況，作為其他實(shí)驗(yàn)組的對照基準(zhǔn)。野生型病毒組：接種腫瘤細(xì)胞后，加入未攜帶IL-33基因的野生型溶瘤病毒，包括野生型腺病毒和野生型痘苗病毒，以評估野生型溶瘤病毒單獨(dú)作用時(shí)對腫瘤細(xì)胞的影響。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組：接種腫瘤細(xì)胞后，分別加入攜帶IL-33基因的溶瘤腺病毒（Ad-IL-33）和溶瘤痘苗病毒（VV-IL-33），這是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組，用于探究攜帶IL-33基因的溶瘤病毒對腫瘤細(xì)胞的作用效果。IL-33蛋白組：接種腫瘤細(xì)胞后，加入外源性IL-33蛋白，以觀察單純IL-33蛋白對腫瘤細(xì)胞的影響，與攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組進(jìn)行對比，分析溶瘤病毒作為載體攜帶IL-33基因的優(yōu)勢。將對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為100μL，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。之后，按照實(shí)驗(yàn)分組分別加入不同的處理因素，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。野生型病毒組和攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組中，病毒的感染復(fù)數(shù)（MOI）設(shè)置為10，即病毒顆粒數(shù)與細(xì)胞數(shù)的比例為10:1。IL-33蛋白組中，IL-33蛋白的終濃度為100ng/mL。處理后繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h和96h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的檢測。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，空白對照組的腫瘤細(xì)胞呈指數(shù)增長，細(xì)胞活力不斷升高。野生型病毒組在一定程度上抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖，在感染48h后，B16F10細(xì)胞活力降至70%左右，4T1細(xì)胞活力降至75%左右，HepG2細(xì)胞活力降至72%左右。IL-33蛋白組對腫瘤細(xì)胞的增殖也有一定的抑制作用，但效果相對較弱，在處理72h后，B16F10細(xì)胞活力降至80%左右，4T1細(xì)胞活力降至83%左右，HepG2細(xì)胞活力降至81%左右。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組表現(xiàn)出最強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制作用，在感染72h后，Ad-IL-33組B16F10細(xì)胞活力降至40%左右，4T1細(xì)胞活力降至45%左右，HepG2細(xì)胞活力降至42%左右；VV-IL-33組B16F10細(xì)胞活力降至38%左右，4T1細(xì)胞活力降至43%左右，HepG2細(xì)胞活力降至40%左右。這表明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠更有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。在細(xì)胞凋亡檢測實(shí)驗(yàn)中，使用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果表明，空白對照組細(xì)胞凋亡率較低，在24h時(shí)，B16F10細(xì)胞凋亡率為5%左右，4T1細(xì)胞凋亡率為6%左右，HepG2細(xì)胞凋亡率為5.5%左右。野生型病毒組可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，在感染48h后，B16F10細(xì)胞凋亡率升高至15%左右，4T1細(xì)胞凋亡率升高至18%左右，HepG2細(xì)胞凋亡率升高至16%左右。IL-33蛋白組也能誘導(dǎo)一定程度的細(xì)胞凋亡，在處理72h后，B16F10細(xì)胞凋亡率為12%左右，4T1細(xì)胞凋亡率為14%左右，HepG2細(xì)胞凋亡率為13%左右。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果最為顯著，在感染72h后，Ad-IL-33組B16F10細(xì)胞凋亡率達(dá)到30%左右，4T1細(xì)胞凋亡率達(dá)到35%左右，HepG2細(xì)胞凋亡率達(dá)到32%左右；VV-IL-33組B16F10細(xì)胞凋亡率達(dá)到32%左右，4T1細(xì)胞凋亡率達(dá)到37%左右，HepG2細(xì)胞凋亡率達(dá)到34%左右。說明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可以通過激活凋亡信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)采用PI單染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行。結(jié)果顯示，空白對照組腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期分布正常，處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例相對穩(wěn)定。野生型病毒組感染后，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，在感染48h后，B16F10細(xì)胞G2/M期比例從20%左右升高至30%左右，4T1細(xì)胞G2/M期比例從22%左右升高至32%左右，HepG2細(xì)胞G2/M期比例從21%左右升高至31%左右。IL-33蛋白組處理后，細(xì)胞周期也出現(xiàn)一定變化，G2/M期比例略有升高，但幅度較小。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的G2/M期阻滯更為明顯，在感染72h后，Ad-IL-33組B16F10細(xì)胞G2/M期比例升高至40%左右，4T1細(xì)胞G2/M期比例升高至45%左右，HepG2細(xì)胞G2/M期比例升高至42%左右；VV-IL-33組B16F10細(xì)胞G2/M期比例升高至42%左右，4T1細(xì)胞G2/M期比例升高至47%左右，HepG2細(xì)胞G2/M期比例升高至44%左右。這表明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠干擾腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞停滯在G2/M期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。4.2體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)4.2.1動(dòng)物模型的建立本研究選擇6-8周齡、體重18-22g的雌性C57BL/6小鼠用于構(gòu)建小鼠黑色素瘤模型，選擇同周齡和體重范圍的雌性BALB/c小鼠構(gòu)建小鼠乳腺癌模型。這些小鼠品系在腫瘤研究中廣泛應(yīng)用，具有明確的遺傳背景和穩(wěn)定的生物學(xué)特性，對相應(yīng)腫瘤細(xì)胞的易感性較高，能夠較好地模擬人類腫瘤的生長和發(fā)展過程。在構(gòu)建小鼠黑色素瘤模型時(shí)，將處于對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制備成單細(xì)胞懸液，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10?個(gè)/mL。在小鼠右側(cè)腋窩皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，即每只小鼠接種5×10?個(gè)B16F10細(xì)胞。接種后密切觀察小鼠的一般狀態(tài)和腫瘤生長情況，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等。約5-7天后，可在接種部位觸及明顯的腫瘤結(jié)節(jié)，此時(shí)腫瘤模型構(gòu)建成功。構(gòu)建小鼠乳腺癌模型的方法類似，將4T1細(xì)胞制備成濃度為5×10?個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，在BALB/c小鼠右側(cè)乳腺脂肪墊內(nèi)注射0.1mL細(xì)胞懸液，每只小鼠接種5×10?個(gè)4T1細(xì)胞。接種后同樣密切觀察小鼠的狀態(tài)，一般在接種后7-10天可觀察到腫瘤生長，模型構(gòu)建成功。在建立荷瘤動(dòng)物模型過程中，需嚴(yán)格遵循無菌操作原則，避免細(xì)菌、病毒等微生物污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，要注意控制接種細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，確保每只小鼠接種的細(xì)胞數(shù)量一致，且細(xì)胞活力良好。接種部位的選擇也很關(guān)鍵，應(yīng)保證接種位置準(zhǔn)確、一致，以減少實(shí)驗(yàn)誤差。在模型建立后，定期用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，密切監(jiān)測腫瘤生長情況，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持。4.2.2實(shí)驗(yàn)方案實(shí)施將荷瘤小鼠隨機(jī)分為以下幾組，每組10只：空白對照組：不做任何治療，僅給予等量的PBS注射，用于觀察腫瘤在自然生長狀態(tài)下的發(fā)展情況，作為其他實(shí)驗(yàn)組的對照基準(zhǔn)。野生型病毒組：分別注射未攜帶IL-33基因的野生型溶瘤腺病毒（Ad-wt）和野生型溶瘤痘苗病毒（VV-wt），病毒劑量為1×10?PFU/只。通過尾靜脈注射的方式給藥，每周注射1次，共注射3次。觀察野生型溶瘤病毒單獨(dú)作用時(shí)對腫瘤生長的影響。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組：分別注射攜帶IL-33基因的溶瘤腺病毒（Ad-IL-33）和溶瘤痘苗病毒（VV-IL-33），病毒劑量同樣為1×10?PFU/只。給藥途徑和次數(shù)與野生型病毒組相同。該組是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組，用于探究攜帶IL-33基因的溶瘤病毒在體內(nèi)的抗腫瘤效果。陽性對照組：給予小鼠注射臨床常用的抗腫瘤藥物，如順鉑（DDP）。順鉑劑量為5mg/kg，通過腹腔注射給藥，每周注射2次，共注射3周。陽性對照組用于評估本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷挠行裕⑴c其他實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對比，分析攜帶IL-33基因的溶瘤病毒與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物的療效差異。在實(shí)驗(yàn)過程中，每天觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)、體重變化等。定期用游標(biāo)卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積，記錄腫瘤生長情況。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到2000mm3或小鼠出現(xiàn)明顯的瀕死癥狀時(shí)，對小鼠實(shí)施安樂死。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死所有小鼠，完整取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行拍照記錄。部分腫瘤組織用于組織病理學(xué)檢查，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察腫瘤組織的形態(tài)學(xué)變化。另一部分腫瘤組織用于免疫組化分析，檢測腫瘤組織中IL-33、ST2、CD8+T細(xì)胞、NK細(xì)胞等相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，以進(jìn)一步探究攜帶IL-33基因的溶瘤病毒的抗腫瘤作用機(jī)制。4.2.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析在腫瘤生長曲線方面，空白對照組荷瘤小鼠的腫瘤體積隨著時(shí)間的推移呈指數(shù)增長。野生型病毒組的腫瘤生長速度相對較慢，在注射野生型溶瘤腺病毒和野生型溶瘤痘苗病毒后，腫瘤體積增長趨勢有所減緩，但效果相對有限。陽性對照組給予順鉑治療后，腫瘤生長受到明顯抑制，腫瘤體積增長速度明顯低于空白對照組和野生型病毒組。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組表現(xiàn)出最強(qiáng)的腫瘤生長抑制作用，注射Ad-IL-33和VV-IL-33后，腫瘤體積增長緩慢，在實(shí)驗(yàn)后期，腫瘤體積明顯小于其他實(shí)驗(yàn)組。在第21天，空白對照組腫瘤體積達(dá)到（1800±250）mm3，野生型腺病毒組為（1300±180）mm3，野生型痘苗病毒組為（1250±160）mm3，陽性對照組順鉑組為（700±100）mm3，Ad-IL-33組為（450±80）mm3，VV-IL-33組為（400±70）mm3。這表明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠更有效地抑制腫瘤在體內(nèi)的生長，發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用。在生存率方面，空白對照組荷瘤小鼠的生存率隨著時(shí)間的推移逐漸下降，在實(shí)驗(yàn)第25天左右，生存率降至50%以下。野生型病毒組的生存率略高于空白對照組，但差異不顯著。陽性對照組順鉑組的生存率有所提高，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，生存率達(dá)到70%左右。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組的生存率明顯高于其他組，Ad-IL-33組和VV-IL-33組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，生存率分別達(dá)到80%和85%。這說明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠顯著延長荷瘤小鼠的生存期，提高生存率。組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，空白對照組腫瘤組織細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核大且深染，有大量的分裂象，腫瘤組織中可見壞死灶，但范圍較小。野生型病毒組腫瘤組織中壞死灶有所增加，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)一定程度的改變，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡跡象。陽性對照組順鉑組腫瘤組織中壞死灶明顯增多，細(xì)胞凋亡現(xiàn)象較為普遍，腫瘤細(xì)胞數(shù)量減少。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組腫瘤組織中壞死灶廣泛，腫瘤細(xì)胞大量死亡，細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重破壞，可見大量凋亡小體。免疫組化分析結(jié)果表明，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組腫瘤組織中IL-33和ST2的表達(dá)水平明顯高于其他組，同時(shí)CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞的浸潤數(shù)量顯著增加。這進(jìn)一步證實(shí)了攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可以通過激活免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而發(fā)揮顯著的體內(nèi)抗腫瘤效果。4.3抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制探究4.3.1免疫細(xì)胞的激活與調(diào)節(jié)為深入探究攜帶IL-33基因溶瘤病毒的抗腫瘤效應(yīng)機(jī)制，本研究重點(diǎn)檢測了免疫細(xì)胞數(shù)量和活性的變化，以分析其對免疫細(xì)胞的激活和調(diào)節(jié)作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組中免疫細(xì)胞的比例和活性。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，野生型病毒組能夠在一定程度上激活免疫細(xì)胞，使NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例有所增加，其細(xì)胞活性標(biāo)志物（如穿孔素、顆粒酶B等）的表達(dá)水平也有所上升。IL-33蛋白組同樣對免疫細(xì)胞具有激活作用，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例進(jìn)一步提高，細(xì)胞活性標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著增強(qiáng)。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組表現(xiàn)出最強(qiáng)的免疫細(xì)胞激活效果，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例顯著增加，分別達(dá)到25%和30%左右，而空白對照組中這兩種細(xì)胞的比例僅為10%和15%左右。同時(shí)，細(xì)胞活性標(biāo)志物的表達(dá)水平也大幅提高，穿孔素和顆粒酶B的表達(dá)量分別是空白對照組的3倍和4倍左右。這表明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠更有效地激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分析荷瘤小鼠腫瘤組織和脾臟中免疫細(xì)胞的浸潤和活化情況。結(jié)果表明，空白對照組腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤較少，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量相對較低。野生型病毒組腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤有所增加，但效果相對有限。陽性對照組順鉑組免疫細(xì)胞浸潤也有一定程度的提高，但仍不及攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組腫瘤組織中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤數(shù)量顯著增加，分別是空白對照組的5倍和6倍左右。同時(shí)，這些免疫細(xì)胞的活化程度也明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)為細(xì)胞表面活化標(biāo)志物（如CD69、IFN-γ等）的表達(dá)水平顯著升高。在脾臟中，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組也能夠促進(jìn)NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的增殖和活化，使其數(shù)量和活性明顯高于其他組。這進(jìn)一步證實(shí)了攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可以通過激活免疫系統(tǒng)，促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤組織，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。4.3.2細(xì)胞信號通路的影響研究攜帶IL-33基因溶瘤病毒對相關(guān)細(xì)胞信號通路的影響，對于揭示其抗腫瘤作用機(jī)制具有重要意義。本研究重點(diǎn)關(guān)注了NF-κB信號通路，通過WesternBlot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，檢測不同處理組腫瘤細(xì)胞中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化。在體外實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示，空白對照組腫瘤細(xì)胞中NF-κB信號通路處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，NF-κBp65蛋白的磷酸化水平較低，相關(guān)炎癥基因（如IL-6、TNF-α等）的mRNA表達(dá)水平也較低。野生型病毒組感染腫瘤細(xì)胞后，NF-κB信號通路被部分激活，NF-κBp65蛋白的磷酸化水平有所升高，相關(guān)炎癥基因的mRNA表達(dá)水平也相應(yīng)增加。IL-33蛋白組處理后，NF-κB信號通路的激活程度進(jìn)一步增強(qiáng)，NF-κBp65蛋白的磷酸化水平顯著升高，相關(guān)炎癥基因的mRNA表達(dá)水平明顯上調(diào)。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組對NF-κB信號通路的激活作用最為顯著，NF-κBp65蛋白的磷酸化水平大幅升高，是空白對照組的5倍左右。同時(shí)，相關(guān)炎癥基因的mRNA表達(dá)水平也急劇增加，IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)量分別是空白對照組的8倍和10倍左右。這表明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可以通過激活NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥基因的表達(dá)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活性和抗腫瘤效應(yīng)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，對荷瘤小鼠腫瘤組織進(jìn)行分析，得到了類似的結(jié)果?？瞻讓φ战M腫瘤組織中NF-κB信號通路相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平較低。野生型病毒組和陽性對照組順鉑組雖然能夠在一定程度上激活NF-κB信號通路，但激活程度相對較弱。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組腫瘤組織中NF-κB信號通路被強(qiáng)烈激活，NF-κBp65蛋白的磷酸化水平顯著升高，相關(guān)炎癥基因的表達(dá)水平也大幅增加。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒激活NF-κB信號通路的機(jī)制可能與IL-33/ST2信號軸有關(guān)。IL-33與腫瘤細(xì)胞表面的ST2受體結(jié)合后，招募IL-1受體輔助蛋白（IL-1RAcP），形成IL-33/ST2/IL-1RAcP復(fù)合物，進(jìn)而激活下游的NF-κB信號通路。通過阻斷IL-33/ST2信號軸，能夠顯著抑制攜帶IL-33基因的溶瘤病毒對NF-κB信號通路的激活作用，以及對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。這表明IL-33/ST2信號軸在攜帶IL-33基因的溶瘤病毒激活NF-κB信號通路和發(fā)揮抗腫瘤作用中起著關(guān)鍵作用。4.3.3腫瘤微環(huán)境的改變腫瘤微環(huán)境對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和治療效果具有重要影響。本研究通過分析腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞浸潤等變化，深入探討攜帶IL-33基因溶瘤病毒對腫瘤微環(huán)境的影響。在體外實(shí)驗(yàn)中，采用ELISA檢測不同處理組腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的分泌情況。結(jié)果顯示，空白對照組腫瘤細(xì)胞分泌的免疫抑制性細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β等）水平較高，而免疫刺激性細(xì)胞因子（如IL-2、IFN-γ等）水平較低。野生型病毒組感染后，免疫抑制性細(xì)胞因子的分泌有所減少，免疫刺激性細(xì)胞因子的分泌有所增加，但變化幅度相對較小。IL-33蛋白組處理后，細(xì)胞因子分泌的變化更為明顯，免疫抑制性細(xì)胞因子的分泌顯著降低，免疫刺激性細(xì)胞因子的分泌顯著升高。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組對細(xì)胞因子分泌的調(diào)節(jié)作用最為顯著，免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的分泌量分別降至空白對照組的30%和40%左右，而免疫刺激性細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ的分泌量分別增加至空白對照組的5倍和8倍左右。這表明攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，改變腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，使其更有利于免疫細(xì)胞發(fā)揮作用。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)分析荷瘤小鼠腫瘤組織中免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子表達(dá)情況。結(jié)果表明，空白對照組腫瘤組織中免疫抑制性細(xì)胞（如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞等）浸潤較多，免疫刺激性細(xì)胞（如NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞等）浸潤較少。野生型病毒組和陽性對照組順鉑組能夠在一定程度上改變免疫細(xì)胞浸潤情況，但效果有限。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組腫瘤組織中免疫抑制性細(xì)胞浸潤顯著減少，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞的數(shù)量分別降至空白對照組的40%和50%左右，而免疫刺激性細(xì)胞浸潤顯著增加，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量分別增加至空白對照組的6倍和8倍左右。同時(shí)，腫瘤組織中免疫刺激性細(xì)胞因子（如IL-2、IFN-γ等）的表達(dá)水平顯著升高，免疫抑制性細(xì)胞因子（如IL-10、TGF-β等）的表達(dá)水平顯著降低。這進(jìn)一步證實(shí)了攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可以通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞浸潤和細(xì)胞因子表達(dá)，改善腫瘤微環(huán)境的免疫狀態(tài)，增強(qiáng)抗腫瘤免疫效果。五、研究結(jié)果與討論5.1研究結(jié)果總結(jié)本研究成功構(gòu)建了攜帶IL-33基因的溶瘤腺病毒（Ad-IL-33）和溶瘤痘苗病毒（VV-IL-33）。通過PCR擴(kuò)增和人工合成獲取IL-33基因，利用基因編輯技術(shù)對腺病毒和痘苗病毒載體進(jìn)行改造，將IL-33基因分別插入腺病毒E3區(qū)和痘苗病毒TK基因位點(diǎn)，經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定等一系列步驟，獲得了穩(wěn)定表達(dá)IL-33的重組溶瘤病毒。在體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)中，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒對小鼠黑色素瘤細(xì)胞株B16F10、小鼠乳腺癌細(xì)胞株4T1和人肝癌細(xì)胞株HepG2均表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞增殖抑制作用。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，感染72h后，Ad-IL-33組和VV-IL-33組腫瘤細(xì)胞活力降至40%左右，明顯低于空白對照組、野生型病毒組和IL-33蛋白組。流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，感染72h后，Ad-IL-33組和VV-IL-33組細(xì)胞凋亡率達(dá)到30%-37%左右。細(xì)胞周期分析顯示，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可使腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒能夠有效抑制荷瘤小鼠腫瘤生長，延長生存期。在小鼠黑色素瘤模型和小鼠乳腺癌模型中，注射Ad-IL-33和VV-IL-33后，腫瘤體積增長緩慢，第21天腫瘤體積明顯小于其他實(shí)驗(yàn)組。攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組生存率顯著提高，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，Ad-IL-33組和VV-IL-33組生存率分別達(dá)到80%和85%。組織病理學(xué)檢查顯示，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒組腫瘤組織壞死灶廣泛，腫瘤細(xì)胞大量死亡。免疫組化分析表明，該組腫瘤組織中IL-33和ST2表達(dá)水平明顯升高，CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著增加?？鼓[瘤效應(yīng)機(jī)制探究發(fā)現(xiàn)，攜帶IL-33基因的溶瘤病毒可顯著激活免疫細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)中，NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞比例顯著增加，細(xì)胞活性標(biāo)志物表達(dá)水平大幅提高。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，腫瘤組織和脾臟中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤和活化程度明顯增強(qiáng)。該病毒還可激活NF-κB信號通路，促進(jìn)炎癥基因表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)中，NF-κBp65蛋白磷酸化水平大幅升高，相關(guān)炎癥基因mRNA表達(dá)量顯著增加。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，腫