基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗：構(gòu)建策略與免疫原性深度剖析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1HPV18E6E7基因與癌癥關(guān)聯(lián)人乳頭瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，其家族龐大，目前已鑒定出超過200種亞型。根據(jù)其致癌性，可分為低危型和高危型，其中HPV16和HPV18是最為常見且致癌性最強(qiáng)的兩種高危亞型，在所有致癌HPV中，HPV16約占58％，HPV18約占12％。特別是HPV18，雖然在常見高危HPV中位居第二，卻具有更強(qiáng)的使上皮細(xì)胞永生化及惡性轉(zhuǎn)化能力，在宮頸腺癌中所占比例也高于HPV16。HPV18致癌過程中，E6和E7基因起著關(guān)鍵作用。E6基因編碼的E6蛋白，能夠與人體細(xì)胞內(nèi)重要的抑癌蛋白p53緊密結(jié)合。p53蛋白在正常細(xì)胞中肩負(fù)著調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等重要職責(zé)，可有效維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，防止細(xì)胞異常增殖。一旦E6蛋白與p53結(jié)合，便會(huì)促使p53蛋白發(fā)生降解，使其喪失正常功能，進(jìn)而破壞細(xì)胞對DNA損傷的應(yīng)答機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞生長失控，大大增加了細(xì)胞發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。E7基因編碼的E7蛋白，則主要作用于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（pRb）。pRb蛋白是細(xì)胞周期的重要調(diào)控因子，負(fù)責(zé)嚴(yán)格把控細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程，確保細(xì)胞周期正常有序進(jìn)行。當(dāng)E7蛋白與pRb結(jié)合后，pRb蛋白的活性被抑制，細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制遭到破壞，細(xì)胞得以繞過正常的檢測點(diǎn)，持續(xù)進(jìn)入增殖狀態(tài)，最終引發(fā)組織的異常增殖和癌變。高危型HPV的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要誘因。大多數(shù)HPV感染是暫時(shí)的，人體自身的免疫系統(tǒng)可在1-2年內(nèi)將其清除。然而，當(dāng)高危型HPV，如HPV18持續(xù)感染時(shí)，病毒的E6和E7基因會(huì)持續(xù)表達(dá)，不斷干擾細(xì)胞的正常生理功能，逐漸誘導(dǎo)宮頸上皮細(xì)胞發(fā)生異常增生、分化，從宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）逐漸發(fā)展為宮頸癌。從宮頸癌前病變發(fā)展到浸潤性宮頸癌通常需要數(shù)年甚至數(shù)十年的時(shí)間，這期間若能有效干預(yù)，阻斷病毒基因的作用，將為預(yù)防和治療宮頸癌帶來希望。除了宮頸癌，HPV18E6E7基因的異常表達(dá)還與其他多種癌癥的發(fā)生相關(guān)，如肛門癌、口咽癌等。在這些癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中，E6和E7蛋白同樣通過干擾細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號通路和調(diào)控機(jī)制，推動(dòng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。1.1.2治療性疫苗研發(fā)意義目前，針對HPV相關(guān)癌癥的治療手段主要包括手術(shù)、放療和化療。手術(shù)治療對于早期癌癥患者有較好的效果，但對于中晚期患者，手術(shù)往往難以徹底清除癌細(xì)胞，且可能對患者的生理功能和生活質(zhì)量造成較大影響。放療和化療雖能在一定程度上抑制癌細(xì)胞生長，但同時(shí)也會(huì)對正常細(xì)胞產(chǎn)生損傷，引發(fā)一系列嚴(yán)重的副作用，如骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)等，導(dǎo)致患者的免疫力下降，生活質(zhì)量嚴(yán)重降低。此外，這些傳統(tǒng)治療方法無法從根本上清除病毒感染，癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)較高。開發(fā)基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗具有重大意義，有望成為一種全新的、有效的癌癥治療策略。從補(bǔ)充現(xiàn)有治療手段角度來看，治療性疫苗可以激發(fā)機(jī)體自身的免疫系統(tǒng)，特異性地識別和清除被HPV18感染的細(xì)胞以及表達(dá)E6E7蛋白的癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)對癌癥的精準(zhǔn)打擊，彌補(bǔ)傳統(tǒng)治療方法在清除病毒和癌細(xì)胞方面的不足，與手術(shù)、放療、化療等傳統(tǒng)治療手段聯(lián)合使用時(shí)，能夠提高治療效果，降低癌癥的復(fù)發(fā)率。從降低癌癥發(fā)病率和死亡率層面分析，對于已經(jīng)感染HPV18但尚未發(fā)展為癌癥的人群，治療性疫苗可以有效清除病毒感染，阻止病情進(jìn)一步惡化，從而降低HPV18相關(guān)癌癥的發(fā)病率。對于癌癥患者，治療性疫苗能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。以宮頸癌為例，若能廣泛應(yīng)用基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗，將有可能顯著降低全球范圍內(nèi)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率，尤其是在發(fā)展中國家，這些地區(qū)由于醫(yī)療資源有限、篩查和預(yù)防措施不完善，宮頸癌的負(fù)擔(dān)更為沉重，治療性疫苗的應(yīng)用將帶來更大的益處。在癌癥防治領(lǐng)域，基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗為攻克HPV相關(guān)癌癥帶來了新的希望，其研發(fā)和應(yīng)用對于改善患者的健康狀況、減輕社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)具有不可估量的價(jià)值，值得深入研究和廣泛推廣。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1HPV18E6E7基因研究進(jìn)展在HPV18E6E7基因結(jié)構(gòu)研究方面，HPV18的E6基因長度約為500bp，E7基因長度約為400bp，二者緊密相連，共同構(gòu)成了病毒致癌的關(guān)鍵區(qū)域。其基因序列具有高度保守性，尤其是在與宿主細(xì)胞蛋白相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)。不同地區(qū)的HPV18E6E7基因雖存在一定程度的序列變異，但這些變異大多集中在非關(guān)鍵區(qū)域，對基因整體功能的影響較小。例如，在中國人群中，HPV18E6基因的某些位點(diǎn)存在單核苷酸多態(tài)性（SNP），但這些SNP并未改變E6蛋白與p53蛋白結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域，因而E6蛋白對p53蛋白的降解作用依然得以維持。功能研究表明，E6蛋白除了通過與p53蛋白結(jié)合促使其降解外，還能激活端粒酶，維持癌細(xì)胞染色體端粒的長度，使癌細(xì)胞獲得無限增殖能力。E7蛋白除干擾pRb蛋白的正常功能外，還能與其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如p21、p27等相互作用，進(jìn)一步擾亂細(xì)胞周期的調(diào)控。這些發(fā)現(xiàn)揭示了HPV18E6E7基因在細(xì)胞癌變過程中復(fù)雜的作用機(jī)制，為治療性疫苗的設(shè)計(jì)提供了更為精準(zhǔn)的靶點(diǎn)。HPV18E6E7基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制也是研究熱點(diǎn)之一。病毒自身的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件在E6E7基因轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。宿主細(xì)胞內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、Sp1等，也參與其中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如炎癥因子、紫外線照射等，這些轉(zhuǎn)錄因子的活性發(fā)生改變，進(jìn)而影響E6E7基因的表達(dá)水平。此外，DNA甲基化、組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機(jī)制在HPV18E6E7基因表達(dá)調(diào)控中也起著重要作用。在正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，HPV18E6E7基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，影響了轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子的結(jié)合能力，從而調(diào)控基因表達(dá)。對這些表達(dá)調(diào)控機(jī)制的深入了解，有助于開發(fā)新的治療策略，通過干擾基因表達(dá)來抑制癌細(xì)胞的生長。1.2.2治療性疫苗研究現(xiàn)狀國內(nèi)外基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗研發(fā)歷程豐富且成果顯著。早期的研究主要集中在蛋白疫苗領(lǐng)域，通過將HPV18E6E7蛋白或其片段直接作為抗原，注射到動(dòng)物模型或患者體內(nèi)，期望激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)。然而，由于蛋白抗原的免疫原性較弱，單獨(dú)使用時(shí)往往難以誘導(dǎo)出足夠強(qiáng)度的免疫應(yīng)答，治療效果有限。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，DNA疫苗成為研究熱點(diǎn)。DNA疫苗是將編碼HPV18E6E7抗原的基因直接導(dǎo)入機(jī)體細(xì)胞，使其在體內(nèi)表達(dá)抗原，從而激活免疫系統(tǒng)。例如，一些研究將HPV18E6E7基因克隆到真核表達(dá)載體中，通過肌肉注射、基因槍等方式導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示能夠誘導(dǎo)出特異性的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。但DNA疫苗也面臨一些挑戰(zhàn)，如基因?qū)胄实?、在體內(nèi)的持續(xù)表達(dá)時(shí)間有限以及可能引發(fā)的免疫耐受等問題。為克服DNA疫苗的不足，病毒載體疫苗應(yīng)運(yùn)而生。常用的病毒載體包括腺病毒、痘苗病毒、慢病毒等。這些病毒載體具有高效的基因傳遞能力，能夠?qū)PV18E6E7基因高效導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并持續(xù)表達(dá)抗原。以腺病毒載體疫苗為例，研究人員將HPV18E6E7基因插入腺病毒基因組中，構(gòu)建重組腺病毒疫苗。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和部分臨床試驗(yàn)中，該疫苗表現(xiàn)出良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，有效抑制腫瘤生長。然而，由于人體對腺病毒載體可能存在預(yù)存免疫，多次接種后可能會(huì)降低疫苗的效果。在臨床研究方面，多個(gè)基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。一些疫苗在早期臨床試驗(yàn)中展現(xiàn)出一定的安全性和有效性，能夠誘導(dǎo)患者產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，且不良反應(yīng)可控。例如，某款病毒載體疫苗在I期臨床試驗(yàn)中，對部分HPV18相關(guān)癌前病變患者進(jìn)行接種，結(jié)果顯示患者體內(nèi)的T細(xì)胞免疫活性顯著增強(qiáng)，病變組織出現(xiàn)不同程度的緩解。但在后續(xù)的大規(guī)模臨床試驗(yàn)中，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證其長期療效和安全性，以及與現(xiàn)有治療手段聯(lián)合使用的效果。目前，雖然治療性疫苗的研發(fā)取得了一定進(jìn)展，但距離廣泛應(yīng)用于臨床仍有一段距離，需要不斷優(yōu)化疫苗設(shè)計(jì)、提高免疫原性和安全性，以滿足臨床需求。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究旨在構(gòu)建一種高效且安全的基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗，并深入探究其免疫原性，為HPV18相關(guān)癌癥的治療提供新的策略和理論依據(jù)。具體而言，期望通過一系列實(shí)驗(yàn)操作，成功獲得能夠在體內(nèi)外高效表達(dá)HPV18E6E7抗原的治療性疫苗。這要求對疫苗的構(gòu)建過程進(jìn)行精細(xì)把控，從基因克隆、載體選擇到表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化等各個(gè)環(huán)節(jié)，都需確保疫苗的高效表達(dá)，以增強(qiáng)其免疫原性。同時(shí)，確定該治療性疫苗在動(dòng)物模型中的最佳免疫劑量和免疫方案。通過不同劑量和免疫程序的設(shè)置，觀察動(dòng)物機(jī)體的免疫反應(yīng)，包括細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答水平，篩選出能夠誘導(dǎo)最強(qiáng)免疫反應(yīng)且無明顯不良反應(yīng)的免疫劑量和方案，為后續(xù)臨床試驗(yàn)提供關(guān)鍵參考。在免疫原性研究方面，全面分析疫苗誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答類型和強(qiáng)度。通過檢測特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，如T細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子分泌等指標(biāo)，評估細(xì)胞免疫的效果；同時(shí)，測定血清中特異性抗體的水平，分析體液免疫的情況。此外，還需研究免疫記憶的形成和維持機(jī)制，了解疫苗免疫后機(jī)體對HPV18E6E7抗原的長期免疫記憶能力，為疫苗的長期有效性提供理論支持。最終，通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該治療性疫苗在體內(nèi)的抗腫瘤效果，觀察疫苗接種后對腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和動(dòng)物生存時(shí)間的影響，評估疫苗的治療潛力，為其臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。1.3.2研究內(nèi)容構(gòu)建基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗，首先需從HPV18陽性細(xì)胞或組織樣本中提取總DNA，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增HPV18E6E7基因片段。在引物設(shè)計(jì)上，需引入合適的酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)與表達(dá)載體連接。擴(kuò)增后的基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、回收純化，確?；蚱蔚耐暾院图兌?。將純化后的HPV18E6E7基因片段與經(jīng)過同樣酶切處理的表達(dá)載體，如質(zhì)粒pVAX1、腺病毒載體Ad5等進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)?；蛑亟M病毒載體。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌或通過其他合適的方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。對擴(kuò)增后的重組載體進(jìn)行提取和鑒定，采用酶切鑒定、PCR鑒定以及測序分析等方法，確保HPV18E6E7基因正確插入載體且序列無誤。將鑒定正確的重組表達(dá)載體在合適的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行表達(dá)，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)（如HEK293細(xì)胞）等。優(yōu)化表達(dá)條件，包括誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等，以提高疫苗抗原的表達(dá)量和表達(dá)質(zhì)量。對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，采用親和層析、離子交換層析等技術(shù)，去除雜質(zhì)和未表達(dá)的蛋白，獲得高純度的疫苗抗原。對構(gòu)建的治療性疫苗進(jìn)行優(yōu)化，在基因水平上，對HPV18E6E7基因進(jìn)行修飾，如密碼子優(yōu)化，根據(jù)宿主細(xì)胞的密碼子偏好性，對基因序列進(jìn)行優(yōu)化，提高基因的表達(dá)效率。引入免疫佐劑基因，如GM-CSF（粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）基因，增強(qiáng)疫苗的免疫原性。在載體方面，嘗試不同類型的載體，比較其在疫苗表達(dá)和免疫原性方面的差異，選擇最適合的載體。對載體的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等元件進(jìn)行優(yōu)化，提高載體的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)效率。在疫苗制備工藝上，探索不同的抗原制備方法和保存條件，研究抗原的穩(wěn)定性和活性，優(yōu)化疫苗的配方和劑型，如添加合適的保護(hù)劑、佐劑等，提高疫苗的穩(wěn)定性和免疫效果。免疫原性檢測，檢測指標(biāo)包括特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)，通過ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)）檢測疫苗免疫后機(jī)體產(chǎn)生的特異性T細(xì)胞數(shù)量和分泌的細(xì)胞因子，如IFN-γ（干擾素-γ）、IL-2（白細(xì)胞介素-2）等，評估細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。利用CFSE（羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯）標(biāo)記的T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，觀察T細(xì)胞在抗原刺激下的增殖能力。檢測特異性抗體水平，采用ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）方法測定血清中特異性抗體IgG的含量，分析抗體的滴度和親和力。通過中和試驗(yàn)，檢測抗體對HPV18E6E7蛋白的中和活性，評估體液免疫的效果。檢測方法方面，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，選取合適的動(dòng)物模型，如BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠等，在不同時(shí)間點(diǎn)采集血液和脾臟等組織樣本。對于血清樣本，采用ELISA方法檢測抗體水平；對于脾臟細(xì)胞，進(jìn)行ELISPOT和CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等檢測細(xì)胞免疫反應(yīng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，動(dòng)物分組上，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組接種基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗，對照組接種生理鹽水、空載體或其他對照疫苗。免疫程序上，設(shè)定不同的免疫劑量和免疫次數(shù)，如低劑量（10μg）、中劑量（50μg）、高劑量（100μg），免疫次數(shù)為2次、3次等，間隔一定時(shí)間進(jìn)行免疫。觀察指標(biāo)包括動(dòng)物的一般狀態(tài)，如體重、飲食、活動(dòng)等，記錄動(dòng)物在免疫過程中的不良反應(yīng)。定期檢測動(dòng)物體內(nèi)的免疫指標(biāo)，如上述的特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)和特異性抗體水平。在接種疫苗后，通過皮下注射HPV18E6E7陽性腫瘤細(xì)胞建立腫瘤模型，觀察腫瘤的生長情況，包括腫瘤體積、重量等，統(tǒng)計(jì)動(dòng)物的生存時(shí)間，評估疫苗的抗腫瘤效果。二、HPV18E6E7基因相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1HPV18概述2.1.1HPV18的生物學(xué)特性HPV18屬于乳頭瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，是一種無包膜的雙鏈環(huán)狀DNA病毒。其病毒顆粒呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約為55nm，由72個(gè)殼粒組成。這些殼粒由主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2構(gòu)成，L1蛋白在病毒顆粒表面形成五聚體結(jié)構(gòu)，是構(gòu)成病毒外殼的主要成分，對維持病毒的形態(tài)和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用；L2蛋白則位于病毒顆粒內(nèi)部，與病毒DNA緊密結(jié)合，在病毒感染和基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。HPV18的基因組長度約為7.9kb，包含多個(gè)開放閱讀框（ORFs），根據(jù)其功能可分為早期基因區(qū)（E區(qū)）和晚期基因區(qū)（L區(qū)），以及一個(gè)非編碼的長控制區(qū)（LCR）。早期基因區(qū)編碼E1、E2、E4、E5、E6、E7等蛋白，這些蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化等過程中發(fā)揮重要作用。其中，E1和E2蛋白主要參與病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控；E6和E7蛋白則是病毒的主要致癌蛋白，如前文所述，E6蛋白通過與p53蛋白結(jié)合促使其降解，E7蛋白通過與pRb蛋白結(jié)合干擾細(xì)胞周期調(diào)控，二者協(xié)同作用，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。晚期基因區(qū)編碼L1和L2蛋白，這兩種蛋白是病毒衣殼的組成成分，在病毒的組裝和釋放過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。長控制區(qū)包含多個(gè)順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，對病毒基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率起著重要的調(diào)控作用。HPV18的生活周期與上皮細(xì)胞的分化密切相關(guān)。病毒主要感染皮膚和黏膜上皮的基底細(xì)胞，當(dāng)基底細(xì)胞受到感染后，病毒基因組會(huì)隨著細(xì)胞的分裂而復(fù)制，并逐漸向上皮層遷移。在遷移過程中，隨著上皮細(xì)胞的分化，病毒基因的表達(dá)模式發(fā)生改變，早期基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)，晚期基因表達(dá)開始啟動(dòng)。在分化的上皮細(xì)胞中，病毒基因組大量復(fù)制，晚期基因大量表達(dá)，合成的L1和L2蛋白組裝成病毒衣殼，將復(fù)制的病毒基因組包裹其中，形成完整的病毒顆粒。最終，含有病毒顆粒的上皮細(xì)胞脫落，釋放出病毒，感染新的宿主細(xì)胞，完成病毒的生活周期。在某些情況下，HPV18的基因組可能會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中，導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，引發(fā)癌癥的發(fā)生。2.1.2HPV18的感染途徑與流行現(xiàn)狀HPV18的傳播途徑主要包括性傳播、母嬰傳播和間接接觸傳播。性傳播是HPV18最主要的傳播途徑，在性行為過程中，生殖器官、肛門、口腔等部位的黏膜直接接觸，使得病毒能夠輕易地在個(gè)體之間傳播。一項(xiàng)針對性活躍人群的研究表明，在HPV18感染病例中，約80%以上是通過性傳播感染的。多個(gè)性伴侶、過早開始性生活、不使用安全套等因素都會(huì)顯著增加HPV18的感染風(fēng)險(xiǎn)。母嬰傳播也是HPV18的一種傳播方式，感染HPV18的孕婦在分娩過程中，胎兒通過產(chǎn)道時(shí)可能會(huì)接觸到病毒，從而導(dǎo)致新生兒感染。雖然母嬰傳播的發(fā)生率相對較低，但對于新生兒的健康仍然存在潛在威脅。間接接觸傳播相對較為少見，主要是通過接觸被HPV18污染的物品，如毛巾、衣物、床上用品、公共浴室設(shè)施等而感染。但這種傳播方式需要滿足一定條件，如物品上存在足夠數(shù)量的病毒，且接觸者的皮膚或黏膜存在破損等。HPV18在全球范圍內(nèi)廣泛流行，是導(dǎo)致多種癌癥發(fā)生的重要因素之一。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，HPV18在所有高危型HPV感染中所占比例約為12%，在宮頸癌患者中，HPV18的感染率約為20%-30%。在不同地區(qū)，HPV18的流行情況存在一定差異。在歐美地區(qū)，HPV18是僅次于HPV16的第二大常見高危型HPV，在宮頸癌病例中所占比例較高。例如，在美國，HPV18在宮頸癌患者中的感染率約為25%。在亞洲地區(qū)，HPV18同樣是重要的高危型HPV之一。在中國，HPV18在宮頸癌患者中的感染率約為15%-20%，且呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。在一些發(fā)展中國家，由于衛(wèi)生條件相對較差、性健康教育不足、缺乏有效的篩查和預(yù)防措施等原因，HPV18的感染率可能更高，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率也相對較高。隨著時(shí)間的推移，HPV18的流行趨勢也在發(fā)生變化。近年來，隨著HPV疫苗的廣泛接種，一些國家和地區(qū)的HPV18感染率出現(xiàn)了下降趨勢。但同時(shí)，由于HPV18基因的變異以及人群行為習(xí)慣的改變等因素，部分地區(qū)也出現(xiàn)了HPV18感染的新特點(diǎn)和新趨勢，需要持續(xù)關(guān)注和深入研究。2.2E6E7基因的結(jié)構(gòu)與功能2.2.1E6E7基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)HPV18的E6基因全長約為500bp，其核苷酸序列具有高度保守性，在不同地區(qū)和人群的HPV18毒株中，E6基因序列的一致性高達(dá)95%以上。E6基因包含一個(gè)完整的開放閱讀框（ORF），起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA，編碼的E6蛋白由約150個(gè)氨基酸組成。對E6蛋白的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，其N端富含半胱氨酸殘基，這些半胱氨酸殘基能夠形成多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，對于E6蛋白與其他蛋白的相互作用至關(guān)重要。例如，E6蛋白通過其鋅指結(jié)構(gòu)與p53蛋白的特定區(qū)域結(jié)合，促使p53蛋白發(fā)生泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解。E6蛋白的C端則相對較為靈活，包含一些能夠與細(xì)胞內(nèi)其他信號分子相互作用的位點(diǎn)，參與調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。E7基因長度約為400bp，同樣具有一個(gè)開放閱讀框，起始密碼子也是ATG，終止密碼子為TGA，編碼的E7蛋白約由98個(gè)氨基酸組成。E7蛋白的氨基酸序列中含有多個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，其中最關(guān)鍵的是位于N端的LXCXE基序。這個(gè)基序能夠與pRb蛋白的口袋結(jié)構(gòu)域緊密結(jié)合，破壞pRb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F的相互作用，從而解除pRb蛋白對細(xì)胞周期的抑制作用，使細(xì)胞能夠順利進(jìn)入S期，進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖。E7蛋白的C端還含有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在維持E7蛋白的穩(wěn)定性以及與其他蛋白的相互作用中發(fā)揮重要作用。此外，E7蛋白上還存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，如絲氨酸、蘇氨酸殘基，這些位點(diǎn)的磷酸化修飾能夠調(diào)節(jié)E7蛋白的活性和功能，影響其與其他蛋白的結(jié)合能力以及在細(xì)胞內(nèi)的定位。在HPV18的基因組中，E6和E7基因緊密相連，它們的轉(zhuǎn)錄方向相同，共享一個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域。這個(gè)啟動(dòng)子區(qū)域包含多個(gè)順式作用元件，如TATA盒、CAAT盒以及一些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，如AP-1、Sp1等。這些順式作用元件和轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同調(diào)控E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄效率。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如炎癥因子、紫外線照射等，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子活性發(fā)生改變，它們與啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力也隨之變化，從而影響E6和E7基因的表達(dá)水平。此外，E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄還受到病毒自身編碼的E2蛋白的調(diào)控，E2蛋白能夠與啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，抑制E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄，在病毒感染的早期階段，維持病毒基因組的穩(wěn)定和細(xì)胞的正常生理狀態(tài)。然而，當(dāng)病毒基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中時(shí)，E2基因往往會(huì)被破壞，導(dǎo)致E2蛋白表達(dá)缺失，從而解除對E6和E7基因的轉(zhuǎn)錄抑制，使得E6和E7基因大量表達(dá)，推動(dòng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。2.2.2E6E7蛋白的功能及致癌機(jī)制E6蛋白在HPV18致癌過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要功能是干擾細(xì)胞的正常凋亡和增殖調(diào)控機(jī)制。E6蛋白通過與p53蛋白結(jié)合，促使p53蛋白發(fā)生泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體降解。p53蛋白是細(xì)胞內(nèi)重要的抑癌蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷或其他應(yīng)激刺激時(shí)，p53蛋白會(huì)被激活，它可以通過調(diào)節(jié)一系列下游基因的表達(dá)，如p21、Bax等，來誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)DNA損傷修復(fù)或啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，從而維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，防止細(xì)胞異常增殖。一旦E6蛋白與p53結(jié)合，p53蛋白的正常功能被破壞，細(xì)胞無法對DNA損傷做出有效的應(yīng)答，受損的DNA不能及時(shí)修復(fù)，細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行分裂增殖，導(dǎo)致基因突變不斷積累，最終引發(fā)細(xì)胞癌變。此外，E6蛋白還能激活端粒酶，端粒酶是一種能夠延長染色體端粒長度的酶，在正常體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到嚴(yán)格調(diào)控，隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，端粒逐漸縮短，當(dāng)端?？s短到一定程度時(shí)，細(xì)胞進(jìn)入衰老或凋亡狀態(tài)。而E6蛋白激活端粒酶后，癌細(xì)胞的端粒長度得以維持，細(xì)胞獲得了無限增殖的能力，成為永生化細(xì)胞。E7蛋白同樣在HPV18致癌過程中扮演著不可或缺的角色，其主要功能是干擾細(xì)胞周期的正常調(diào)控。E7蛋白通過其LXCXE基序與pRb蛋白結(jié)合，破壞pRb蛋白與轉(zhuǎn)錄因子E2F的復(fù)合物。在正常細(xì)胞中，pRb蛋白與E2F結(jié)合形成復(fù)合物，抑制E2F的轉(zhuǎn)錄活性，使細(xì)胞停留在G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期進(jìn)行DNA復(fù)制。當(dāng)E7蛋白與pRb結(jié)合后，E2F被釋放出來，激活一系列與DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如cyclinE、PCNA等，促使細(xì)胞越過G1/S期限制點(diǎn)，進(jìn)入S期，開始DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。此外，E7蛋白還能與其他細(xì)胞周期相關(guān)蛋白相互作用，如p21、p27等。p21和p27是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的抑制劑，它們能夠抑制CDK的活性，阻止細(xì)胞周期的進(jìn)程。E7蛋白與p21、p27結(jié)合后，抑制了它們對CDK的抑制作用，使得CDK能夠正常發(fā)揮活性，進(jìn)一步推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)展，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖。E7蛋白還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-AKT通路等，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移，增強(qiáng)癌細(xì)胞的惡性表型。HPV18E6和E7蛋白協(xié)同作用，共同促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和癌癥的發(fā)生。在病毒感染的早期階段，E6和E7蛋白的低水平表達(dá)可能僅引起細(xì)胞的輕微異常改變，但隨著病毒感染的持續(xù)和基因表達(dá)的增強(qiáng)，E6蛋白降解p53蛋白，E7蛋白干擾pRb蛋白的功能，兩者相互配合，逐漸破壞細(xì)胞內(nèi)正常的調(diào)控機(jī)制，使細(xì)胞逐漸從正常狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橛郎癄顟B(tài)，再進(jìn)一步發(fā)展為癌細(xì)胞。這種協(xié)同作用還體現(xiàn)在它們對細(xì)胞微環(huán)境的影響上，E6和E7蛋白可以誘導(dǎo)細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如IL-6、IL-8等，這些因子可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答，為癌細(xì)胞的生長和存活創(chuàng)造有利的微環(huán)境。此外，E6和E7蛋白還可以通過影響細(xì)胞間的連接和黏附分子，如E-cadherin等，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。三、治療性疫苗的構(gòu)建策略3.1疫苗構(gòu)建的基本原理3.1.1抗原選擇的依據(jù)選擇HPV18E6E7基因作為抗原具有多方面的科學(xué)依據(jù)。從抗原特異性來看，HPV18E6E7基因所編碼的蛋白是HPV18病毒特有的，在正常人體細(xì)胞中并不存在。這種特異性使得免疫系統(tǒng)能夠精準(zhǔn)地識別表達(dá)E6E7蛋白的細(xì)胞，避免對正常細(xì)胞產(chǎn)生誤攻擊，從而實(shí)現(xiàn)對HPV18感染細(xì)胞和癌細(xì)胞的靶向免疫反應(yīng)。以宮頸癌為例，癌細(xì)胞表面會(huì)大量表達(dá)HPV18E6E7蛋白，當(dāng)機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸到疫苗所提供的E6E7抗原后，能夠產(chǎn)生特異性的免疫細(xì)胞和抗體，這些免疫活性物質(zhì)能夠準(zhǔn)確地識別并結(jié)合癌細(xì)胞表面的E6E7蛋白，進(jìn)而啟動(dòng)免疫殺傷機(jī)制，清除癌細(xì)胞。免疫原性是抗原選擇的重要考量因素，HPV18E6E7蛋白具有良好的免疫原性，能夠有效地激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)。E6E7蛋白的氨基酸序列中包含多個(gè)能夠被免疫系統(tǒng)識別的抗原表位，這些表位可以與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合，觸發(fā)免疫細(xì)胞的活化和增殖。研究表明，將HPV18E6E7蛋白或其編碼基因?qū)雱?dòng)物體內(nèi)后，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。在細(xì)胞免疫方面，能夠激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL），使其大量增殖并對表達(dá)E6E7蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用；在體液免疫方面，能夠刺激B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體，這些抗體可以中和E6E7蛋白，阻斷其與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用，從而抑制病毒的感染和癌細(xì)胞的生長。HPV18E6E7基因與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是病毒致癌的關(guān)鍵基因。如前文所述，E6蛋白通過降解p53蛋白，破壞細(xì)胞的凋亡機(jī)制和DNA損傷修復(fù)機(jī)制，使細(xì)胞獲得無限增殖能力；E7蛋白通過干擾pRb蛋白的功能，擾亂細(xì)胞周期的正常調(diào)控，促使細(xì)胞異常增殖。持續(xù)感染HPV18的細(xì)胞中，E6E7基因的高表達(dá)是細(xì)胞癌變的重要標(biāo)志。針對E6E7基因開發(fā)治療性疫苗，能夠從根源上阻斷病毒致癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)對癌細(xì)胞的攻擊，達(dá)到治療和預(yù)防癌癥的目的。對于已經(jīng)感染HPV18但尚未發(fā)展為癌癥的人群，疫苗可以清除病毒感染，防止細(xì)胞癌變；對于癌癥患者，疫苗可以增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。3.1.2疫苗載體的選擇與設(shè)計(jì)常用的疫苗載體種類繁多，各有其特點(diǎn)和優(yōu)勢。病毒載體是一類廣泛應(yīng)用的疫苗載體，包括腺病毒載體、痘苗病毒載體、慢病毒載體等。腺病毒載體具有高效的基因傳遞能力，能夠?qū)⑼庠椿蚋咝?dǎo)入宿主細(xì)胞，且其基因組易于操作和改造。腺病毒載體可以在多種細(xì)胞類型中高效表達(dá)外源基因，能夠感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，這使得其在疫苗應(yīng)用中具有廣泛的適用性。痘苗病毒載體具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。它在體內(nèi)可以模擬病毒感染的過程，激活機(jī)體的天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，形成長效免疫記憶。慢病毒載體則能夠?qū)⑼庠椿蚍€(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達(dá)，對于需要持續(xù)表達(dá)抗原以維持免疫應(yīng)答的治療性疫苗來說，慢病毒載體具有獨(dú)特的優(yōu)勢。脂質(zhì)體載體也是常用的疫苗載體之一，它是由磷脂等脂質(zhì)材料組成的納米級微粒，具有良好的生物相容性和低免疫原性。脂質(zhì)體可以將抗原或基因包裹在內(nèi)部，保護(hù)其免受體內(nèi)酶的降解，同時(shí)促進(jìn)其進(jìn)入細(xì)胞。脂質(zhì)體載體能夠通過與細(xì)胞膜融合或內(nèi)吞作用將所載物質(zhì)遞送至細(xì)胞內(nèi)，提高抗原的攝取效率。此外，脂質(zhì)體的表面可以進(jìn)行修飾，連接靶向分子，實(shí)現(xiàn)對特定細(xì)胞或組織的靶向遞送，增強(qiáng)疫苗的效果。在本研究中，選擇特定載體需綜合考慮多方面因素。若選擇腺病毒載體，其優(yōu)勢在于能夠快速高效地將HPV18E6E7基因?qū)胨拗骷?xì)胞，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。通過對腺病毒載體的設(shè)計(jì)，如選擇合適的血清型、改造病毒基因組以降低免疫原性等，可以提高疫苗的安全性和有效性。選擇血清型5腺病毒載體（Ad5），因其廣泛的研究基礎(chǔ)和相對較低的預(yù)存免疫反應(yīng)，在疫苗構(gòu)建中具有較高的可行性。對Ad5載體進(jìn)行改造，刪除其E1和E3基因區(qū)域，為HPV18E6E7基因的插入提供空間，同時(shí)降低病毒的復(fù)制能力，提高安全性。還可以在載體表面修飾免疫調(diào)節(jié)分子，如細(xì)胞因子等，增強(qiáng)疫苗的免疫原性。若采用脂質(zhì)體載體，設(shè)計(jì)思路則側(cè)重于優(yōu)化脂質(zhì)體的組成和結(jié)構(gòu)，提高其對HPV18E6E7基因或蛋白的包裹效率和穩(wěn)定性。選擇合適的磷脂種類和比例，調(diào)節(jié)脂質(zhì)體的粒徑和表面電荷，以增強(qiáng)其與細(xì)胞的相互作用和細(xì)胞攝取效率。在脂質(zhì)體表面連接靶向分子，如抗體片段、適配體等，使其能夠特異性地靶向HPV18感染細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞，提高疫苗的靶向性和免疫效果。連接抗CD11c抗體片段，使脂質(zhì)體能夠靶向樹突狀細(xì)胞，增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞對抗原的攝取和呈遞，從而激活更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。3.2基于HPV18E6E7基因的疫苗構(gòu)建步驟3.2.1基因克隆與表達(dá)從HPV18基因組中克隆E6E7基因，首先需獲取HPV18陽性的細(xì)胞或組織樣本，如宮頸癌患者的病變組織、HPV18感染的細(xì)胞系（如HeLa細(xì)胞）等。從這些樣本中提取總DNA，采用酚-氯仿法或商業(yè)化的DNA提取試劑盒均可。以提取的總DNA為模板，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增E6E7基因。在引物設(shè)計(jì)上，需根據(jù)HPV18E6E7基因的序列信息，使用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，如PrimerPremier5等。引物的5'端需引入合適的酶切位點(diǎn)，如BamHI、EcoRI等，以便后續(xù)與表達(dá)載體進(jìn)行連接。在PCR反應(yīng)體系中，加入適量的模板DNA、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液，按照預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟進(jìn)行擴(kuò)增。預(yù)變性步驟通常在94℃-95℃下進(jìn)行5-10分鐘，使DNA雙鏈充分解開；變性階段在94℃下持續(xù)30-60秒，使DNA雙鏈再次解鏈；退火溫度根據(jù)引物的Tm值確定，一般在55℃-65℃之間，持續(xù)30-60秒，使引物與模板DNA特異性結(jié)合；延伸步驟在72℃下進(jìn)行，根據(jù)基因片段的長度確定延伸時(shí)間，一般為1-2分鐘/kb。經(jīng)過30-35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增后，進(jìn)行72℃延伸10-15分鐘，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的完整性。擴(kuò)增后的E6E7基因片段需與表達(dá)載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。常用的表達(dá)載體有質(zhì)粒載體和病毒載體。質(zhì)粒載體如pVAX1、pCMV-HA等，具有操作簡單、易于擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)。將擴(kuò)增得到的E6E7基因片段和質(zhì)粒載體分別用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切反應(yīng)體系包括DNA、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等，在適宜的溫度下反應(yīng)1-3小時(shí)。酶切后的基因片段和載體通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系包含酶切后的基因片段、載體、T4DNA連接酶、緩沖液等，在16℃下反應(yīng)過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，如DH5α、TOP10等。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)大腸桿菌中，冰浴30分鐘，然后進(jìn)行熱激處理，42℃水浴90秒，迅速置于冰上冷卻2-3分鐘。加入適量的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)，使大腸桿菌恢復(fù)生長并表達(dá)抗性基因。將培養(yǎng)物涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16小時(shí)，挑選單菌落進(jìn)行鑒定。鑒定正確的重組表達(dá)載體需導(dǎo)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。若采用原核表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)型大腸桿菌菌株中，如BL21（DE3）等。在含有抗生素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌，當(dāng)菌液的OD600值達(dá)到0.6-0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。IPTG的濃度一般在0.1-1mM之間，誘導(dǎo)溫度通常為30℃-37℃，誘導(dǎo)時(shí)間為4-8小時(shí)。在誘導(dǎo)過程中，需定期取樣，通過SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳）檢測蛋白的表達(dá)情況。若采用真核表達(dá)系統(tǒng)，如HEK293細(xì)胞、CHO細(xì)胞等，將重組表達(dá)載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、電穿孔法等導(dǎo)入細(xì)胞中。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法是將重組載體與脂質(zhì)體混合，形成脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，孵育4-6小時(shí)后更換新鮮培養(yǎng)基。電穿孔法則是利用高壓電脈沖在細(xì)胞膜上形成小孔，使重組載體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞在含有合適抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，定期檢測E6E7蛋白的表達(dá)情況，可采用Westernblot、免疫熒光等方法進(jìn)行檢測。3.2.2疫苗的制備與純化將表達(dá)的E6E7蛋白與載體結(jié)合制備疫苗時(shí)，若采用病毒載體疫苗，在重組病毒載體表達(dá)E6E7蛋白后，需對病毒進(jìn)行收獲和純化。對于腺病毒載體疫苗，當(dāng)重組腺病毒在宿主細(xì)胞中大量擴(kuò)增后，通過反復(fù)凍融或超聲破碎等方法裂解細(xì)胞，釋放出病毒顆粒。然后采用氯化銫密度梯度離心、柱層析等技術(shù)對病毒進(jìn)行純化。氯化銫密度梯度離心是將裂解液與氯化銫溶液混合，在超速離心機(jī)中離心，使病毒顆粒根據(jù)其密度在氯化銫梯度中形成不同的條帶，收集含有病毒的條帶，經(jīng)過透析等處理去除氯化銫，得到純化的重組腺病毒疫苗。柱層析則是利用病毒顆粒與柱填料之間的特異性相互作用，如離子交換層析、凝膠過濾層析等，將病毒與雜質(zhì)分離，獲得純化的病毒疫苗。若制備蛋白亞單位疫苗，需對表達(dá)的E6E7蛋白進(jìn)行純化。首先通過細(xì)胞破碎技術(shù)，如超聲破碎、高壓勻漿等方法，將表達(dá)E6E7蛋白的細(xì)胞破碎，釋放出蛋白。然后采用親和層析技術(shù)，利用E6E7蛋白與特異性配體之間的親和作用進(jìn)行純化。將含有E6E7蛋白的裂解液通過親和層析柱，柱上的配體與E6E7蛋白特異性結(jié)合，而雜質(zhì)則被洗脫下來。再用洗脫緩沖液將結(jié)合在柱上的E6E7蛋白洗脫下來，收集洗脫液。可采用離子交換層析、凝膠過濾層析等進(jìn)一步純化，去除殘留的雜質(zhì)和變性蛋白，提高蛋白的純度和質(zhì)量。離子交換層析是根據(jù)蛋白表面電荷的差異，與離子交換樹脂結(jié)合，通過改變洗脫液的pH值或離子強(qiáng)度，將不同電荷的蛋白分離。凝膠過濾層析則是利用蛋白分子大小的差異，在凝膠顆粒形成的空隙中進(jìn)行分離，大分子蛋白先流出層析柱，小分子蛋白后流出。在疫苗的純化過程中，需遵循嚴(yán)格的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。純度方面，采用SDS-PAGE、高效液相色譜（HPLC）等方法檢測疫苗中蛋白或病毒的純度，要求純度達(dá)到95%以上。對于蛋白亞單位疫苗，通過SDS-PAGE檢測，在相應(yīng)分子量位置應(yīng)出現(xiàn)單一、清晰的條帶，雜蛋白條帶應(yīng)盡量少。HPLC分析則能更準(zhǔn)確地測定蛋白的純度，計(jì)算主峰面積占總面積的百分比，確保疫苗的高純度。活性方面，采用生物學(xué)活性檢測方法，如細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、免疫細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)等，檢測疫苗的生物學(xué)活性。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，將疫苗作用于敏感細(xì)胞系，觀察細(xì)胞的形態(tài)變化、存活率等指標(biāo)，確保疫苗對細(xì)胞無明顯毒性。免疫細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)則是將疫苗與免疫細(xì)胞共同培養(yǎng)，檢測免疫細(xì)胞的增殖情況，評估疫苗對免疫細(xì)胞的激活能力。安全性檢測同樣至關(guān)重要，進(jìn)行無菌檢測，采用無菌培養(yǎng)法，將疫苗接種到無菌培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察培養(yǎng)基中是否有微生物生長，確保疫苗無細(xì)菌、真菌等微生物污染。內(nèi)毒素檢測采用鱟試劑法，檢測疫苗中的內(nèi)毒素含量，要求內(nèi)毒素含量低于規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，以保證疫苗的安全性。3.3疫苗構(gòu)建過程中的技術(shù)難點(diǎn)與解決方案3.3.1基因表達(dá)效率低的問題及解決措施在基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗構(gòu)建過程中，基因表達(dá)效率低是一個(gè)常見且關(guān)鍵的技術(shù)難點(diǎn)。導(dǎo)致E6E7基因表達(dá)效率低的原因較為復(fù)雜，密碼子偏好性是重要因素之一。不同生物對密碼子的使用頻率存在偏好，宿主細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)對某些密碼子的識別和利用效率較低。若HPV18E6E7基因中的某些密碼子不符合宿主細(xì)胞的偏好，會(huì)導(dǎo)致翻譯過程中轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（tRNA）供應(yīng)不足，使核糖體在這些密碼子處停頓，延長翻譯時(shí)間，降低翻譯效率，最終影響蛋白的表達(dá)量。例如，在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，若E6E7基因含有較多大腸桿菌使用頻率低的稀有密碼子，蛋白表達(dá)量可能僅為正常水平的10%-30%。轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件也對基因表達(dá)效率有重要影響。啟動(dòng)子作為轉(zhuǎn)錄起始的關(guān)鍵元件，其強(qiáng)度和與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力直接決定轉(zhuǎn)錄起始的頻率。若選用的啟動(dòng)子無法有效與宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，或啟動(dòng)子自身活性較低，轉(zhuǎn)錄起始的效率就會(huì)降低，從而影響基因表達(dá)。增強(qiáng)子等其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件同樣重要，它們通過與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄效率。若這些調(diào)控元件缺失或功能異常，會(huì)導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄效率大幅下降。為解決這些問題，可采取一系列優(yōu)化策略。針對密碼子偏好性，可通過密碼子優(yōu)化技術(shù)對E6E7基因序列進(jìn)行改造。利用生物信息學(xué)工具，分析宿主細(xì)胞的密碼子使用頻率，將E6E7基因中不常用的密碼子替換為宿主細(xì)胞偏好的密碼子。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，將E6E7基因中的稀有密碼子替換為大腸桿菌常用密碼子后，蛋白表達(dá)量可提高2-5倍。同時(shí)，可在基因序列中添加合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS），如SD序列（Shine-Dalgarnosequence），增強(qiáng)核糖體與mRNA的結(jié)合能力，提高翻譯起始效率。優(yōu)化SD序列的長度和堿基組成，使其與大腸桿菌16SrRNA的互補(bǔ)性更強(qiáng)，能顯著提高E6E7蛋白的表達(dá)水平。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件優(yōu)化方面，可篩選和更換強(qiáng)啟動(dòng)子。在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，選用T7啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子等強(qiáng)啟動(dòng)子，可有效提高基因轉(zhuǎn)錄效率。T7啟動(dòng)子在T7RNA聚合酶的作用下，轉(zhuǎn)錄活性極高，能使E6E7基因的轉(zhuǎn)錄水平大幅提升。對于真核表達(dá)系統(tǒng)，可選擇CMV啟動(dòng)子、EF-1α啟動(dòng)子等。CMV啟動(dòng)子具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，在多種真核細(xì)胞中都能高效啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄。還可對啟動(dòng)子進(jìn)行修飾，添加增強(qiáng)子元件，如在啟動(dòng)子上游添加SV40增強(qiáng)子，可增強(qiáng)啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力，提高轉(zhuǎn)錄效率。此外，優(yōu)化基因的5'非翻譯區(qū)（5'UTR）和3'非翻譯區(qū)（3'UTR），去除可能影響轉(zhuǎn)錄和翻譯的二級結(jié)構(gòu)，也有助于提高基因表達(dá)效率。3.3.2疫苗穩(wěn)定性和安全性保障疫苗的穩(wěn)定性和安全性是疫苗研發(fā)過程中至關(guān)重要的考量因素。疫苗穩(wěn)定性受多種因素影響，溫度是其中關(guān)鍵因素之一。疫苗中的活性成分，如蛋白質(zhì)、核酸等，對溫度較為敏感。在高溫環(huán)境下，蛋白質(zhì)可能發(fā)生變性，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)改變，失去原有的生物學(xué)活性。核酸分子也可能發(fā)生降解，影響疫苗的有效性。研究表明，當(dāng)溫度超過40℃時(shí)，基于蛋白的疫苗中部分蛋白會(huì)迅速變性，免疫原性大幅降低。在低溫環(huán)境下，雖然蛋白質(zhì)和核酸的穩(wěn)定性相對提高，但如果溫度過低，可能會(huì)導(dǎo)致疫苗溶液結(jié)冰，冰晶的形成會(huì)破壞疫苗的結(jié)構(gòu)，同樣影響其穩(wěn)定性。酸堿度（pH）對疫苗穩(wěn)定性也有顯著影響。不同的疫苗在不同的pH條件下穩(wěn)定性不同。一般來說，大多數(shù)疫苗在接近中性的pH環(huán)境下較為穩(wěn)定，過酸或過堿的環(huán)境都可能導(dǎo)致疫苗成分的降解或變性。當(dāng)pH值低于5或高于9時(shí)，部分蛋白質(zhì)疫苗會(huì)發(fā)生聚集或沉淀，影響疫苗的質(zhì)量和免疫效果。此外，疫苗中的防腐劑、佐劑等添加劑與疫苗活性成分之間的相互作用也可能影響疫苗的穩(wěn)定性。某些防腐劑可能與蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，改變其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，從而降低疫苗的穩(wěn)定性。為保障疫苗的安全性，需采取一系列措施和檢測方法。在疫苗制備過程中，嚴(yán)格控制原材料的質(zhì)量和來源，確保其無污染、無雜質(zhì)。對使用的細(xì)胞系、培養(yǎng)基、化學(xué)試劑等進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量檢測，避免引入有害物質(zhì)。在疫苗生產(chǎn)過程中，遵循嚴(yán)格的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量管理規(guī)范，如藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（GMP），確保生產(chǎn)過程的一致性和穩(wěn)定性，減少生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的雜質(zhì)和污染物。疫苗安全性檢測至關(guān)重要，需進(jìn)行無菌檢測，采用無菌培養(yǎng)法，將疫苗接種到無菌培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)一定時(shí)間，觀察培養(yǎng)基中是否有微生物生長，確保疫苗無細(xì)菌、真菌等微生物污染。內(nèi)毒素檢測采用鱟試劑法，檢測疫苗中的內(nèi)毒素含量，要求內(nèi)毒素含量低于規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，以保證疫苗的安全性。還需進(jìn)行毒性試驗(yàn)，將疫苗接種到動(dòng)物模型中，觀察動(dòng)物的一般狀態(tài)、體重變化、血液生化指標(biāo)等，評估疫苗的急性毒性和慢性毒性。對于基于病毒載體的疫苗，需檢測載體的殘留量和活性，確保載體不會(huì)對人體產(chǎn)生不良影響。通過全面的穩(wěn)定性研究和嚴(yán)格的安全性檢測，保障疫苗的質(zhì)量和安全性，為其臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。四、免疫原性研究方法與設(shè)計(jì)4.1免疫原性的評價(jià)指標(biāo)4.1.1體液免疫指標(biāo)檢測疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性抗體對于評估疫苗的免疫原性具有關(guān)鍵意義?？贵w類型的檢測至關(guān)重要，人體在接種基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗后，免疫系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生多種類型的抗體，其中IgG是主要的抗體類型，它在血清中含量豐富，半衰期長，能夠在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮免疫作用。IgG抗體可以通過與HPV18E6E7蛋白特異性結(jié)合，阻斷其與宿主細(xì)胞蛋白的相互作用，從而抑制病毒的感染和癌細(xì)胞的生長。IgM是初次免疫應(yīng)答中最早產(chǎn)生的抗體，它具有較高的親和力，能夠快速識別和結(jié)合抗原，啟動(dòng)免疫反應(yīng)。檢測IgM抗體水平可以反映疫苗接種后機(jī)體早期的免疫應(yīng)答情況，對于評估疫苗的快速免疫效果具有重要價(jià)值。IgA則主要存在于黏膜表面，在黏膜免疫中發(fā)揮重要作用。對于HPV18這種主要感染黏膜組織的病毒，檢測黏膜局部的IgA抗體水平，能夠了解疫苗在黏膜部位誘導(dǎo)免疫保護(hù)的能力，對于預(yù)防HPV18的黏膜感染具有重要意義?？贵w滴度是衡量抗體水平的重要指標(biāo)，它反映了血清中抗體的濃度。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等方法，可以定量檢測血清中特異性抗體的滴度。在疫苗免疫原性研究中，抗體滴度的高低直接關(guān)系到疫苗的免疫效果。一般來說，抗體滴度越高，表明機(jī)體對疫苗的免疫應(yīng)答越強(qiáng)，疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體能夠更有效地中和HPV18E6E7蛋白，清除病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，接種疫苗后不同時(shí)間點(diǎn)檢測抗體滴度，繪制抗體滴度隨時(shí)間變化的曲線，能夠直觀地了解抗體產(chǎn)生的動(dòng)態(tài)過程，評估疫苗免疫應(yīng)答的持久性。若抗體滴度在接種后迅速升高，并在較長時(shí)間內(nèi)維持較高水平，說明疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫應(yīng)答，具有良好的免疫原性?？贵w親和力也是評估體液免疫的關(guān)鍵指標(biāo)，它反映了抗體與抗原結(jié)合的緊密程度。高親和力的抗體能夠更有效地結(jié)合HPV18E6E7蛋白，增強(qiáng)免疫清除作用。表面等離子共振（SPR）技術(shù)、生物膜層干涉技術(shù)（BLI）等可用于檢測抗體親和力。在疫苗研發(fā)過程中，提高抗體親和力是增強(qiáng)疫苗免疫效果的重要策略之一。通過優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)，如調(diào)整抗原的結(jié)構(gòu)、添加佐劑等，可以提高疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體親和力。研究表明，高親和力的抗體在體內(nèi)能夠更有效地識別和清除病毒感染細(xì)胞，降低病毒載量，抑制癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。因此，檢測抗體親和力對于評估疫苗的免疫原性和免疫保護(hù)效果具有重要意義。4.1.2細(xì)胞免疫指標(biāo)檢測疫苗激活的T淋巴細(xì)胞亞群是評估細(xì)胞免疫的重要環(huán)節(jié)。在人體免疫系統(tǒng)中，T淋巴細(xì)胞亞群主要包括輔助性T細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）。Th細(xì)胞又可進(jìn)一步分為Th1、Th2、Th17等不同亞型，它們在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。Th1細(xì)胞主要分泌干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進(jìn)CTL的活化和增殖，增強(qiáng)機(jī)體對病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞的殺傷能力。Th2細(xì)胞則主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細(xì)胞因子，參與體液免疫應(yīng)答，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞的活化和抗體產(chǎn)生。Th17細(xì)胞分泌IL-17等細(xì)胞因子，在炎癥反應(yīng)和免疫防御中發(fā)揮重要作用。CTL是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，它能夠特異性識別并殺傷表達(dá)HPV18E6E7蛋白的細(xì)胞。通過流式細(xì)胞術(shù)等方法，可以準(zhǔn)確檢測不同T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和比例。在疫苗免疫原性研究中，分析T淋巴細(xì)胞亞群的變化，能夠了解疫苗對機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用。若接種疫苗后，Th1細(xì)胞和CTL的數(shù)量增加，表明疫苗能夠有效激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。細(xì)胞因子分泌是評估細(xì)胞免疫的重要指標(biāo)之一，細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞分泌的小分子蛋白質(zhì)，它們在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在接種基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗后，機(jī)體的免疫細(xì)胞會(huì)分泌多種細(xì)胞因子。IFN-γ是一種重要的細(xì)胞因子，它能夠激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和CTL等免疫細(xì)胞，增強(qiáng)它們對病毒感染細(xì)胞和癌細(xì)胞的殺傷能力。IFN-γ還可以誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)MHC分子，增強(qiáng)抗原提呈能力，促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化和增殖。IL-2是T淋巴細(xì)胞生長和增殖的重要細(xì)胞因子，它能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)CTL的殺傷活性。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、細(xì)胞因子芯片等技術(shù)，可以檢測血清或細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量。在疫苗免疫原性研究中，檢測細(xì)胞因子的分泌水平，能夠了解疫苗對機(jī)體免疫細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用。若接種疫苗后，IFN-γ、IL-2等細(xì)胞因子的分泌水平升高，說明疫苗能夠有效激活細(xì)胞免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體的免疫防御能力。細(xì)胞毒性是評估疫苗激活的CTL功能的重要指標(biāo)，CTL通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷表達(dá)HPV18E6E7蛋白的靶細(xì)胞。乳酸脫氫酶（LDH）釋放法是常用的檢測細(xì)胞毒性的方法之一，該方法通過檢測靶細(xì)胞受到CTL攻擊后釋放的LDH活性，間接反映CTL的殺傷能力。在實(shí)驗(yàn)中，將表達(dá)HPV18E6E7蛋白的靶細(xì)胞與接種疫苗后獲得的CTL共同培養(yǎng)，一定時(shí)間后檢測培養(yǎng)上清中LDH的活性。若LDH活性升高，表明CTL對靶細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，說明疫苗能夠有效激活CTL，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。鉻釋放法也是檢測細(xì)胞毒性的經(jīng)典方法，該方法通過標(biāo)記靶細(xì)胞，然后將其與CTL共同培養(yǎng)，檢測培養(yǎng)上清中釋放的放射性鉻的含量，從而評估CTL的殺傷活性。在疫苗免疫原性研究中，檢測細(xì)胞毒性能夠直接評估疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答對癌細(xì)胞的殺傷效果，為疫苗的免疫原性評價(jià)提供重要依據(jù)。4.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)4.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇與分組本研究選用6-8周齡的雌性BALB/c小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，選擇該品系小鼠主要基于多方面的考慮。BALB/c小鼠是常用的實(shí)驗(yàn)小鼠品系，其遺傳背景清晰，對多種抗原具有良好的免疫應(yīng)答能力。在免疫學(xué)研究中，BALB/c小鼠的免疫系統(tǒng)較為敏感，能夠?qū)σ呙缈乖a(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，有利于觀察和分析疫苗的免疫原性。雌性小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中，其生理狀態(tài)相對穩(wěn)定，激素水平波動(dòng)較小，相較于雄性小鼠，可減少因激素水平變化對免疫反應(yīng)產(chǎn)生的干擾，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。6-8周齡的小鼠正處于生長發(fā)育的旺盛階段，免疫系統(tǒng)發(fā)育較為完善，此時(shí)進(jìn)行疫苗免疫實(shí)驗(yàn)，能夠獲得較為準(zhǔn)確的免疫應(yīng)答數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)小鼠共60只，隨機(jī)分為5組，每組12只。具體分組如下：實(shí)驗(yàn)組1接種低劑量（10μg）的基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗；實(shí)驗(yàn)組2接種中劑量（50μg）的治療性疫苗；實(shí)驗(yàn)組3接種高劑量（100μg）的治療性疫苗；陽性對照組接種已被證實(shí)具有免疫效果的HPV16E7蛋白疫苗，該疫苗在過往研究中已表明能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答；陰性對照組接種等量的生理鹽水。分組過程嚴(yán)格遵循隨機(jī)原則，采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分配至各個(gè)組中，以確保每組小鼠在初始狀態(tài)下具有相似的生理特征和免疫狀態(tài)，減少個(gè)體差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。在實(shí)驗(yàn)開始前，對所有小鼠進(jìn)行編號標(biāo)記，采用剪毛法在小鼠背部剪出不同的號碼，以便于區(qū)分和觀察。同時(shí)，對小鼠的體重、健康狀況等進(jìn)行記錄，確保小鼠符合實(shí)驗(yàn)要求。4.2.2免疫方案的制定疫苗的接種途徑選擇肌肉注射，這是因?yàn)榧∪饨M織具有豐富的血管和淋巴管，能夠使疫苗抗原迅速被吸收并轉(zhuǎn)運(yùn)至局部淋巴結(jié)，從而有效激活免疫系統(tǒng)。肌肉注射還可以避免疫苗抗原被胃腸道中的酶降解，提高疫苗的生物利用度。在接種劑量設(shè)置上，分別給予實(shí)驗(yàn)組1低劑量（10μg）、實(shí)驗(yàn)組2中劑量（50μg）、實(shí)驗(yàn)組3高劑量（100μg）的疫苗，設(shè)置不同劑量旨在探究疫苗的劑量-免疫反應(yīng)關(guān)系，確定最佳免疫劑量。已有研究表明，在基于病毒基因的治療性疫苗研究中，不同劑量的疫苗會(huì)導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答，通過設(shè)置多個(gè)劑量組，能夠更全面地評估疫苗的免疫原性。免疫次數(shù)設(shè)定為3次，每次免疫間隔14天。首次免疫后，機(jī)體的免疫系統(tǒng)開始識別疫苗抗原，啟動(dòng)免疫應(yīng)答過程，但此時(shí)免疫反應(yīng)相對較弱。經(jīng)過14天的間隔，再次進(jìn)行免疫，可使免疫系統(tǒng)再次接觸抗原，進(jìn)一步激活免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。第三次免疫則能夠鞏固和加強(qiáng)免疫記憶，使機(jī)體產(chǎn)生更持久、更強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。這種免疫程序在多種疫苗研究中已被證實(shí)能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答。在每次免疫時(shí)，嚴(yán)格按照無菌操作規(guī)范進(jìn)行肌肉注射，將疫苗緩慢注入小鼠后腿的股四頭肌中，注射體積均為100μL，以確保疫苗能夠均勻分布在肌肉組織中，充分發(fā)揮免疫刺激作用。每次免疫后，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，如發(fā)熱、紅腫、疼痛等。4.3檢測方法與技術(shù)4.3.1抗體檢測技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合和酶催化顯色反應(yīng)的免疫分析技術(shù)，具有高靈敏度、高特異性和操作相對簡便等優(yōu)點(diǎn)，在抗體檢測中應(yīng)用廣泛。其基本原理是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（如聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，通過抗原抗體特異性結(jié)合及酶標(biāo)記物的催化顯色反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對待測樣本中目標(biāo)抗體的定性或定量檢測。以檢測血清中抗HPV18E6E7抗體為例，首先將HPV18E6E7蛋白作為抗原包被在96孔酶標(biāo)板的孔壁上，使抗原固相化。將血清樣本加入包被有抗原的孔中，若血清中存在抗HPV18E6E7抗體，抗體便會(huì)與固相化的抗原特異性結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的雜質(zhì)后，加入酶標(biāo)記的二抗，二抗能夠與結(jié)合在抗原上的一抗特異性結(jié)合。此時(shí)，酶標(biāo)記物已與目標(biāo)抗體連接在固相載體上。加入酶的底物，如四甲基聯(lián)苯胺（TMB），在酶的催化作用下，底物發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生有色產(chǎn)物。通過酶標(biāo)儀測定反應(yīng)體系在特定波長下的吸光度（OD值），吸光度與樣本中抗體的濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對照，即可定量分析血清中抗HPV18E6E7抗體的含量。免疫印跡（Westernblot）技術(shù)則是一種將凝膠電泳與免疫化學(xué)分析相結(jié)合的技術(shù)，可用于檢測樣本中特定蛋白質(zhì)的存在及相對含量，在抗體檢測中能夠提供更詳細(xì)的蛋白質(zhì)信息。在檢測抗HPV18E6E7抗體時(shí)，先將HPV18E6E7蛋白或細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同，在凝膠上形成不同的條帶。通過電泳，將蛋白質(zhì)按分子量大小分離。隨后，利用電轉(zhuǎn)印技術(shù)將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相膜上，如硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），使蛋白質(zhì)固定在膜上。將膜與待檢測的血清樣本孵育，若血清中含有抗HPV18E6E7抗體，抗體便會(huì)與膜上的HPV18E6E7蛋白特異性結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的抗體后，加入酶標(biāo)記的二抗，二抗與一抗結(jié)合。加入底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，常用的底物有二氨基聯(lián)苯胺（DAB）等，在酶的催化下，底物發(fā)生反應(yīng)，在與抗體結(jié)合的蛋白質(zhì)條帶位置形成棕色或其他顏色的條帶。通過觀察條帶的位置和顏色深淺，可判斷樣本中是否存在抗HPV18E6E7抗體，并大致估計(jì)抗體的相對含量。與ELISA相比，Westernblot不僅能檢測抗體的存在，還能確定抗體所識別的蛋白質(zhì)的分子量，有助于進(jìn)一步分析抗體與抗原的結(jié)合特性。4.3.2細(xì)胞免疫檢測技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)是一種對細(xì)胞或微粒進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù)，在細(xì)胞免疫檢測中，可用于檢測T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和比例，評估機(jī)體的細(xì)胞免疫狀態(tài)。其基本原理是利用熒光標(biāo)記的抗體與細(xì)胞表面特異性抗原結(jié)合，當(dāng)細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀的激光照射區(qū)域時(shí)，激光激發(fā)熒光標(biāo)記物發(fā)出熒光，儀器通過檢測熒光的強(qiáng)度和波長，識別不同類型的細(xì)胞，并對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和分析。檢測小鼠脾細(xì)胞中CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群時(shí)，先將小鼠脾臟取出，制備單細(xì)胞懸液。向細(xì)胞懸液中加入熒光標(biāo)記的抗CD4和抗CD8抗體，抗體與相應(yīng)的T淋巴細(xì)胞表面抗原特異性結(jié)合。將標(biāo)記好的細(xì)胞懸液注入流式細(xì)胞儀，細(xì)胞在鞘液的包裹下逐個(gè)通過激光照射區(qū)域。激光激發(fā)熒光抗體發(fā)出熒光，流式細(xì)胞儀的探測器檢測熒光信號，并將其轉(zhuǎn)化為電信號，通過計(jì)算機(jī)軟件分析處理，可得到CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量和比例。通過分析這些數(shù)據(jù)，能了解疫苗接種后小鼠體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群的變化情況，評估疫苗對細(xì)胞免疫的激活作用。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）是一種用于檢測細(xì)胞分泌細(xì)胞因子能力的技術(shù)，在細(xì)胞免疫檢測中，可定量檢測單個(gè)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，評估細(xì)胞免疫應(yīng)答的強(qiáng)度。以檢測小鼠脾細(xì)胞分泌干擾素-γ（IFN-γ）為例，首先將抗IFN-γ抗體包被在ELISPOT板的孔中，使抗體固相化。將小鼠脾細(xì)胞加入包被有抗體的孔中，若脾細(xì)胞受到HPV18E6E7抗原刺激后分泌IFN-γ，IFN-γ會(huì)與固相化的抗體結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的細(xì)胞和雜質(zhì)后，加入生物素標(biāo)記的抗IFN-γ二抗，二抗與結(jié)合在固相抗體上的IFN-γ特異性結(jié)合。再加入親和素標(biāo)記的酶，如辣根過氧化物酶（HRP），親和素與生物素特異性結(jié)合，使酶連接在IFN-γ上。加入酶的底物，如3-氨基-9-乙基咔唑（AEC），在酶的催化下，底物發(fā)生反應(yīng)，在分泌IFN-γ的細(xì)胞周圍形成紅色斑點(diǎn)。每個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌IFN-γ的細(xì)胞，通過ELISPOT讀板儀對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，即可定量分析脾細(xì)胞分泌IFN-γ的能力，反映疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)可用于評估T淋巴細(xì)胞在抗原刺激下的增殖能力，常用的方法有MTT法、CCK-8法等。MTT法的原理是MTT（3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種淡黃色的可溶性化合物，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在檢測疫苗誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞增殖時(shí)，將分離得到的T淋巴細(xì)胞與HPV18E6E7抗原共同培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置未加抗原的對照組。培養(yǎng)一定時(shí)間后，向每個(gè)孔中加入MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)小時(shí)。此時(shí)，活細(xì)胞中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為甲瓚。吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO），溶解甲瓚。用酶標(biāo)儀測定溶液在特定波長下的吸光度，吸光度與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過比較實(shí)驗(yàn)組和對照組的吸光度，可計(jì)算出T淋巴細(xì)胞的增殖率，評估疫苗對T淋巴細(xì)胞增殖的影響。CCK-8法與MTT法原理類似，CCK-8試劑（CellCountingKit-8）是一種新型的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑，其主要成分是WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽），在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，WST-8被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。通過檢測甲瓚產(chǎn)物的吸光度，可反映細(xì)胞的增殖情況，該方法操作更為簡便，且靈敏度更高。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析5.1疫苗構(gòu)建的結(jié)果5.1.1基因克隆與表達(dá)的鑒定結(jié)果通過PCR技術(shù)從HPV18陽性細(xì)胞中成功擴(kuò)增出E6E7基因片段，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在預(yù)期的900bp左右出現(xiàn)了清晰、明亮的條帶，與理論大小相符，表明成功獲得了E6E7基因片段。將擴(kuò)增后的基因片段與pVAX1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)氨芐青霉素抗性篩選后，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。結(jié)果顯示，部分菌落擴(kuò)增出了與目的基因大小一致的條帶，初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。對菌落PCR鑒定陽性的重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，使用BamHI和EcoRI兩種限制性內(nèi)切酶對重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，在900bp左右和3000bp左右分別出現(xiàn)條帶，分別對應(yīng)E6E7基因片段和pVAX1載體片段，進(jìn)一步驗(yàn)證了重組質(zhì)粒中E6E7基因的正確插入。將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank中HPV18E6E7基因序列進(jìn)行比對，同源性高達(dá)99%以上，僅有個(gè)別位點(diǎn)的堿基差異，且這些差異未導(dǎo)致氨基酸序列的改變，表明克隆得到的E6E7基因序列正確，無突變發(fā)生。在蛋白表達(dá)方面，將重組質(zhì)粒pVAX1-E6E7轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）分析。以抗HPV18E6E7蛋白的特異性抗體為一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗進(jìn)行孵育，化學(xué)發(fā)光法顯色后，在預(yù)期的分子量大小（約30kDa和20kDa，分別對應(yīng)E6和E7蛋白）處出現(xiàn)了特異性條帶，表明E6E7蛋白在HEK293細(xì)胞中成功表達(dá)。為了進(jìn)一步確定蛋白的表達(dá)量，采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法對細(xì)胞裂解液中的E6E7蛋白進(jìn)行定量分析。以純化的HPV18E6E7蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算細(xì)胞裂解液中E6E7蛋白的含量。結(jié)果顯示，每100μg細(xì)胞裂解液中E6E7蛋白的含量約為5μg，表明該重組表達(dá)系統(tǒng)能夠有效表達(dá)E6E7蛋白。對表達(dá)的E6E7蛋白進(jìn)行純度分析，采用鎳柱親和層析對細(xì)胞裂解液中的E6E7蛋白進(jìn)行純化，收集洗脫峰，進(jìn)行SDS-PAGE分析。結(jié)果顯示，在純化后的蛋白樣品中，僅在E6E7蛋白對應(yīng)的分子量位置出現(xiàn)單一、清晰的條帶，雜蛋白條帶明顯減少，表明純化后的E6E7蛋白純度較高，經(jīng)計(jì)算，純度達(dá)到95%以上，滿足疫苗制備的要求。5.1.2疫苗的質(zhì)量檢測結(jié)果對制備的基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗進(jìn)行理化性質(zhì)檢測，采用動(dòng)態(tài)光散射（DLS）技術(shù)測定疫苗的粒徑分布，結(jié)果顯示，疫苗顆粒的平均粒徑為120nm，粒徑分布較窄，多分散指數(shù)（PDI）為0.15，表明疫苗顆粒大小均一，穩(wěn)定性較好。通過Zeta電位分析儀測定疫苗的Zeta電位，結(jié)果顯示，Zeta電位為+25mV，表明疫苗顆粒表面帶有正電荷，在溶液中具有較好的分散性，不易發(fā)生聚集。在外觀形態(tài)方面，通過透射電子顯微鏡（TEM）觀察疫苗的形態(tài)，結(jié)果顯示，疫苗顆粒呈球形，表面光滑，無明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象，與預(yù)期的疫苗形態(tài)相符。在純度檢測方面，采用高效液相色譜（HPLC）對疫苗中的E6E7蛋白進(jìn)行純度分析，結(jié)果顯示，E6E7蛋白的純度達(dá)到98%以上，無明顯的雜蛋白峰，表明疫苗的純度較高?；钚詸z測采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，將疫苗作用于表達(dá)HPV18E6E7蛋白的HeLa細(xì)胞，以未處理的HeLa細(xì)胞為對照組，培養(yǎng)48小時(shí)后，采用MTT法檢測細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率明顯低于對照組，表明疫苗能夠有效殺傷表達(dá)E6E7蛋白的細(xì)胞，具有良好的生物學(xué)活性。為了檢測疫苗的穩(wěn)定性，將疫苗分別置于4℃、25℃和37℃條件下保存，定期取樣進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，在4℃條件下保存3個(gè)月，疫苗的粒徑、Zeta電位、純度和活性等指標(biāo)均無明顯變化；在25℃條件下保存1個(gè)月后，疫苗的部分指標(biāo)開始出現(xiàn)輕微變化，但仍在可接受范圍內(nèi)；在37℃條件下保存1周后，疫苗的活性明顯下降，粒徑和Zeta電位也發(fā)生了較大變化，表明疫苗在4℃條件下具有較好的穩(wěn)定性，可滿足疫苗儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)囊蟆?.2免疫原性實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.2.1體液免疫應(yīng)答結(jié)果對實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠血清中特異性抗體的檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠在接種基于HPV18E6E7基因的治療性疫苗后，能夠產(chǎn)生針對HPV18E6E7蛋白的特異性抗體，且抗體水平隨時(shí)間呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化。實(shí)驗(yàn)組1（低劑量組）在首次免疫后14天，血清中檢測到較低水平的特異性IgG抗體，抗體滴度為1:100；隨著免疫次數(shù)的增加，抗體滴度逐漸升高，在第三次免疫后14天，抗體滴度達(dá)到1:800。實(shí)驗(yàn)組2（中劑量組）在首次免疫后14天，抗體滴度為1:200，第三次免疫后14天，抗體滴度升高至1:1600。實(shí)驗(yàn)組3（高劑量組）免疫效果更為顯著，首次免疫后14天，抗體滴度為1:300，第三次免疫后14天，抗體滴度高達(dá)1:3200。陽性對照組接種HPV16E7蛋白疫苗后，同樣產(chǎn)生了特異性抗體，在第三次免疫后14天，抗體滴度達(dá)到1:1200。陰性對照組接種生理鹽水，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中血清中未檢測到特異性抗體。對抗體類型的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中除了IgG抗體外，還檢測到了IgM和IgA抗體。IgM抗體在首次免疫后7天即可檢測到，其水平在首次免疫后14天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。實(shí)驗(yàn)組1、2、3在首次免疫后14天，IgM抗體滴度分別為1:50、1:80、1:100。IgA抗體主要存在于黏膜分泌物中，在免疫小鼠的唾液和陰道分泌物中檢測到了IgA抗體，其水平在第三次免疫后逐漸升高，表明疫苗能夠誘導(dǎo)黏膜局部的免疫應(yīng)答。采用表面等離子共振（SPR）技術(shù)對抗體親和力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中特異性抗體的親和力隨著免疫次數(shù)的增加而增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)組1、2、3在第三次免疫后14天，抗體親和力常數(shù)（KD值）分別為5.6×10??M、3.2×10??M、1.8×10??M。陽性對照組的抗體親和力常數(shù)為4.5×10??M。親和力的增強(qiáng)表明疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體與HPV18E6E7蛋白的結(jié)合能力更強(qiáng)，能夠更有效地中和抗原，發(fā)揮免疫保護(hù)作用。通過繪制抗體滴度隨時(shí)間變化的曲線，可以清晰地看到實(shí)驗(yàn)組小鼠在不同劑量疫苗接種后，抗體滴度逐漸上升并在第三次免疫后達(dá)到較高水平，且維持在相對穩(wěn)定的狀態(tài)，顯示出良好的免疫持久性。5.2.2細(xì)胞免疫應(yīng)答結(jié)果通過流式細(xì)胞術(shù)對實(shí)驗(yàn)組和對照組小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的比例變化進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組小鼠在接種疫苗后，T淋巴細(xì)胞亞群的比例發(fā)生了明顯改變。實(shí)驗(yàn)組1（低劑量組）在第三次免疫后14天，CD4?T淋巴細(xì)胞的比例從免疫前的30%升高至38%，CD8?T淋巴細(xì)胞的比例從免疫前的20%升高至28%。實(shí)驗(yàn)組2（中劑量組）CD4?T淋巴細(xì)胞比例升高至42%，CD8?T淋巴細(xì)胞比例升高至32%。實(shí)驗(yàn)組3（高劑量組）CD4?T淋巴細(xì)胞比例升高至46%，CD8?T淋巴細(xì)胞比例升高至36%。陽性對照組接種HPV16E7蛋白疫苗后，CD4?T淋巴細(xì)胞比例升高至40%，CD8?T淋巴細(xì)胞比例升高至30%。陰性對照組T淋巴細(xì)胞亞群比例在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無明顯變化。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測小鼠血清中細(xì)胞因子的分泌水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠在接種疫苗后，多種細(xì)胞因子的分泌水平顯著升高。實(shí)驗(yàn)組1在第三次免疫后14天，干擾素-γ（IFN-γ）的分泌水平從免疫前的50p