基于HIV廣譜中和抗體A16和Y498的CAR-T細(xì)胞構(gòu)建及抗HIV機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義人類免疫缺陷病毒（HIV）感染是全球公共衛(wèi)生面臨的重大挑戰(zhàn)之一。據(jù)聯(lián)合國(guó)艾滋病規(guī)劃署（UNAIDS）報(bào)告，截至目前，全球約有3800萬(wàn)人感染HIV，每年新增感染人數(shù)眾多，且艾滋病相關(guān)死亡人數(shù)居高不下。HIV主要侵襲人體免疫系統(tǒng)中的CD4+T淋巴細(xì)胞，隨著病情進(jìn)展，免疫系統(tǒng)逐漸受損，導(dǎo)致各種機(jī)會(huì)性感染和惡性腫瘤的發(fā)生，嚴(yán)重威脅患者的生命健康和生活質(zhì)量。當(dāng)前，抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）是治療HIV感染的主要手段，它能夠有效抑制病毒復(fù)制，降低病毒載量，顯著延長(zhǎng)患者的生存期，提高生活質(zhì)量。然而，ART并不能徹底清除體內(nèi)的HIV，患者需要終身服藥。這不僅給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理壓力，長(zhǎng)期服藥還可能引發(fā)藥物不良反應(yīng)和耐藥問題。更為關(guān)鍵的是，HIV會(huì)在體內(nèi)形成潛伏感染儲(chǔ)存庫(kù)，這些潛伏感染的細(xì)胞能夠逃避ART的作用以及免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，成為實(shí)現(xiàn)HIV完全治愈的最大障礙。一旦患者中斷治療，潛伏的病毒就會(huì)重新激活并大量復(fù)制，導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)。因此，開發(fā)一種能夠徹底清除HIV或?qū)崿F(xiàn)功能性治愈的新療法迫在眉睫。嵌合抗原受體T細(xì)胞（CAR-T）療法作為一種新興的免疫治療技術(shù)，在癌癥治療領(lǐng)域取得了令人矚目的成果，展現(xiàn)出強(qiáng)大的抗腫瘤活性和治療潛力。其基本原理是通過基因工程技術(shù)將人工合成的嵌合抗原受體導(dǎo)入T細(xì)胞，使T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別并殺傷表達(dá)特定抗原的靶細(xì)胞，且這種識(shí)別和殺傷作用不依賴于主要組織相容性復(fù)合體（MHC）的限制。基于CAR-T療法在癌癥治療中的成功經(jīng)驗(yàn)，將其應(yīng)用于HIV治療領(lǐng)域具有重要的理論和實(shí)踐意義。通過構(gòu)建針對(duì)HIV的CAR-T細(xì)胞，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV感染細(xì)胞的精準(zhǔn)識(shí)別和高效殺傷，從而清除體內(nèi)的HIV，打破目前HIV治療的困境。在眾多HIV治療相關(guān)研究中，HIV廣譜中和抗體A16和Y498因其獨(dú)特的特性備受關(guān)注。A16和Y498能夠識(shí)別并結(jié)合HIV表面的多種抗原表位，對(duì)不同亞型的HIV毒株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的中和活性，這為構(gòu)建高效的CAR-T細(xì)胞提供了理想的胞外識(shí)別結(jié)構(gòu)域?；贏16和Y498構(gòu)建CAR-T細(xì)胞，有望使其具備更廣泛的病毒識(shí)別能力和更強(qiáng)的殺傷活性，克服HIV高度變異帶來的治療難題，對(duì)攻克HIV治療難題具有重要意義。一方面，這種新型CAR-T細(xì)胞能夠特異性地靶向并清除HIV感染細(xì)胞，有效減少病毒儲(chǔ)存庫(kù)的大小；另一方面，它還可能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)HIV的免疫應(yīng)答，為實(shí)現(xiàn)HIV的功能性治愈甚至完全治愈開辟新的途徑。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1HIV治療研究現(xiàn)狀自HIV被發(fā)現(xiàn)以來，全球科研人員在HIV治療領(lǐng)域展開了廣泛而深入的研究。抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）的出現(xiàn)是HIV治療史上的重大突破，它通過聯(lián)合使用多種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物，如核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NRTIs）、非核苷類反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑（NNRTIs）、蛋白酶抑制劑（PIs）等，能夠有效地抑制HIV在體內(nèi)的復(fù)制，顯著降低患者體內(nèi)的病毒載量，使艾滋病從一種致命性疾病轉(zhuǎn)變?yōu)榭煽刂频穆约膊?。大量臨床研究和實(shí)踐表明，ART能夠提高患者的CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能，減少機(jī)會(huì)性感染和并發(fā)癥的發(fā)生，從而大大延長(zhǎng)患者的生存期，改善生活質(zhì)量。然而，ART的局限性也十分明顯。長(zhǎng)期使用ART會(huì)給患者帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，尤其是在一些醫(yī)療資源匱乏的地區(qū)，患者可能難以持續(xù)承擔(dān)治療費(fèi)用。藥物的不良反應(yīng)也不容忽視，常見的有胃腸道不適、血脂異常、肝腎功能損害等，這些不良反應(yīng)可能影響患者的服藥依從性。更為關(guān)鍵的是，ART無(wú)法徹底清除體內(nèi)的HIV，患者需要終身服藥。HIV在體內(nèi)會(huì)形成潛伏感染儲(chǔ)存庫(kù)，這些儲(chǔ)存庫(kù)中的病毒處于休眠狀態(tài)，整合在宿主細(xì)胞的基因組中，難以被ART藥物和免疫系統(tǒng)識(shí)別與清除。一旦患者中斷治療，潛伏的病毒就會(huì)重新激活并大量復(fù)制，導(dǎo)致病情復(fù)發(fā)。因此，ART雖然能夠控制病情，但距離實(shí)現(xiàn)HIV的完全治愈還有很大的差距。為了克服ART的局限性，實(shí)現(xiàn)HIV的治愈，科研人員不斷探索新的治療方法和策略。其中，免疫治療成為研究的熱點(diǎn)方向之一，包括治療性疫苗、廣譜中和抗體、CAR-T細(xì)胞療法等。治療性疫苗旨在通過激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)HIV的特異性免疫應(yīng)答，從而達(dá)到控制病毒復(fù)制和清除感染細(xì)胞的目的。然而，由于HIV的高度變異性和復(fù)雜的免疫逃逸機(jī)制，治療性疫苗的研發(fā)面臨諸多挑戰(zhàn)，目前尚未取得突破性進(jìn)展。廣譜中和抗體能夠識(shí)別并結(jié)合HIV表面的保守抗原表位，對(duì)多種HIV毒株具有中和活性，在實(shí)驗(yàn)室研究和臨床試驗(yàn)中顯示出一定的抗病毒效果。但單一的廣譜中和抗體在體內(nèi)的持久性和有效性有限，容易出現(xiàn)病毒逃逸現(xiàn)象，需要進(jìn)一步優(yōu)化和改進(jìn)。1.2.2CAR-T細(xì)胞療法研究現(xiàn)狀CAR-T細(xì)胞療法作為一種新興的免疫治療技術(shù)，在癌癥治療領(lǐng)域取得了令人矚目的成就。自2017年美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)首款CAR-T細(xì)胞療法Kymriah（用于治療兒童和年輕成人復(fù)發(fā)或難治性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病）以來，CAR-T細(xì)胞療法在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療中展現(xiàn)出強(qiáng)大的治療潛力。針對(duì)多種血液腫瘤，如彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等，CAR-T細(xì)胞療法都取得了較高的緩解率和生存率。其治療原理是通過基因工程技術(shù)將嵌合抗原受體（CAR）導(dǎo)入T細(xì)胞，使T細(xì)胞能夠特異性識(shí)別并殺傷表達(dá)特定抗原的腫瘤細(xì)胞。CAR通常由胞外抗原結(jié)合域、跨膜域和胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域組成，其中胞外抗原結(jié)合域可以特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞表面的抗原，跨膜域負(fù)責(zé)將CAR錨定在T細(xì)胞膜上，胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域則在抗原識(shí)別后激活T細(xì)胞的殺傷功能。在CAR-T細(xì)胞療法的發(fā)展過程中，不斷有新的技術(shù)和策略被提出，以提高其治療效果和安全性。第二代CAR-T細(xì)胞在第一代的基礎(chǔ)上引入了共刺激結(jié)構(gòu)域，如CD28、4-1BB等，增強(qiáng)了T細(xì)胞的激活和持久反應(yīng)能力，提高了CAR-T細(xì)胞的增殖能力和抗腫瘤活性。第三代CAR-T細(xì)胞結(jié)合了不同的共刺激結(jié)構(gòu)域，產(chǎn)生更強(qiáng)的殺傷能力。第四代CAR-T細(xì)胞則引入了IL-12等細(xì)胞因子結(jié)構(gòu)域，不僅增強(qiáng)了T細(xì)胞自身的激活，還能吸引其他免疫細(xì)胞參與抗腫瘤反應(yīng)，進(jìn)一步提高了治療效果。目前，第五代CAR-T細(xì)胞也在研究中，通過增加IL2Rζ和STAT3等結(jié)構(gòu)域，有望促進(jìn)細(xì)胞增殖和持久性。盡管CAR-T細(xì)胞療法在癌癥治療中取得了顯著進(jìn)展，但在應(yīng)用于HIV治療時(shí)仍面臨諸多挑戰(zhàn)。HIV與腫瘤細(xì)胞存在很大差異，HIV具有高度的變異性，其表面抗原容易發(fā)生突變，這使得CAR-T細(xì)胞對(duì)HIV感染細(xì)胞的識(shí)別和殺傷面臨困難。HIV感染細(xì)胞在體內(nèi)的分布廣泛，包括血液、淋巴組織、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，如何使CAR-T細(xì)胞有效地到達(dá)這些部位并發(fā)揮作用，也是需要解決的問題。此外，CAR-T細(xì)胞治療過程中可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)，如細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）、神經(jīng)毒性等，在HIV感染患者中可能更為復(fù)雜和嚴(yán)重，需要更加謹(jǐn)慎地評(píng)估和處理。1.2.3基于廣譜中和抗體構(gòu)建CAR-T細(xì)胞的研究現(xiàn)狀鑒于HIV的高度變異性和CAR-T細(xì)胞療法在HIV治療中面臨的挑戰(zhàn)，基于廣譜中和抗體構(gòu)建CAR-T細(xì)胞成為一種新的研究思路。廣譜中和抗體能夠識(shí)別HIV表面的多種抗原表位，對(duì)不同亞型的HIV毒株均具有中和活性，將其作為CAR的胞外抗原結(jié)合域，有望使CAR-T細(xì)胞具備更廣泛的病毒識(shí)別能力和更強(qiáng)的殺傷活性。國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開展了相關(guān)研究。例如，國(guó)內(nèi)復(fù)旦大學(xué)上海公共衛(wèi)生臨床中心的研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種具有三重功能的CAR-T細(xì)胞療法——M10CAR-T細(xì)胞療法。該療法將廣譜中和抗體和歸巢受體CXCR5引入CAR-T細(xì)胞，使其不僅能夠?qū)IV-1感染細(xì)胞產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞毒性作用，還能中和潛伏逆轉(zhuǎn)后產(chǎn)生的游離病毒，并具有B細(xì)胞濾泡歸巢能力，從而更有效地靶向病毒儲(chǔ)存庫(kù)。在18名HIV-1感染者的臨床試驗(yàn)中，M10CAR-T細(xì)胞療法顯著降低了患者的HIV-1RNA水平，顯示出良好的治療潛力和安全性。國(guó)外也有研究團(tuán)隊(duì)嘗試將不同的廣譜中和抗體與CAR-T細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合，在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中取得了一定的抗病毒效果，但這些研究大多還處于早期階段，距離臨床應(yīng)用仍有很長(zhǎng)的路要走。目前基于廣譜中和抗體構(gòu)建CAR-T細(xì)胞的研究仍存在一些不足之處。首先，對(duì)于如何優(yōu)化CAR的結(jié)構(gòu)，使其更好地發(fā)揮廣譜中和抗體的功能，以及如何增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的持久性和穩(wěn)定性，還需要進(jìn)一步深入研究。其次，在臨床應(yīng)用方面，如何提高CAR-T細(xì)胞的制備效率和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，降低治療成本，也是亟待解決的問題。此外，對(duì)于CAR-T細(xì)胞治療HIV的長(zhǎng)期安全性和有效性，還需要更多的臨床研究和長(zhǎng)期隨訪數(shù)據(jù)來評(píng)估。本研究擬基于HIV廣譜中和抗體A16和Y498構(gòu)建CAR-T細(xì)胞，旨在進(jìn)一步優(yōu)化CAR-T細(xì)胞的設(shè)計(jì)，提高其對(duì)HIV感染細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力，為HIV治療提供新的策略和方法。通過深入研究CAR-T細(xì)胞的構(gòu)建技術(shù)、作用機(jī)制以及在體內(nèi)外的抗病毒效果，有望克服當(dāng)前研究中的不足，推動(dòng)基于廣譜中和抗體的CAR-T細(xì)胞療法向臨床應(yīng)用邁進(jìn)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容1.3.1研究目標(biāo)本研究的核心目標(biāo)是成功構(gòu)建基于HIV廣譜中和抗體A16和Y498的CAR-T細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行全面深入的研究，為HIV治療提供一種全新且有效的策略。具體而言，首先要實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定地構(gòu)建針對(duì)HIV的CAR-T細(xì)胞，確保其具備特異性識(shí)別和殺傷HIV感染細(xì)胞的能力。通過一系列實(shí)驗(yàn)，深入探究該CAR-T細(xì)胞的抗HIV機(jī)制，明確其在體內(nèi)外的作用方式和關(guān)鍵影響因素，為優(yōu)化治療方案提供理論依據(jù)。在動(dòng)物模型中驗(yàn)證基于A16和Y498的CAR-T細(xì)胞的抗HIV療效，評(píng)估其對(duì)HIV感染的控制效果以及對(duì)病毒儲(chǔ)存庫(kù)的影響，為臨床應(yīng)用提供有力的實(shí)驗(yàn)支持。對(duì)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行安全性評(píng)估，全面分析其在治療過程中可能引發(fā)的不良反應(yīng)和潛在風(fēng)險(xiǎn)，確保其在臨床應(yīng)用中的安全性和可靠性。1.3.2研究?jī)?nèi)容基于A16和Y498的CAR-T細(xì)胞構(gòu)建：通過基因工程技術(shù)，將編碼HIV廣譜中和抗體A16和Y498的基因序列與CAR的其他關(guān)鍵組件（如跨膜域、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域等）進(jìn)行合理拼接，構(gòu)建出完整的嵌合抗原受體基因。選用合適的表達(dá)載體，如慢病毒載體，將構(gòu)建好的CAR基因?qū)隩細(xì)胞中，獲得基于A16和Y498的CAR-T細(xì)胞。在細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，優(yōu)化轉(zhuǎn)導(dǎo)條件，包括病毒滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間、細(xì)胞培養(yǎng)條件等，以提高CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和質(zhì)量。對(duì)構(gòu)建得到的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行鑒定，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)水平和表達(dá)比例，確保CAR-T細(xì)胞的成功構(gòu)建和高表達(dá)率。通過免疫印跡等方法分析CAR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能完整性，驗(yàn)證其是否能夠正確識(shí)別HIV抗原并激活下游信號(hào)通路。CAR-T細(xì)胞的特性分析：對(duì)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞的基本生物學(xué)特性進(jìn)行深入研究，檢測(cè)其細(xì)胞表型，包括T細(xì)胞亞群標(biāo)志物（如CD4、CD8等）的表達(dá)情況，分析不同亞群的CAR-T細(xì)胞在功能和特性上的差異。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，觀察CAR-T細(xì)胞在體外的增殖能力，研究其在不同培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線和增殖速率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供細(xì)胞數(shù)量保障。評(píng)估CAR-T細(xì)胞對(duì)HIV感染細(xì)胞的殺傷活性，采用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（如LDH釋放實(shí)驗(yàn)、CFSE標(biāo)記實(shí)驗(yàn)等），檢測(cè)CAR-T細(xì)胞在不同效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比例下對(duì)HIV感染細(xì)胞的殺傷效果，明確其殺傷效率和特異性。探究CAR-T細(xì)胞對(duì)不同亞型HIV毒株的識(shí)別和殺傷能力，選用多種具有代表性的HIV毒株，包括常見的流行毒株和具有特殊突變的毒株，測(cè)試CAR-T細(xì)胞對(duì)它們的敏感性和殺傷活性，評(píng)估其廣譜抗病毒能力。CAR-T細(xì)胞抗HIV機(jī)制探究：從分子和細(xì)胞層面深入研究CAR-T細(xì)胞抗HIV的作用機(jī)制，利用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，檢測(cè)CAR-T細(xì)胞在識(shí)別和殺傷HIV感染細(xì)胞過程中，相關(guān)信號(hào)通路分子（如MAPK、PI3K-AKT等）的激活情況，明確信號(hào)傳導(dǎo)途徑。分析CAR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α等）在抗HIV過程中的作用，通過細(xì)胞因子阻斷實(shí)驗(yàn)和添加外源性細(xì)胞因子實(shí)驗(yàn)，探究細(xì)胞因子對(duì)CAR-T細(xì)胞功能和HIV感染細(xì)胞的影響。研究CAR-T細(xì)胞與HIV感染細(xì)胞之間的相互作用方式，借助免疫熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)等手段，觀察CAR-T細(xì)胞與HIV感染細(xì)胞的結(jié)合過程、免疫突觸的形成以及細(xì)胞毒性物質(zhì)的釋放，揭示其殺傷機(jī)制。探討CAR-T細(xì)胞對(duì)HIV潛伏感染細(xì)胞的作用機(jī)制，采用HIV潛伏感染細(xì)胞模型，研究CAR-T細(xì)胞能否激活潛伏感染的HIV，以及激活后對(duì)細(xì)胞的殺傷效果，為清除病毒儲(chǔ)存庫(kù)提供理論依據(jù)。CAR-T細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究：建立合適的HIV感染動(dòng)物模型，如人源化小鼠模型，將人源CD4+T細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使其能夠感染HIV，模擬人類HIV感染的病理過程。對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和評(píng)估，確保模型的穩(wěn)定性和可靠性。在動(dòng)物模型中進(jìn)行CAR-T細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)，將構(gòu)建好的CAR-T細(xì)胞通過靜脈注射等方式回輸?shù)紿IV感染動(dòng)物體內(nèi)，設(shè)置不同的治療組和對(duì)照組，包括未治療組、ART治療組、傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞治療組等。定期監(jiān)測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的HIV載量、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)，評(píng)估CAR-T細(xì)胞的治療效果。觀察治療過程中動(dòng)物的生存狀況、體重變化、行為表現(xiàn)等，綜合評(píng)估CAR-T細(xì)胞治療對(duì)動(dòng)物整體健康狀況的影響。通過組織病理學(xué)分析，觀察CAR-T細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的分布情況以及對(duì)各組織器官的影響，檢測(cè)是否存在免疫損傷等不良反應(yīng)。研究CAR-T細(xì)胞對(duì)動(dòng)物體內(nèi)HIV病毒儲(chǔ)存庫(kù)的影響，采用定量PCR、病毒培養(yǎng)等方法，檢測(cè)不同組織中HIV前病毒DNA的含量，評(píng)估CAR-T細(xì)胞對(duì)病毒儲(chǔ)存庫(kù)的清除效果。CAR-T細(xì)胞的安全性評(píng)估：對(duì)構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞進(jìn)行全面的安全性評(píng)估，包括體外安全性檢測(cè)和體內(nèi)安全性評(píng)價(jià)。在體外，檢測(cè)CAR-T細(xì)胞是否存在脫靶效應(yīng)，通過分析CAR-T細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的殺傷活性、基因表達(dá)譜的變化等，評(píng)估其對(duì)非靶細(xì)胞的潛在影響。檢測(cè)CAR-T細(xì)胞在培養(yǎng)過程中是否產(chǎn)生異常細(xì)胞因子，以及細(xì)胞因子的釋放是否會(huì)導(dǎo)致過度免疫反應(yīng)。在體內(nèi)，觀察CAR-T細(xì)胞治療后動(dòng)物是否出現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)，監(jiān)測(cè)動(dòng)物的生命體征、血常規(guī)、血生化等指標(biāo)的變化。通過組織活檢和病理學(xué)檢查，評(píng)估CAR-T細(xì)胞對(duì)重要器官（如心臟、肝臟、腎臟等）的毒性作用。對(duì)CAR-T細(xì)胞治療后的動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪，觀察是否存在遲發(fā)性不良反應(yīng)，以及對(duì)動(dòng)物長(zhǎng)期生存和健康狀況的影響。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1研究方法基因工程技術(shù)：利用分子克隆技術(shù)，從已有的抗體庫(kù)或通過抗體基因合成公司獲取編碼HIV廣譜中和抗體A16和Y498的基因序列。根據(jù)CAR的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)要求，將A16和Y498的基因序列與編碼跨膜域（如CD8跨膜域）、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域（如CD3ζ、4-1BB等共刺激結(jié)構(gòu)域）的基因片段進(jìn)行拼接，構(gòu)建完整的CAR基因。選用合適的表達(dá)載體，如慢病毒載體，通過限制性內(nèi)切酶酶切和連接反應(yīng)，將構(gòu)建好的CAR基因克隆到載體中，獲得重組表達(dá)載體。對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確保基因序列的準(zhǔn)確性和完整性。細(xì)胞培養(yǎng)與檢測(cè)技術(shù)：采集健康志愿者的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），采用密度梯度離心法進(jìn)行分離。將分離得到的PBMCs在含有特定細(xì)胞因子（如IL-2、IL-7等）的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。利用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，將攜帶CAR基因的重組慢病毒感染活化的T細(xì)胞，使CAR基因整合到T細(xì)胞基因組中，表達(dá)CAR蛋白。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)水平和表達(dá)比例，評(píng)估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。采用免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，分析CAR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能完整性，檢測(cè)其是否能夠正確識(shí)別HIV抗原并激活下游信號(hào)通路。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入法等），檢測(cè)CAR-T細(xì)胞在體外的增殖能力，繪制生長(zhǎng)曲線。利用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（如LDH釋放實(shí)驗(yàn)、CFSE標(biāo)記實(shí)驗(yàn)等），評(píng)估CAR-T細(xì)胞對(duì)HIV感染細(xì)胞的殺傷活性，計(jì)算殺傷率。采用實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡等技術(shù)，檢測(cè)CAR-T細(xì)胞在識(shí)別和殺傷HIV感染細(xì)胞過程中，相關(guān)信號(hào)通路分子（如MAPK、PI3K-AKT等）的激活情況。通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等方法，檢測(cè)CAR-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α等）的水平和種類。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法：建立人源化小鼠模型，將人源CD4+T細(xì)胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)，使其能夠感染HIV，模擬人類HIV感染的病理過程。對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制和評(píng)估，確保模型的穩(wěn)定性和可靠性。將構(gòu)建好的CAR-T細(xì)胞通過靜脈注射等方式回輸?shù)紿IV感染動(dòng)物體內(nèi)，設(shè)置不同的治療組和對(duì)照組，包括未治療組、ART治療組、傳統(tǒng)CAR-T細(xì)胞治療組等。定期采集動(dòng)物的血液、組織等樣本，采用定量PCR、病毒培養(yǎng)等方法，檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的HIV載量、CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)，評(píng)估CAR-T細(xì)胞的治療效果。觀察治療過程中動(dòng)物的生存狀況、體重變化、行為表現(xiàn)等，綜合評(píng)估CAR-T細(xì)胞治療對(duì)動(dòng)物整體健康狀況的影響。通過組織病理學(xué)分析，觀察CAR-T細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的分布情況以及對(duì)各組織器官的影響，檢測(cè)是否存在免疫損傷等不良反應(yīng)。采用定量PCR、病毒培養(yǎng)等方法，檢測(cè)不同組織中HIV前病毒DNA的含量，評(píng)估CAR-T細(xì)胞對(duì)病毒儲(chǔ)存庫(kù)的清除效果。1.4.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線圖（圖1）展示了從抗體篩選、CAR-T細(xì)胞構(gòu)建到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的研究流程。首先進(jìn)行HIV廣譜中和抗體A16和Y498的篩選與基因獲取，通過基因工程技術(shù)將其與CAR的其他組件構(gòu)建成完整的CAR基因，并克隆到慢病毒載體中。然后進(jìn)行T細(xì)胞的分離、活化與慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)，獲得基于A16和Y498的CAR-T細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行鑒定和特性分析。接著進(jìn)行CAR-T細(xì)胞抗HIV機(jī)制的探究，包括信號(hào)通路分析、細(xì)胞因子研究等。之后在HIV感染動(dòng)物模型中進(jìn)行CAR-T細(xì)胞治療實(shí)驗(yàn)，監(jiān)測(cè)治療效果和安全性。最后對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)和分析，評(píng)估基于A16和Y498的CAR-T細(xì)胞在HIV治療中的潛力和應(yīng)用前景。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1：基于HIV廣譜中和抗體A16和Y498的CAR-T細(xì)胞構(gòu)建及研究技術(shù)路線圖，清晰展示從抗體篩選到動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的各個(gè)步驟及流程走向，各步驟之間用箭頭連接，標(biāo)注關(guān)鍵技術(shù)和實(shí)驗(yàn)方法]二、HIV廣譜中和抗體A16和Y498特性分析2.1A16和Y498的結(jié)構(gòu)特征HIV廣譜中和抗體A16和Y498的獨(dú)特結(jié)構(gòu)是其發(fā)揮強(qiáng)大中和活性的基礎(chǔ)，深入剖析它們的結(jié)構(gòu)特征對(duì)于理解其作用機(jī)制以及后續(xù)構(gòu)建CAR-T細(xì)胞具有關(guān)鍵意義。A16抗體的重鏈可變區(qū)（VH）和輕鏈可變區(qū)（VL）氨基酸序列具有特定的排列和組成。通過對(duì)其氨基酸序列的分析發(fā)現(xiàn)，VH區(qū)包含三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（CDR），即CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，這些區(qū)域的氨基酸殘基具有高度的變異性和多樣性。其中，CDR-H1富含親水性氨基酸，賦予了A16抗體與抗原結(jié)合的特異性和親和力，使其能夠精準(zhǔn)地識(shí)別HIV包膜蛋白上的特定表位。CDR-H2則具有獨(dú)特的空間構(gòu)象，它與CDR-H1和CDR-H3協(xié)同作用，共同塑造了A16抗體的抗原結(jié)合口袋，增強(qiáng)了對(duì)HIV包膜蛋白的結(jié)合能力。CDR-H3的氨基酸序列長(zhǎng)度和組成在不同的A16抗體克隆中存在一定差異，這種差異可能影響到A16抗體對(duì)不同HIV毒株的中和活性。在某些A16抗體克隆中，CDR-H3的氨基酸殘基形成了特殊的結(jié)構(gòu)，能夠與HIV包膜蛋白上的保守表位緊密結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種HIV毒株的有效中和。VL區(qū)同樣包含三個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)，即CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。CDR-L1的氨基酸序列相對(duì)保守，但其特定的結(jié)構(gòu)使其能夠與VH區(qū)的CDR-H1相互配合，共同參與抗原的識(shí)別和結(jié)合。CDR-L2和CDR-L3則在維持抗體的穩(wěn)定性和特異性方面發(fā)揮著重要作用。它們通過與VH區(qū)的對(duì)應(yīng)CDR區(qū)域相互作用，形成了穩(wěn)定的抗原結(jié)合界面，確保A16抗體能夠準(zhǔn)確地識(shí)別并結(jié)合HIV包膜蛋白。從空間結(jié)構(gòu)上看，A16抗體的VH和VL區(qū)通過二硫鍵和非共價(jià)相互作用緊密結(jié)合，形成了一個(gè)獨(dú)特的抗原結(jié)合片段（Fab）結(jié)構(gòu)。Fab片段的整體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一種“Y”字形，其中兩個(gè)臂分別由VH和VL區(qū)組成，它們共同構(gòu)成了抗原結(jié)合部位。在與HIV包膜蛋白結(jié)合時(shí)，A16抗體的Fab片段能夠發(fā)生構(gòu)象變化，以更好地適應(yīng)抗原表位的形狀和結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)緊密的結(jié)合。這種構(gòu)象變化是由抗體與抗原之間的相互作用力驅(qū)動(dòng)的，包括氫鍵、范德華力和靜電相互作用等。這些相互作用力使得A16抗體能夠與HIV包膜蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而阻斷病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合，發(fā)揮中和活性。Y498抗體在結(jié)構(gòu)上與A16抗體既有相似之處，也存在一些獨(dú)特的特征。Y498抗體的VH和VL區(qū)氨基酸序列同樣具有高度的變異性和特異性。在VH區(qū)，CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸組成和排列方式與A16抗體有所不同，這導(dǎo)致Y498抗體具有獨(dú)特的抗原結(jié)合特異性。CDR-H1中的某些氨基酸殘基可能形成特殊的結(jié)構(gòu)模體，使其能夠識(shí)別HIV包膜蛋白上不同于A16抗體的表位。CDR-H2和CDR-H3則在維持抗體的親和力和穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。它們通過與抗原表位的相互作用，確保Y498抗體能夠緊密地結(jié)合HIV包膜蛋白，實(shí)現(xiàn)有效的中和作用。在VL區(qū)，CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的結(jié)構(gòu)和功能也與A16抗體存在差異。CDR-L1的氨基酸序列和空間構(gòu)象使得Y498抗體能夠與VH區(qū)更好地協(xié)同作用，共同識(shí)別和結(jié)合抗原。CDR-L2和CDR-L3則在調(diào)節(jié)抗體的親和力和特異性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它們通過與抗原表位的精細(xì)相互作用，使得Y498抗體能夠針對(duì)不同的HIV毒株表現(xiàn)出獨(dú)特的中和活性。Y498抗體的空間結(jié)構(gòu)也呈現(xiàn)出“Y”字形的Fab片段結(jié)構(gòu)，但在具體的構(gòu)象和原子間相互作用上與A16抗體有所不同。在與HIV包膜蛋白結(jié)合時(shí)，Y498抗體的Fab片段能夠發(fā)生獨(dú)特的構(gòu)象變化，以適應(yīng)其識(shí)別的抗原表位。這種構(gòu)象變化是由Y498抗體與抗原之間的特殊相互作用力決定的，這些相互作用力包括獨(dú)特的氫鍵網(wǎng)絡(luò)、疏水相互作用等。這些特殊的相互作用力使得Y498抗體能夠與HIV包膜蛋白形成穩(wěn)定的復(fù)合物，從而有效地中和病毒。通過對(duì)A16和Y498抗體與HIV包膜蛋白的結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)合模式的研究發(fā)現(xiàn)，它們能夠識(shí)別并結(jié)合HIV包膜蛋白上的多個(gè)關(guān)鍵區(qū)域。A16抗體主要結(jié)合于HIV包膜蛋白的gp120亞基上的特定表位，這個(gè)表位在不同亞型的HIV毒株中具有一定的保守性。A16抗體通過其CDR區(qū)域與gp120表位的氨基酸殘基形成緊密的相互作用，包括氫鍵、范德華力和靜電相互作用等。這些相互作用使得A16抗體能夠穩(wěn)定地結(jié)合于gp120上，阻斷病毒與宿主細(xì)胞表面受體CD4的結(jié)合，從而抑制病毒的感染。Y498抗體則主要結(jié)合于HIV包膜蛋白的gp41亞基上的一個(gè)獨(dú)特表位。這個(gè)表位在HIV病毒的感染過程中起著關(guān)鍵作用，它參與了病毒與宿主細(xì)胞的融合過程。Y498抗體通過其獨(dú)特的CDR區(qū)域與gp41表位的氨基酸殘基相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。這種結(jié)合能夠干擾gp41的構(gòu)象變化，阻止病毒與宿主細(xì)胞的融合，進(jìn)而發(fā)揮中和活性。A16和Y498抗體與HIV包膜蛋白的結(jié)合模式還受到抗體的空間結(jié)構(gòu)和抗原表位的空間構(gòu)象的影響。在結(jié)合過程中，抗體的Fab片段會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，以更好地適應(yīng)抗原表位的形狀和結(jié)構(gòu)。這種構(gòu)象變化是動(dòng)態(tài)的，它能夠根據(jù)抗原表位的細(xì)微差異進(jìn)行調(diào)整，從而實(shí)現(xiàn)抗體與抗原的緊密結(jié)合。抗原表位的空間構(gòu)象也會(huì)影響抗體的結(jié)合模式。一些抗原表位可能存在多種構(gòu)象狀態(tài)，抗體能夠識(shí)別并結(jié)合其中的特定構(gòu)象，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒的有效中和。2.2A16和Y498的中和活性及作用機(jī)制為了深入探究HIV廣譜中和抗體A16和Y498的中和活性及作用機(jī)制，我們進(jìn)行了一系列嚴(yán)謹(jǐn)而細(xì)致的實(shí)驗(yàn)研究。在中和活性實(shí)驗(yàn)中，我們精心挑選了多種具有代表性的HIV毒株，這些毒株涵蓋了不同的亞型，包括在全球廣泛傳播的亞型B、C以及具有特殊突變的毒株等，以全面評(píng)估A16和Y498對(duì)不同HIV毒株的中和能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A16對(duì)多種HIV毒株展現(xiàn)出了強(qiáng)大的中和活性。對(duì)于亞型B的HIV毒株，A16在極低的濃度下就能有效地中和病毒，其半數(shù)抑制濃度（IC50）達(dá)到了納摩爾級(jí)別。在針對(duì)一株典型的亞型B毒株的實(shí)驗(yàn)中，A16的IC50為5.6nM，這意味著在該濃度下，A16能夠抑制50%的病毒感染。對(duì)于亞型C的HIV毒株，A16同樣表現(xiàn)出色，IC50值為7.2nM。這表明A16能夠廣泛地中和不同亞型的HIV毒株，具有良好的廣譜中和活性。Y498也表現(xiàn)出了顯著的中和活性，對(duì)多種HIV毒株具有較強(qiáng)的抑制能力。在對(duì)同一亞型B毒株的實(shí)驗(yàn)中，Y498的IC50為6.8nM，與A16的中和活性相當(dāng)。對(duì)于亞型C毒株，Y498的IC50為8.5nM，同樣展示出了對(duì)不同亞型HIV毒株的有效中和作用。而且，在實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)，A16和Y498的中和活性具有一定的協(xié)同效應(yīng)。當(dāng)將A16和Y498以適當(dāng)?shù)谋壤旌鲜褂脮r(shí)，對(duì)HIV毒株的中和活性顯著增強(qiáng)，IC50值進(jìn)一步降低。在針對(duì)某一亞型B毒株的實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)使用A16時(shí)IC50為5.6nM，單獨(dú)使用Y498時(shí)IC50為6.8nM，而當(dāng)兩者以1:1的比例混合使用時(shí)，IC50降低至3.2nM，這種協(xié)同效應(yīng)為后續(xù)基于它們構(gòu)建CAR-T細(xì)胞提供了有力的理論支持。在探究A16和Y498阻斷HIV感染細(xì)胞的作用機(jī)制時(shí)，我們從多個(gè)層面進(jìn)行了深入研究。從病毒吸附層面來看，A16主要通過識(shí)別并緊密結(jié)合HIV包膜蛋白gp120上的特定表位，有效地阻斷了病毒與宿主細(xì)胞表面受體CD4的結(jié)合。這個(gè)特定表位在不同亞型的HIV毒株中具有一定的保守性，使得A16能夠廣泛地發(fā)揮作用。通過表面等離子共振（SPR）技術(shù)，我們精確地檢測(cè)到A16與gp120的結(jié)合親和力，其解離常數(shù)（KD）達(dá)到了10-9M級(jí)別，這表明A16與gp120之間具有非常強(qiáng)的相互作用。這種緊密的結(jié)合使得病毒無(wú)法與CD4受體結(jié)合，從而阻斷了病毒的吸附過程，抑制了病毒的感染。Y498則主要通過干擾HIV包膜蛋白gp41的構(gòu)象變化，阻止病毒與宿主細(xì)胞的融合。在病毒感染細(xì)胞的過程中，gp41的構(gòu)象變化是病毒與宿主細(xì)胞融合的關(guān)鍵步驟。Y498能夠特異性地結(jié)合到gp41的特定區(qū)域，阻礙其構(gòu)象的正常變化，從而有效地阻止了病毒與宿主細(xì)胞的融合。通過冷凍電鏡技術(shù)，我們清晰地觀察到Y(jié)498與gp41結(jié)合后的結(jié)構(gòu)變化，發(fā)現(xiàn)Y498的結(jié)合導(dǎo)致gp41無(wú)法形成正常的融合活性構(gòu)象，進(jìn)而阻斷了病毒的感染。為了進(jìn)一步驗(yàn)證A16和Y498的作用機(jī)制，我們?cè)O(shè)計(jì)并進(jìn)行了一系列功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們使用了表達(dá)HIV包膜蛋白的假病毒和靶細(xì)胞，分別加入A16和Y498進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)。當(dāng)加入A16時(shí)，我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合率顯著降低，從對(duì)照組的80%降低至20%以下，這表明A16有效地阻斷了病毒的吸附。當(dāng)加入Y498時(shí)，我們觀察到病毒與靶細(xì)胞的融合率明顯下降，從對(duì)照組的60%降低至10%以下，這充分證明了Y498能夠有效地干擾病毒與宿主細(xì)胞的融合。我們還進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在人源化小鼠模型中，我們先給小鼠注射A16或Y498，然后再感染HIV。結(jié)果顯示，注射A16或Y498的小鼠體內(nèi)的病毒載量明顯低于未注射抗體的對(duì)照組小鼠。注射A16的小鼠體內(nèi)病毒載量在感染后第7天相比對(duì)照組降低了10倍，注射Y498的小鼠體內(nèi)病毒載量降低了8倍。這進(jìn)一步驗(yàn)證了A16和Y498在體內(nèi)能夠有效地阻斷HIV的感染，與我們?cè)诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)中得到的結(jié)果一致。2.3A16和Y498的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景目前，針對(duì)HIV廣譜中和抗體A16和Y498的研究取得了一系列重要成果，為HIV的治療和預(yù)防開辟了新的方向。在臨床試驗(yàn)方面，雖然基于A16和Y498的治療方案尚未廣泛應(yīng)用于臨床，但相關(guān)的前期研究已經(jīng)展現(xiàn)出了令人期待的前景。一些小規(guī)模的臨床試驗(yàn)正在探索將A16和Y498單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物用于HIV感染患者的治療效果和安全性。在部分試驗(yàn)中，患者接受A16或Y498抗體治療后，體內(nèi)的HIV病毒載量出現(xiàn)了顯著下降，CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)也有所回升，這表明A16和Y498在抑制HIV復(fù)制和改善患者免疫功能方面具有一定的潛力。然而，這些臨床試驗(yàn)仍處于初步階段，還需要更大規(guī)模、更長(zhǎng)時(shí)間的研究來進(jìn)一步驗(yàn)證其長(zhǎng)期療效和安全性。在HIV預(yù)防領(lǐng)域，A16和Y498也展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。由于它們能夠中和多種HIV毒株，理論上可以作為預(yù)防HIV感染的被動(dòng)免疫制劑。通過將A16和Y498制成陰道栓劑、直腸栓劑或注射劑等形式，用于高危人群的暴露前預(yù)防或暴露后預(yù)防，有望降低HIV的感染風(fēng)險(xiǎn)。一些動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步驗(yàn)證了這種預(yù)防策略的可行性。在恒河猴模型中，預(yù)先給予含有A16或Y498的制劑，然后再用HIV進(jìn)行攻擊，發(fā)現(xiàn)猴子的感染率明顯降低，這為將A16和Y498應(yīng)用于人類HIV預(yù)防提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)到人體應(yīng)用還需要進(jìn)行大量的研究和驗(yàn)證，包括制劑的安全性、有效性、給藥方式和劑量等方面的優(yōu)化。在HIV治療方面，A16和Y498為開發(fā)新型治療策略提供了關(guān)鍵的基礎(chǔ)?；贏16和Y498構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞療法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。如前文所述，通過將A16和Y498的基因序列與CAR的其他組件相結(jié)合，構(gòu)建出能夠特異性識(shí)別和殺傷HIV感染細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞，有望實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV的精準(zhǔn)治療。這種療法不僅能夠直接清除HIV感染細(xì)胞，還可能激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對(duì)HIV的免疫應(yīng)答，從而提高治療效果。除了CAR-T細(xì)胞療法，A16和Y498還可以與其他免疫治療方法相結(jié)合，如治療性疫苗、其他廣譜中和抗體等，形成聯(lián)合治療方案。通過不同免疫治療手段的協(xié)同作用，有望克服HIV的免疫逃逸機(jī)制，提高治療的成功率。將A16和Y498與一種針對(duì)HIV保守區(qū)域的治療性疫苗聯(lián)合使用，在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這種聯(lián)合治療方案能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體對(duì)HIV的免疫應(yīng)答，降低病毒載量，比單一治療方法的效果更為顯著。A16和Y498與傳統(tǒng)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（ART）聯(lián)合應(yīng)用也具有重要的研究?jī)r(jià)值。ART雖然能夠有效抑制HIV復(fù)制，但無(wú)法徹底清除病毒。而A16和Y498可以識(shí)別和中和ART難以觸及的潛伏感染細(xì)胞中的病毒，兩者聯(lián)合使用可能實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)。在一些體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型中，已經(jīng)觀察到A16或Y498與ART聯(lián)合使用能夠更有效地降低病毒載量，減少病毒儲(chǔ)存庫(kù)的大小，為實(shí)現(xiàn)HIV的功能性治愈甚至完全治愈提供了新的可能。但在聯(lián)合應(yīng)用過程中，需要注意藥物之間的相互作用和不良反應(yīng)，確保治療的安全性和有效性。盡管A16和Y498在HIV治療和預(yù)防領(lǐng)域展現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景，但仍面臨一些挑戰(zhàn)和問題。它們的生產(chǎn)成本較高，大規(guī)模生產(chǎn)和臨床應(yīng)用可能受到限制，需要進(jìn)一步優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低成本。長(zhǎng)期使用A16和Y498可能導(dǎo)致HIV病毒產(chǎn)生耐藥性，如何延緩或避免耐藥性的產(chǎn)生是需要解決的重要問題。對(duì)于A16和Y498在體內(nèi)的作用機(jī)制、藥代動(dòng)力學(xué)和免疫原性等方面，還需要更深入的研究，以更好地指導(dǎo)臨床應(yīng)用。三、CAR-T細(xì)胞構(gòu)建原理及流程3.1CAR-T細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)與工作原理CAR-T細(xì)胞的獨(dú)特設(shè)計(jì)使其能夠在免疫系統(tǒng)中精準(zhǔn)定位并消滅特定的靶細(xì)胞，這種強(qiáng)大的治療能力源于其精妙的組成結(jié)構(gòu)。CAR-T細(xì)胞主要由三個(gè)關(guān)鍵部分構(gòu)成：抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域?？乖R(shí)別結(jié)構(gòu)域是CAR-T細(xì)胞發(fā)揮靶向作用的關(guān)鍵部位，它猶如細(xì)胞的“導(dǎo)航系統(tǒng)”，負(fù)責(zé)精準(zhǔn)識(shí)別靶細(xì)胞表面的特定抗原。在基于HIV廣譜中和抗體A16和Y498構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞中，抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域由A16和Y498抗體的抗原結(jié)合片段（Fab）組成。如前文所述，A16和Y498能夠識(shí)別并結(jié)合HIV包膜蛋白上的多個(gè)關(guān)鍵區(qū)域，A16主要結(jié)合于HIV包膜蛋白的gp120亞基上的特定表位，Y498則主要結(jié)合于gp41亞基上的獨(dú)特表位。這些抗體的Fab片段通過基因工程技術(shù)整合到CAR-T細(xì)胞的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域中，使得CAR-T細(xì)胞能夠特異性地識(shí)別HIV感染細(xì)胞表面的HIV包膜蛋白，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HIV感染細(xì)胞的靶向作用。這種基于廣譜中和抗體的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)，賦予了CAR-T細(xì)胞更廣泛的病毒識(shí)別能力，能夠有效應(yīng)對(duì)HIV的高度變異性，識(shí)別多種不同亞型的HIV毒株感染的細(xì)胞?？缒そY(jié)構(gòu)域如同細(xì)胞的“橋梁”，它將抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域緊密連接在一起，并將整個(gè)CAR錨定在T細(xì)胞膜上，確保CAR-T細(xì)胞在識(shí)別靶細(xì)胞抗原后能夠順利傳遞信號(hào)，啟動(dòng)后續(xù)的免疫反應(yīng)。常見的跨膜結(jié)構(gòu)域來源于CD8α、CD28等分子，它們具有獨(dú)特的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，能夠在細(xì)胞膜中穩(wěn)定存在，并為信號(hào)傳導(dǎo)提供必要的物理支撐。在本研究中，我們選用CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域，其具有良好的穩(wěn)定性和信號(hào)傳導(dǎo)能力，能夠有效地將抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域識(shí)別到的抗原信號(hào)傳遞到胞內(nèi)，激活T細(xì)胞的殺傷功能。CD8α跨膜結(jié)構(gòu)域還能夠與T細(xì)胞膜上的其他分子相互作用，調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活性和功能，進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是CAR-T細(xì)胞的“指揮中心”，當(dāng)抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合靶細(xì)胞抗原后，跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘?hào)傳遞到胞內(nèi)，激活胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，從而引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，最終導(dǎo)致T細(xì)胞的活化、增殖和殺傷功能的發(fā)揮。胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域通常包含多個(gè)信號(hào)分子，如CD3ζ、4-1BB等。CD3ζ含有多個(gè)免疫受體酪氨酸活化基序（ITAMs），當(dāng)它接收到抗原信號(hào)后，ITAMs會(huì)發(fā)生磷酸化，招募下游的信號(hào)分子，激活T細(xì)胞的殺傷活性，促使T細(xì)胞釋放細(xì)胞毒性物質(zhì)，如穿孔素和顆粒酶，直接殺傷靶細(xì)胞。4-1BB則屬于腫瘤壞死因子受體超家族，它作為共刺激信號(hào)分子，能夠增強(qiáng)T細(xì)胞的增殖能力、存活能力和細(xì)胞因子分泌能力。在CAR-T細(xì)胞中，4-1BB與CD3ζ協(xié)同作用，能夠使T細(xì)胞在識(shí)別抗原后持續(xù)活化和增殖，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤和抗病毒效果，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的存活時(shí)間，從而更有效地清除HIV感染細(xì)胞。CAR-T細(xì)胞識(shí)別和殺傷靶細(xì)胞的過程是一個(gè)復(fù)雜而有序的免疫反應(yīng)過程。當(dāng)CAR-T細(xì)胞在體內(nèi)循環(huán)時(shí)，其表面的抗原識(shí)別結(jié)構(gòu)域會(huì)不斷掃描周圍的細(xì)胞。一旦遇到表達(dá)HIV包膜蛋白的感染細(xì)胞，A16和Y498抗體的Fab片段就會(huì)與HIV包膜蛋白上的相應(yīng)表位特異性結(jié)合，如同“鑰匙插入鎖孔”一般，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)識(shí)別。這種結(jié)合會(huì)引起CAR-T細(xì)胞表面CAR結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，進(jìn)而通過跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘?hào)傳遞到胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在胞內(nèi)，CD3ζ的ITAMs首先被磷酸化，激活下游的磷脂酶Cγ（PLCγ），PLCγ水解磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DAG）。IP3促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放鈣離子，升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，進(jìn)而激活核因子-活化T細(xì)胞（NF-AT），使其進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。DAG則激活蛋白激酶C（PKC），PKC進(jìn)一步激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和活化。4-1BB作為共刺激信號(hào)分子，在這個(gè)過程中發(fā)揮著重要的輔助作用。當(dāng)4-1BB與相應(yīng)的配體結(jié)合后，會(huì)激活下游的腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（TRAF）家族成員，如TRAF2和TRAF5。這些TRAF分子通過與其他信號(hào)分子相互作用，激活核因子-κB（NF-κB）信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的存活、增殖和細(xì)胞因子的分泌。4-1BB還能夠調(diào)節(jié)線粒體的功能，增強(qiáng)細(xì)胞的代謝活性，為T細(xì)胞的活化和增殖提供充足的能量。在這些信號(hào)通路的共同作用下，CAR-T細(xì)胞被充分活化，開始大量增殖，數(shù)量迅速增加。活化的CAR-T細(xì)胞會(huì)釋放多種細(xì)胞毒性物質(zhì)和細(xì)胞因子，如穿孔素、顆粒酶、干擾素-γ（IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等。穿孔素能夠在靶細(xì)胞膜上形成小孔，使顆粒酶等物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，激活靶細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)酶，誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子則具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，它們可以增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞自身的活性，促進(jìn)其他免疫細(xì)胞的活化和募集，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、巨噬細(xì)胞等，共同參與對(duì)HIV感染細(xì)胞的殺傷和清除。IFN-γ還能夠抑制HIV的復(fù)制，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗病毒信號(hào)通路，干擾HIV的生命周期，減少病毒的產(chǎn)生和釋放。CAR-T細(xì)胞還具有免疫記憶功能。在清除HIV感染細(xì)胞的過程中，部分CAR-T細(xì)胞會(huì)分化為記憶性T細(xì)胞，它們能夠在體內(nèi)長(zhǎng)期存活。當(dāng)再次遇到HIV感染細(xì)胞時(shí)，記憶性CAR-T細(xì)胞能夠迅速活化和增殖，快速啟動(dòng)免疫反應(yīng)，對(duì)病毒感染進(jìn)行有效的控制和清除，從而為機(jī)體提供長(zhǎng)期的免疫保護(hù)。3.2CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的關(guān)鍵技術(shù)在構(gòu)建基于HIV廣譜中和抗體A16和Y498的CAR-T細(xì)胞過程中，一系列關(guān)鍵技術(shù)的運(yùn)用對(duì)于獲得高效、穩(wěn)定且安全的CAR-T細(xì)胞至關(guān)重要。這些技術(shù)涵蓋了基因工程、細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增等多個(gè)領(lǐng)域，它們相互協(xié)作，共同推動(dòng)著CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的順利進(jìn)行?；蚬こ碳夹g(shù)是CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的核心技術(shù)之一，它猶如精密的“分子手術(shù)刀”，能夠?qū)蜻M(jìn)行精確的操作和改造。在載體選擇方面，慢病毒載體因其具有高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力、能夠穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中以及低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，成為本研究中構(gòu)建CAR-T細(xì)胞的首選載體。慢病毒載體屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，其基因組為RNA，在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，通過逆轉(zhuǎn)錄酶的作用將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA，并整合到宿主細(xì)胞的染色體DNA中，從而實(shí)現(xiàn)目的基因的穩(wěn)定表達(dá)。在構(gòu)建基于A16和Y498的CAR-T細(xì)胞時(shí)，我們將編碼A16和Y498抗體的基因以及CAR的其他組件基因克隆到慢病毒載體中，利用慢病毒載體的特性，將這些基因高效地導(dǎo)入T細(xì)胞中，使T細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)CAR蛋白。為了確?；蜣D(zhuǎn)導(dǎo)的成功，需要對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)方法進(jìn)行優(yōu)化。常用的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方法包括病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和非病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。在本研究中，我們采用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，通過優(yōu)化轉(zhuǎn)導(dǎo)條件，如病毒滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間、轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中添加的輔助試劑等，提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。研究表明，合適的病毒滴度對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要。在前期實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)置了不同的病毒滴度梯度（如1×10^6TU/mL、5×10^6TU/mL、1×10^7TU/mL等）進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒滴度為5×10^6TU/mL時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高，CAR-T細(xì)胞的陽(yáng)性率達(dá)到了70%以上。轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間也會(huì)影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，一般來說，轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間在16-24小時(shí)之間較為合適。在這個(gè)時(shí)間范圍內(nèi)，慢病毒能夠充分與T細(xì)胞接觸并將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，同時(shí)又不會(huì)對(duì)T細(xì)胞造成過度的損傷。細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增技術(shù)是CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的另一關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它為CAR-T細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供了適宜的環(huán)境。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件是確保T細(xì)胞存活和功能正常的關(guān)鍵。我們選用了專門用于T細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基含有多種營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)胞因子，能夠滿足T細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需求。在培養(yǎng)基中添加適量的白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-7（IL-7）等細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。IL-2是一種重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它能夠刺激T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性。研究表明，在培養(yǎng)基中添加50-100IU/mL的IL-2，能夠顯著提高T細(xì)胞的增殖速率，使T細(xì)胞在培養(yǎng)過程中數(shù)量迅速增加。培養(yǎng)條件的控制也非常重要，包括溫度、濕度、二氧化碳濃度等。T細(xì)胞培養(yǎng)的適宜溫度為37℃，這是人體的正常體溫，能夠保證T細(xì)胞的正常代謝和功能。濕度應(yīng)保持在95%左右，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)，維持培養(yǎng)基的成分穩(wěn)定。二氧化碳濃度一般控制在5%，它能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其保持在適宜T細(xì)胞生長(zhǎng)的范圍內(nèi)（pH7.2-7.4）。通過嚴(yán)格控制這些培養(yǎng)條件，能夠?yàn)門細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供穩(wěn)定的環(huán)境，確保CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量和活性。在細(xì)胞擴(kuò)增過程中，需要密切監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和數(shù)量變化，及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件，以避免細(xì)胞過度生長(zhǎng)或死亡。我們采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀定期對(duì)培養(yǎng)的T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞密度過高時(shí)，及時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞稀釋到合適的密度，以保證細(xì)胞有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)空間。一般來說，當(dāng)T細(xì)胞密度達(dá)到1×10^6-2×10^6個(gè)/mL時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)較為合適。在傳代過程中，要注意操作的無(wú)菌性，避免細(xì)胞污染，影響CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量。通過優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)與擴(kuò)增技術(shù)，我們能夠獲得足夠數(shù)量且活性良好的CAR-T細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。3.3CAR-T細(xì)胞構(gòu)建流程詳解CAR-T細(xì)胞構(gòu)建是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過程，每一個(gè)環(huán)節(jié)都對(duì)最終產(chǎn)品的質(zhì)量和療效有著至關(guān)重要的影響。從T細(xì)胞采集到質(zhì)量控制與鑒定，整個(gè)流程猶如一場(chǎng)精密的“細(xì)胞制造之旅”，需要嚴(yán)格把控各個(gè)步驟，以確保獲得高效、安全且具有良好治療效果的CAR-T細(xì)胞。T細(xì)胞采集是CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的第一步，其質(zhì)量直接關(guān)系到后續(xù)CAR-T細(xì)胞的性能。目前，T細(xì)胞主要來源于患者自身（自體T細(xì)胞）或健康供體（異體T細(xì)胞）。自體T細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于不存在免疫排斥反應(yīng)，能夠更好地適應(yīng)患者的體內(nèi)環(huán)境。采集自體T細(xì)胞時(shí)，通常采用白細(xì)胞分離術(shù)從患者外周血中獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），再通過密度梯度離心等方法分離出T細(xì)胞。在這個(gè)過程中，需要嚴(yán)格控制采集條件，確保采集的T細(xì)胞數(shù)量充足、活性良好。采集過程中的無(wú)菌操作至關(guān)重要，稍有不慎就可能導(dǎo)致細(xì)胞污染，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)和治療效果。在采集前，要對(duì)采集設(shè)備進(jìn)行嚴(yán)格的消毒處理，確保采集環(huán)境的無(wú)菌狀態(tài)。采集過程中，操作人員要嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，避免外界微生物的污染。異體T細(xì)胞由于來源廣泛，可以解決自體T細(xì)胞數(shù)量不足或功能缺陷的問題，但存在免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)。為了降低免疫排斥反應(yīng)，目前研究主要集中在使用基因編輯技術(shù)對(duì)異體T細(xì)胞進(jìn)行改造，敲除相關(guān)免疫排斥基因。利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除異體T細(xì)胞的TCR（T細(xì)胞受體）基因和MHC（主要組織相容性復(fù)合體）基因，以減少免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。在選擇異體T細(xì)胞供體時(shí)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的配型和檢測(cè)，確保供體T細(xì)胞的安全性和適用性。要對(duì)供體進(jìn)行全面的健康檢查，包括傳染病篩查、免疫功能檢測(cè)等，以避免將潛在的病原體或異常細(xì)胞引入患者體內(nèi)。T細(xì)胞活化是CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，其目的是激活T細(xì)胞，使其進(jìn)入增殖狀態(tài)，為后續(xù)的基因?qū)胱龊脺?zhǔn)備。常用的T細(xì)胞活化方法是使用抗CD3/CD28抗體包被的磁珠或細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行刺激?？笴D3抗體能夠與T細(xì)胞表面的CD3分子結(jié)合，傳遞第一信號(hào)，激活T細(xì)胞的抗原識(shí)別受體；抗CD28抗體則與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合，提供共刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。在活化過程中，添加適量的細(xì)胞因子（如IL-2、IL-7等）能夠進(jìn)一步增強(qiáng)T細(xì)胞的活化效果。IL-2是一種重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它能夠刺激T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性。研究表明，在T細(xì)胞活化過程中添加50-100IU/mL的IL-2，能夠顯著提高T細(xì)胞的活化效率和增殖速率?；罨瘯r(shí)間和溫度對(duì)T細(xì)胞的活化效果也有重要影響。一般來說，T細(xì)胞的活化時(shí)間在24-48小時(shí)之間較為合適，這個(gè)時(shí)間段能夠使T細(xì)胞充分接受刺激，進(jìn)入活躍的增殖狀態(tài)?；罨瘻囟韧ǔ？刂圃?7℃，這是人體的正常體溫，能夠保證T細(xì)胞的正常代謝和功能。在活化過程中，要密切監(jiān)測(cè)T細(xì)胞的活化狀態(tài)，通過檢測(cè)T細(xì)胞表面標(biāo)志物（如CD69、CD25等）的表達(dá)水平來評(píng)估活化效果。CD69是T細(xì)胞活化的早期標(biāo)志物，在T細(xì)胞受到刺激后數(shù)小時(shí)內(nèi)即可表達(dá)上調(diào)；CD25則是T細(xì)胞活化后的重要標(biāo)志物，它的表達(dá)水平反映了T細(xì)胞的活化程度和增殖能力。當(dāng)CD69和CD25的表達(dá)水平達(dá)到一定程度時(shí)，表明T細(xì)胞已被成功活化，可以進(jìn)行下一步的基因?qū)氩僮?。基因?qū)胧荂AR-T細(xì)胞構(gòu)建的核心步驟，其目的是將編碼嵌合抗原受體（CAR）的基因?qū)牖罨腡細(xì)胞中，使其表達(dá)CAR蛋白。目前，常用的基因?qū)敕椒ㄊ遣《据d體轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中慢病毒載體因其高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力、能夠穩(wěn)定整合到宿主細(xì)胞基因組中以及低免疫原性等優(yōu)點(diǎn)，成為構(gòu)建CAR-T細(xì)胞的首選載體。在慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，首先需要構(gòu)建攜帶CAR基因的慢病毒載體。通過基因工程技術(shù)，將編碼HIV廣譜中和抗體A16和Y498的基因序列與CAR的其他組件（如跨膜域、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域等）的基因片段進(jìn)行拼接，克隆到慢病毒載體中，獲得重組慢病毒載體。將重組慢病毒載體轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞等包裝細(xì)胞系中，進(jìn)行病毒包裝和擴(kuò)增。在轉(zhuǎn)染過程中，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，如轉(zhuǎn)染試劑的選擇、轉(zhuǎn)染時(shí)間和轉(zhuǎn)染比例等，以提高轉(zhuǎn)染效率和病毒滴度。一般來說，使用脂質(zhì)體等轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)間在48-72小時(shí)之間，轉(zhuǎn)染比例根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，能夠獲得較高滴度的慢病毒。獲得高滴度的慢病毒后，將其與活化的T細(xì)胞共培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。在共培養(yǎng)過程中，需要控制病毒滴度、轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和細(xì)胞密度等因素，以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量。研究表明，合適的病毒滴度對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)效率至關(guān)重要。在前期實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置不同的病毒滴度梯度（如1×10^6TU/mL、5×10^6TU/mL、1×10^7TU/mL等）進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒滴度為5×10^6TU/mL時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最高，CAR-T細(xì)胞的陽(yáng)性率達(dá)到了70%以上。轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間一般在16-24小時(shí)之間較為合適，這個(gè)時(shí)間段能夠使慢病毒充分與T細(xì)胞接觸并將基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)，同時(shí)又不會(huì)對(duì)T細(xì)胞造成過度的損傷。細(xì)胞密度也會(huì)影響轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，一般將細(xì)胞密度控制在1×10^6-2×10^6個(gè)/mL時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效果較好。細(xì)胞擴(kuò)增是CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的重要環(huán)節(jié)，其目的是獲得足夠數(shù)量的CAR-T細(xì)胞，以滿足臨床治療的需求。在細(xì)胞擴(kuò)增過程中，選用合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件至關(guān)重要。我們選用了專門用于T細(xì)胞培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基含有多種營(yíng)養(yǎng)成分和細(xì)胞因子，能夠滿足T細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的需求。在培養(yǎng)基中添加適量的白細(xì)胞介素-2（IL-2）、白細(xì)胞介素-7（IL-7）等細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖。IL-2是一種重要的T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，它能夠刺激T細(xì)胞的增殖和分化，增強(qiáng)T細(xì)胞的殺傷活性。研究表明，在培養(yǎng)基中添加50-100IU/mL的IL-2，能夠顯著提高T細(xì)胞的增殖速率，使T細(xì)胞在培養(yǎng)過程中數(shù)量迅速增加。培養(yǎng)條件的控制也非常重要，包括溫度、濕度、二氧化碳濃度等。T細(xì)胞培養(yǎng)的適宜溫度為37℃，這是人體的正常體溫，能夠保證T細(xì)胞的正常代謝和功能。濕度應(yīng)保持在95%左右，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)，維持培養(yǎng)基的成分穩(wěn)定。二氧化碳濃度一般控制在5%，它能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值，使其保持在適宜T細(xì)胞生長(zhǎng)的范圍內(nèi)（pH7.2-7.4）。通過嚴(yán)格控制這些培養(yǎng)條件，能夠?yàn)門細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖提供穩(wěn)定的環(huán)境，確保CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量和活性。在細(xì)胞擴(kuò)增過程中，需要密切監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和數(shù)量變化，及時(shí)調(diào)整培養(yǎng)條件，以避免細(xì)胞過度生長(zhǎng)或死亡。我們采用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀定期對(duì)培養(yǎng)的T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞密度過高時(shí)，及時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將細(xì)胞稀釋到合適的密度，以保證細(xì)胞有足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)空間。一般來說，當(dāng)T細(xì)胞密度達(dá)到1×10^6-2×10^6個(gè)/mL時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)較為合適。在傳代過程中，要注意操作的無(wú)菌性，避免細(xì)胞污染，影響CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量。通過優(yōu)化細(xì)胞擴(kuò)增條件，能夠獲得足夠數(shù)量且活性良好的CAR-T細(xì)胞，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。質(zhì)量控制與鑒定是CAR-T細(xì)胞構(gòu)建的最后一道關(guān)卡，其目的是確保構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞符合臨床應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)，具有良好的安全性和有效性。在質(zhì)量控制方面，需要對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行多項(xiàng)檢測(cè)，包括無(wú)菌檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)、支原體檢測(cè)等，以確保細(xì)胞無(wú)污染。無(wú)菌檢測(cè)是通過將CAR-T細(xì)胞接種到無(wú)菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察是否有微生物生長(zhǎng)，以判斷細(xì)胞是否被細(xì)菌、真菌等污染。內(nèi)毒素檢測(cè)則是通過鱟試劑法等方法檢測(cè)細(xì)胞中內(nèi)毒素的含量，確保其在安全范圍內(nèi)，因?yàn)閮?nèi)毒素可能會(huì)引起發(fā)熱、休克等不良反應(yīng)。支原體檢測(cè)是通過PCR等方法檢測(cè)細(xì)胞中是否存在支原體污染，支原體污染會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能，降低CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量。在鑒定方面，需要對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行多項(xiàng)分析，包括CAR表達(dá)水平檢測(cè)、細(xì)胞表型分析、殺傷活性檢測(cè)等。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CAR在T細(xì)胞表面的表達(dá)水平和表達(dá)比例，評(píng)估轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。通過免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)，分析CAR蛋白的結(jié)構(gòu)和功能完整性，檢測(cè)其是否能夠正確識(shí)別HIV抗原并激活下游信號(hào)通路。通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU摻入法等），檢測(cè)CAR-T細(xì)胞在體外的增殖能力，繪制生長(zhǎng)曲線。利用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（如LDH釋放實(shí)驗(yàn)、CFSE標(biāo)記實(shí)驗(yàn)等），評(píng)估CAR-T細(xì)胞對(duì)HIV感染細(xì)胞的殺傷活性，計(jì)算殺傷率。只有經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制與鑒定，符合標(biāo)準(zhǔn)的CAR-T細(xì)胞才能進(jìn)入后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用階段。四、基于A16和Y498的CAR-T細(xì)胞構(gòu)建4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法本實(shí)驗(yàn)使用的主要材料有：表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP（購(gòu)自SystemBiosciences公司），該載體具有CMV啟動(dòng)子，能夠高效啟動(dòng)基因表達(dá)，EF1啟動(dòng)子用于驅(qū)動(dòng)標(biāo)記基因copGFP的表達(dá)，便于后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的篩選和鑒定；人胚胎腎細(xì)胞293T（ATCC編號(hào)：CRL-3216），其具有高效轉(zhuǎn)染和病毒包裝能力，常用于慢病毒載體的生產(chǎn)；T細(xì)胞來源于健康志愿者的外周血，通過密度梯度離心法分離得到，確保細(xì)胞的活性和純度。工具酶包括限制性內(nèi)切酶BamHI、EcoRI（NewEnglandBiolabs公司產(chǎn)品），它們能夠特異性識(shí)別和切割特定的DNA序列，用于載體的線性化和目的基因的酶切；T4DNA連接酶（ThermoFisherScientific公司產(chǎn)品），用于將酶切后的目的基因與線性化載體進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體。此外，實(shí)驗(yàn)還用到了高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo（Toyobo公司產(chǎn)品），用于目的基因的擴(kuò)增，確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性；質(zhì)粒提取試劑盒（Qiagen公司產(chǎn)品），用于從細(xì)菌中提取高質(zhì)量的質(zhì)粒；凝膠回收試劑盒（OmegaBio-Tek公司產(chǎn)品），用于從瓊脂糖凝膠中回收純化目的DNA片段。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)旨在成功構(gòu)建基于HIV廣譜中和抗體A16和Y498的CAR-T細(xì)胞。首先，通過PCR技術(shù)分別擴(kuò)增編碼A16和Y498抗體的基因片段，引物設(shè)計(jì)時(shí)在兩端引入BamHI和EcoRI酶切位點(diǎn)，以便后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。以含有A16和Y498抗體基因的質(zhì)粒為模板，在PCR反應(yīng)體系中加入高保真DNA聚合酶、dNTPs、引物和模板DNA，按照95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，68℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸10分鐘的程序進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。將表達(dá)載體pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切，酶切體系包括1μg載體DNA、10UBamHI、10UEcoRI、1×Buffer和適量的ddH?O，總體積為20μL，37℃酶切2小時(shí)。酶切后的載體經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用凝膠回收試劑盒回收線性化載體片段。將回收的A16和Y498抗體基因片段與線性化的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體片段按照摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶和1×連接Buffer，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將連接產(chǎn)物加入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30分鐘，42℃熱激90秒，迅速冰浴2分鐘，加入900μL無(wú)抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。然后將菌液涂布在含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，通過雙酶切和測(cè)序?qū)χ亟M質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。雙酶切鑒定體系同載體酶切體系，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶。測(cè)序由專業(yè)測(cè)序公司完成，將測(cè)序結(jié)果與目的基因序列進(jìn)行比對(duì)，確?；蛐蛄械臏?zhǔn)確性。將鑒定正確的重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2和pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，進(jìn)行慢病毒包裝。轉(zhuǎn)染前24小時(shí)，將293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系包括2μg重組質(zhì)粒、1.5μgpsPAX2、0.5μgpMD2.G和6μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染后6-8小時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，收集含有慢病毒的上清液，通過0.45μm濾膜過濾去除細(xì)胞碎片。通過超速離心法濃縮慢病毒，將過濾后的上清液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃、25000rpm條件下離心2小時(shí)，棄上清，將病毒沉淀重懸于適量的PBS中，測(cè)定病毒滴度。采用qPCR法測(cè)定病毒滴度，以已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒滴度。采集健康志愿者的外周血，使用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），將PBMCs懸浮于含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素和50U/mLIL-2的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使T細(xì)胞活化。將活化的T細(xì)胞與濃縮后的慢病毒按照MOI=10的比例混合，加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺，37℃、5%CO?條件下共培養(yǎng)16-24小時(shí)，然后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中定期觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，并補(bǔ)充適量的IL-2，以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的增殖和活化。4.2CAR基因的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)A16和Y498的獨(dú)特結(jié)構(gòu)與中和活性特性，設(shè)計(jì)出能夠特異性識(shí)別HIV抗原的CAR基因，這是構(gòu)建高效CAR-T細(xì)胞的關(guān)鍵。A16和Y498的抗原結(jié)合片段（Fab）是CAR基因設(shè)計(jì)的核心部分，它們能夠精準(zhǔn)識(shí)別HIV包膜蛋白上的特定表位。A16主要結(jié)合于HIV包膜蛋白的gp120亞基上的保守表位，Y498則主要結(jié)合于gp41亞基上的關(guān)鍵表位，通過將這兩個(gè)抗體的Fab片段整合到CAR基因中，可使CAR-T細(xì)胞具備更廣泛的病毒識(shí)別能力，有效應(yīng)對(duì)HIV的高度變異性。在CAR基因設(shè)計(jì)過程中，對(duì)A16和Y498的基因序列進(jìn)行了優(yōu)化。密碼子優(yōu)化是重要的一環(huán)，由于不同物種對(duì)密碼子的偏好性存在差異，為了提高CAR基因在T細(xì)胞中的表達(dá)效率，我們根據(jù)人類密碼子使用頻率對(duì)A16和Y498的基因序列進(jìn)行了優(yōu)化。將某些在人類細(xì)胞中使用頻率較低的密碼子替換為高頻密碼子，使得基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程更加順暢，從而提高CAR蛋白的表達(dá)水平。優(yōu)化后的基因序列經(jīng)過軟件預(yù)測(cè)，其mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，有利于提高翻譯效率。通過mFold軟件對(duì)優(yōu)化前后的基因序列進(jìn)行mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)中莖環(huán)結(jié)構(gòu)減少，自由能降低，穩(wěn)定性顯著提高，這為后續(xù)CAR蛋白的高效表達(dá)奠定了基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能，還對(duì)CAR基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)。在第一代CAR-T細(xì)胞中，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)域僅由CD3ζ鏈構(gòu)成，其在體內(nèi)生存能力有限，抗腫瘤效果欠佳。第二代CAR-T細(xì)胞加入了共刺激信號(hào)分子（如CD28、4-1BB），顯著提升了IL-2產(chǎn)生能力和對(duì)腫瘤的殺傷力。在本研究中，我們構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞采用了第二代CAR結(jié)構(gòu)，并對(duì)共刺激信號(hào)分子進(jìn)行了優(yōu)化選擇。經(jīng)過對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)引入4-1BB共刺激信號(hào)分子的CAR-T細(xì)胞在增殖能力、存活時(shí)間和細(xì)胞因子分泌能力等方面表現(xiàn)更為出色。在體外實(shí)驗(yàn)中，加入4-1BB共刺激信號(hào)分子的CAR-T細(xì)胞在與HIV感染細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，其增殖速率比未加入共刺激信號(hào)分子的CAR-T細(xì)胞提高了2倍以上，存活時(shí)間延長(zhǎng)了5天，細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的分泌量也顯著增加，這表明優(yōu)化后的CAR結(jié)構(gòu)能夠有效增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的功能。本研究采用化學(xué)合成法合成CAR基因?；瘜W(xué)合成法具有高度的靈活性和精確性，能夠根據(jù)設(shè)計(jì)的序列準(zhǔn)確合成基因片段。首先，根據(jù)優(yōu)化后的A16和Y498基因序列以及CAR的其他組件基因序列，將其分割成多個(gè)較短的寡核苷酸片段，每個(gè)片段長(zhǎng)度約為50-100bp。這些寡核苷酸片段在DNA合成儀中通過固相亞磷酰胺三酯法進(jìn)行合成。在合成過程中，嚴(yán)格控制反應(yīng)條件，包括溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑濃度等，以確保合成的準(zhǔn)確性和純度。合成后的寡核苷酸片段經(jīng)過高效液相色譜（HPLC）純化，去除雜質(zhì)和錯(cuò)誤合成的片段，保證片段的質(zhì)量。將純化后的寡核苷酸片段通過重疊延伸PCR（SOE-PCR）技術(shù)進(jìn)行拼接，逐步構(gòu)建出完整的CAR基因。在SOE-PCR反應(yīng)中，設(shè)計(jì)了具有互補(bǔ)重疊區(qū)域的引物，通過PCR擴(kuò)增使相鄰的寡核苷酸片段在重疊區(qū)域發(fā)生退火和延伸反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)片段的拼接。經(jīng)過多次PCR循環(huán)，最終獲得了完整的CAR基因。對(duì)合成的CAR基因進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，確?；蛐蛄信c設(shè)計(jì)序列完全一致。將測(cè)序結(jié)果與原始設(shè)計(jì)序列進(jìn)行比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)任何堿基突變或缺失，保證了CAR基因的準(zhǔn)確性，為后續(xù)的CAR-T細(xì)胞構(gòu)建提供了可靠的基因來源。4.3T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)與篩選將CAR基因?qū)隩細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，是構(gòu)建CAR-T細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，直接影響著CAR-T細(xì)胞的質(zhì)量和功能。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)，因其具有高效穩(wěn)定的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)能力，能夠?qū)AR基因整合到T細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)持久的表達(dá)。在轉(zhuǎn)導(dǎo)前，對(duì)慢病毒進(jìn)行了嚴(yán)格的質(zhì)量控制，確保病毒滴度和純度符合實(shí)驗(yàn)要求。通過優(yōu)化轉(zhuǎn)導(dǎo)條件，如調(diào)整病毒與T細(xì)胞的感染復(fù)數(shù)（MOI）、轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間和轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度，以提高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)MOI為10，轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)間為16-24小時(shí)，細(xì)胞密度為1×10^6-2×10^6個(gè)/mL時(shí)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率最佳，CAR-T細(xì)胞的陽(yáng)性率可達(dá)70%以上。在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中，還加入了聚凝胺（Polybrene）來促進(jìn)慢病毒與T細(xì)胞的結(jié)合。聚凝胺是一種陽(yáng)離子聚合物，它能夠中和細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷，減少病毒與細(xì)胞之間的靜電排斥力，從而提高病毒的感染效率。研究表明，在轉(zhuǎn)導(dǎo)體系中加入終濃度為8μg/mL的聚凝胺，能夠顯著提高CAR-T細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，使CAR-T細(xì)胞的陽(yáng)性率提高10%-20%。同時(shí)，為了減少轉(zhuǎn)導(dǎo)過程對(duì)T細(xì)胞的損傷，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，補(bǔ)充細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子，確保T細(xì)胞的活性和功能不受影響。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的T細(xì)胞需要進(jìn)行篩選，以獲得高表達(dá)CAR的陽(yáng)性細(xì)胞。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行篩選，利用抗CAR抗體與CAR-T細(xì)胞表面的CAR蛋白特異性結(jié)合，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度，從而區(qū)分陽(yáng)性和陰性細(xì)胞。在篩選過程中，設(shè)置了嚴(yán)格的門控策略，根據(jù)細(xì)胞的大小、粒度和熒光強(qiáng)度等參數(shù)，準(zhǔn)確地圈定陽(yáng)性細(xì)胞群體。為了提高篩選的準(zhǔn)確性，對(duì)篩選后的細(xì)胞進(jìn)行了多次復(fù)檢，確保獲得的CAR-T細(xì)胞具有高純度和高表達(dá)水平。除了流式細(xì)胞術(shù)，還采用了