傳染病檢測(cè)技術(shù)規(guī)定一、概述

傳染病檢測(cè)是預(yù)防和控制傳染病傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為確保檢測(cè)工作的科學(xué)性、規(guī)范性和有效性，特制定本技術(shù)規(guī)定。本規(guī)定涵蓋了檢測(cè)方法的選擇、樣本采集、實(shí)驗(yàn)室操作、結(jié)果報(bào)告及質(zhì)量控制等方面，旨在為相關(guān)機(jī)構(gòu)提供統(tǒng)一的操作指南，降低檢測(cè)誤差，提高公共衛(wèi)生應(yīng)急響應(yīng)能力。

二、檢測(cè)方法的選擇與實(shí)施

（一）檢測(cè)方法的選擇

1.根據(jù)傳染病的病原體類型（如病毒、細(xì)菌、真菌等）選擇合適的檢測(cè)技術(shù)。

2.常用檢測(cè)技術(shù)包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)等。

3.優(yōu)先選擇高靈敏度、高特異性的檢測(cè)方法，確保結(jié)果準(zhǔn)確性。

（二）檢測(cè)方法的實(shí)施

1.PCR檢測(cè)：

(1)樣本提?。菏褂蒙虡I(yè)試劑盒或自行優(yōu)化提取方案，確保核酸完整性和純度。

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：優(yōu)化引物濃度、退火溫度及循環(huán)條件，設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

(3)結(jié)果判讀：根據(jù)熒光曲線變化和閾值線判斷結(jié)果，陽性樣本需進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

2.ELISA檢測(cè)：

(1)樣本預(yù)處理：離心處理血清或血漿，去除雜質(zhì)。

(2)加樣與孵育：按照試劑盒說明書進(jìn)行加樣，設(shè)置空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔。

(3)結(jié)果計(jì)算：通過酶標(biāo)儀讀取吸光度值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

三、樣本采集與處理

（一）樣本采集

1.根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇合適的樣本類型，如呼吸道樣本（鼻咽拭子）、血液樣本、糞便樣本等。

2.采集過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，避免交叉污染。

3.樣本采集工具需一次性使用，采集后立即密封保存。

（二）樣本處理

1.呼吸道樣本：

(1)使用生理鹽水濕潤(rùn)拭子，深入鼻腔或口腔擦拭黏膜。

(2)將拭子頭置于保存液中充分混勻，立即送檢。

2.血液樣本：

(1)靜脈采血，采集量需滿足檢測(cè)需求（如3-5ml）。

(2)血液樣本需盡快分離血清或直接用于ELISA檢測(cè)。

四、實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求

1.實(shí)驗(yàn)室需具備生物安全等級(jí)，配備通風(fēng)柜、超凈工作臺(tái)等設(shè)備。

2.操作區(qū)域需定期消毒，使用75%酒精或含氯消毒劑進(jìn)行表面處理。

（二）操作流程

1.樣本接收：核對(duì)樣本信息，檢查樣本完整性，記錄接收時(shí)間。

2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：校準(zhǔn)儀器，檢查試劑有效期，配制所需工作液。

3.實(shí)驗(yàn)過程：嚴(yán)格按照檢測(cè)方法步驟操作，每步完成后記錄關(guān)鍵參數(shù)（如溫度、時(shí)間）。

4.結(jié)果復(fù)核：檢測(cè)人員需獨(dú)立驗(yàn)證結(jié)果，陽性樣本需由雙人復(fù)核。

五、質(zhì)量控制與結(jié)果報(bào)告

（一）質(zhì)量控制措施

1.每批次檢測(cè)需包含陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照，確保檢測(cè)有效性。

2.定期進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，使用質(zhì)控品評(píng)估檢測(cè)穩(wěn)定性，如連續(xù)3次檢測(cè)結(jié)果在允許范圍內(nèi)。

3.外部質(zhì)評(píng)：參與第三方機(jī)構(gòu)組織的檢測(cè)能力驗(yàn)證，確保實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)。

（二）結(jié)果報(bào)告

1.報(bào)告內(nèi)容：包括樣本編號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目、結(jié)果（陽性/陰性）、檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)人員簽名。

2.異常結(jié)果處理：陽性樣本需立即復(fù)核，必要時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序或進(jìn)一步檢測(cè)。

3.報(bào)告保存：檢測(cè)報(bào)告需存檔3年以上，便于追溯和審核。

六、應(yīng)急響應(yīng)與廢棄物處理

（一）應(yīng)急響應(yīng)

1.如出現(xiàn)檢測(cè)儀器故障或試劑失效，需立即更換設(shè)備或試劑，并重新檢測(cè)樣本。

2.遇疑似大規(guī)模感染，需啟動(dòng)應(yīng)急預(yù)案，增加檢測(cè)負(fù)荷，協(xié)調(diào)資源保障檢測(cè)效率。

（二）廢棄物處理

1.檢測(cè)廢棄物（如樣本管、拭子等）需分類收集，使用雙層垃圾袋封存。

2.化學(xué)廢棄物需經(jīng)滅活處理后無害化處理，生物廢棄物需高溫高壓滅菌。

七、培訓(xùn)與監(jiān)督

（一）人員培訓(xùn)

1.檢測(cè)人員需接受系統(tǒng)培訓(xùn)，掌握樣本采集、實(shí)驗(yàn)室操作、結(jié)果判讀等技能。

2.每年進(jìn)行技能考核，確保操作規(guī)范性。

（二）監(jiān)督機(jī)制

1.設(shè)立內(nèi)部審核小組，定期檢查檢測(cè)流程符合性。

2.外部機(jī)構(gòu)可進(jìn)行不定期抽查，確保持續(xù)改進(jìn)。

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二、檢測(cè)方法的選擇與實(shí)施

（一）檢測(cè)方法的選擇

1.根據(jù)傳染病的病原體類型（如病毒、細(xì)菌、真菌等）選擇合適的檢測(cè)技術(shù)。

病毒檢測(cè)：對(duì)于RNA病毒（如流感病毒、冠狀病毒）或DNA病毒（如皰疹病毒），PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）或測(cè)序技術(shù)是常用方法，能提供高靈敏度和高特異性?？乖瓩z測(cè)則速度快，適用于急性期篩查。對(duì)于某些病毒（如乙肝病毒），ELISA檢測(cè)可用于檢測(cè)病毒標(biāo)志物（如HBsAg、HBeAb）。

細(xì)菌檢測(cè)：常用的方法包括核酸檢測(cè)（如檢測(cè)細(xì)菌特定基因）、培養(yǎng)法（傳統(tǒng)但耗時(shí)長(zhǎng)）、以及快速抗原檢測(cè)（如肺炎鏈球菌抗原）。對(duì)于某些細(xì)菌感染，血清學(xué)檢測(cè)（如檢測(cè)抗體）也可作為輔助手段。

真菌檢測(cè)：真菌培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)，但周期長(zhǎng)?？焖俜椒òㄕ婢乖瓩z測(cè)（如隱球菌抗原）、真菌核酸檢測(cè)（如檢測(cè)念珠菌DNA），以及顯微鏡下真菌形態(tài)學(xué)觀察。

2.根據(jù)檢測(cè)目的選擇方法：

診斷目的：需要高靈敏度和高特異性方法，如PCR或培養(yǎng)?？焖俸Y查可選用抗原檢測(cè)。

流行病學(xué)調(diào)查：可能需要高通量、快速的方法，如抗原檢測(cè)或PCR芯片，以覆蓋大量樣本。

病原體分型/溯源：需要測(cè)序技術(shù)（如基因測(cè)序、宏基因組測(cè)序）。

3.考慮樣本類型和檢測(cè)窗口期：

呼吸道樣本：PCR和抗原檢測(cè)是常用方法。

血液樣本：核酸檢測(cè)、ELISA、冷凝集試驗(yàn)等。

糞便樣本：核酸檢測(cè)（如輪狀病毒、寄生蟲）、培養(yǎng)法。

尿液樣本：ELISA、核酸檢測(cè)（如腎小球腎炎相關(guān)病毒）。

檢測(cè)窗口期是指感染后到能夠檢測(cè)出病原體的最短時(shí)間，選擇方法時(shí)需考慮。

4.結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)能力：

設(shè)備要求：PCR、測(cè)序需要較復(fù)雜的儀器和環(huán)境；ELISA、抗原檢測(cè)相對(duì)設(shè)備要求較低。

人員資質(zhì)：操作復(fù)雜方法需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員。

試劑可獲得性：確保所需試劑的穩(wěn)定供應(yīng)。

5.參考臨床指南和專家建議：結(jié)合最新的研究進(jìn)展和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，選擇成熟可靠的方法。

（二）檢測(cè)方法的實(shí)施

1.PCR檢測(cè)（以實(shí)時(shí)熒光PCR為例）：

(1)樣本提?。?/p>

步驟：

按照試劑盒說明書準(zhǔn)備提取試劑和緩沖液。

處理樣本：如拭子樣本需在保存液中充分懸?。谎簶颖拘璺蛛x上清液或直接使用全血；組織樣本需研磨勻漿。

加入裂解液：將處理后的樣本加入含有蛋白酶K等酶的裂解液中，用于破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放核酸。

離心：室溫或特定溫度（如55°C）孵育一定時(shí)間后，高速離心，分離上清液（含核酸）。

吸取上清：小心吸取上清液至新的反應(yīng)管中，即可用于PCR反應(yīng)。整個(gè)過程需在生物安全柜內(nèi)操作，防止氣溶膠污染。

注意事項(xiàng)：避免反復(fù)凍融樣本；確保裂解充分；操作過程中嚴(yán)格無菌。

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：

步驟：

體系配制：按照說明書比例混合反應(yīng)試劑（包含dNTPs、引物、探針/熒光染料、Taq酶等），加入提取的核酸模板，最后加入無核酸酶水補(bǔ)足體積。

反應(yīng)條件設(shè)置：在實(shí)時(shí)熒光PCR儀上設(shè)置循環(huán)參數(shù)。典型程序包括：

初始變性：如95°C，3-5分鐘（使模板DNA變性）。

循環(huán)變性-退火-延伸：如95°C，15-30秒；退火溫度（根據(jù)引物設(shè)計(jì)，如55-65°C），20-40秒；72°C，1分鐘（或根據(jù)Taq酶活性調(diào)整）。循環(huán)次數(shù)通常30-40次。

終末延伸：72°C，5-10分鐘。

保溫：4°C或25°C保存。

加樣：將配制好的反應(yīng)體系加入PCR反應(yīng)管，每個(gè)樣本設(shè)置2-3個(gè)重復(fù)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（無模板）和陽性對(duì)照（已知陽性模板）。

運(yùn)行：將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀，開始運(yùn)行程序。

注意事項(xiàng)：試劑配比準(zhǔn)確；引物和探針特異性良好；反應(yīng)管無污染；設(shè)置合理的循環(huán)數(shù)。

(3)結(jié)果判讀：

步驟：

圖形分析：觀察實(shí)時(shí)熒光曲線。陽性樣本曲線在延伸階段呈現(xiàn)明顯的S型增長(zhǎng)，且在閾值設(shè)定范圍內(nèi)有明顯的熒光信號(hào)上升；陰性對(duì)照曲線平緩，熒光信號(hào)低于設(shè)定閾值。

閾值設(shè)置：在logamplificationplot上，選擇擴(kuò)增效率接近100%的直線段，設(shè)置一個(gè)合適的閾值線，該線應(yīng)位于熒光信號(hào)背景之上，且不觸及基線噪音。

Cq值（CycleQuantification）判斷：計(jì)算每個(gè)樣本的Cq值，即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)數(shù)。Cq值越小，表示模板初始濃度越高。通常，Cq值低于某個(gè)設(shè)定值（如35或根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定）判為陽性。

結(jié)果記錄：記錄每個(gè)樣本的Cq值和曲線形態(tài)，與陽性/陰性對(duì)照進(jìn)行比較，得出最終結(jié)果。

注意事項(xiàng)：陽性樣本需進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證；若結(jié)果可疑，可嘗試優(yōu)化反應(yīng)條件或重新提取樣本檢測(cè)。

2.ELISA檢測(cè)（以間接ELISA為例，檢測(cè)抗體）：

(1)樣本預(yù)處理：

步驟：收集血清或血漿樣本，室溫靜置30分鐘或4°C過夜析出。3000-5000rpm離心10分鐘，分離上清。吸取上清液，即可用于檢測(cè)。若樣本為全血，需先分離血清。

注意事項(xiàng)：避免溶血；及時(shí)分離血清；凍存樣本時(shí)需避免反復(fù)凍融。

(2)加樣與孵育：

步驟：

包被：將稀釋好的抗原包被于酶標(biāo)板微孔中，每孔加入100-200μl，4°C過夜。次日取出，洗滌（通常洗滌3-5次，每次用洗滌液200-300μl，洗滌后吸干或甩干）。

封閉：加入封閉液（如含牛血清白蛋白的溶液），每孔100-200μl，室溫孵育1-2小時(shí)。洗滌（同上）。

加樣（一抗）：加入待測(cè)樣本（血清），每孔100μl，設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，室溫孵育1小時(shí)。洗滌（同上）。

加樣（二抗）：加入已用樣本稀釋液稀釋好的酶標(biāo)二抗（針對(duì)宿主種屬的抗體，如羊抗鼠IgG），每孔100μl，室溫孵育1小時(shí)。洗滌（同上）。

加底物：加入TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）等酶底物溶液，每孔100-200μl，避光室溫孵育15-30分鐘。底物顏色會(huì)由藍(lán)變黃。

注意事項(xiàng)：各步孵育時(shí)間、溫度需嚴(yán)格按照說明書；加樣均勻，避免氣泡；洗滌要徹底，防止交叉污染。

(3)結(jié)果計(jì)算：

步驟：

終止反應(yīng)：加入終止液（如硫酸或鹽酸），每孔100-200μl，終止酶反應(yīng)，溶液顏色由黃變橙黃。

酶標(biāo)儀讀數(shù)：立即使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值（OD值）。同時(shí)記錄空白孔（不含樣本和抗原的孔）的吸光度值，用于調(diào)零。

計(jì)算：計(jì)算樣本OD值=樣本孔OD值-空白孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度或滴度。

注意事項(xiàng)：讀數(shù)應(yīng)在終止反應(yīng)后盡快進(jìn)行；標(biāo)準(zhǔn)曲線需用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制；結(jié)果判讀需結(jié)合cut-off值（閾值）。

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三、樣本采集與處理（續(xù)）

（二）樣本處理（續(xù)）

1.血液樣本（續(xù)）：

(1)靜脈采血：

步驟：

核對(duì)患者信息與樣本標(biāo)簽。

選擇合適部位（如肘正中靜脈），用75%酒精消毒皮膚。

按照采血量要求（如3-5ml），選擇合適尺寸的注射器或真空采血管。首次抽取的血液可棄去，以免污染。

緩慢注入采血管或直接注入試管，避免產(chǎn)生氣泡。

需要分離血清時(shí)，采血后立即顛倒混勻數(shù)次，然后置于離心機(jī)中，3000-4000rpm離心10分鐘。

小心吸取上清血清至新的樣本管或凍存管中，記錄吸取量。剩余部分可保留。

若需檢測(cè)細(xì)胞成分或進(jìn)行核酸檢測(cè)，可保留部分全血。

注意事項(xiàng)：采血過程避免溶血；不同檢測(cè)項(xiàng)目需使用不同類型的采血管（如含有EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝劑的管）；采血量需滿足所有檢測(cè)需求。

(2)全血樣本處理：

步驟：采血后立即置于冰浴或冷藏環(huán)境中，防止酶活性降解（如核酸檢測(cè)）。按需進(jìn)行裂解、核酸提取等步驟。

注意事項(xiàng)：核酸穩(wěn)定性受溫度影響，需盡快處理。

2.組織樣本：

(1)標(biāo)本獲?。?/p>

步驟：根據(jù)臨床需要獲取組織樣本（如活檢、手術(shù)切除等）。確保樣本包含目標(biāo)病變區(qū)域。

注意事項(xiàng)：快速送檢，避免樣本干燥。

(2)樣本固定：

步驟：立即將組織樣本放入預(yù)冷的固定液中（常用10%中性甲醛或乙醇溶液），確保組織完全浸沒。記錄固定開始時(shí)間。

注意事項(xiàng)：固定時(shí)間通常為24-48小時(shí)，具體根據(jù)固定液類型和組織大小決定。固定不充分會(huì)影響后續(xù)染色和檢測(cè)。

(3)樣本處理：

脫水：將固定好的組織依次放入不同濃度梯度乙醇溶液中脫水（如70%,80%,90%,95%,100%）。

透明：將組織置于二甲苯或透明劑中，使組織透明，便于后續(xù)包埋。

包埋：將透明后的組織包埋于石蠟或其他包埋介質(zhì)中，制成組織塊。

切片：使用切片機(jī)將組織塊切成4-7μm厚的切片。

染色：將切片置于載玻片上，進(jìn)行HE染色或其他特異性染色（如免疫組化、熒光染色）。

封片：染色后的切片干燥后，加蓋蓋玻片，使用封片劑封片，便于觀察。

注意事項(xiàng)：整個(gè)過程需嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間；切片厚度均勻；染色條件需優(yōu)化。

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四、實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范（續(xù)）

（二）操作流程（續(xù)）

1.樣本接收（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

接收樣本時(shí)，核對(duì)樣本標(biāo)簽上的信息（如樣本ID、采集時(shí)間、檢測(cè)項(xiàng)目等）是否與委托單一致。

檢查樣本容器是否完好無損，有無滲漏。

評(píng)估樣本狀態(tài)：如血液樣本有無凝塊；拭子樣本是否在保存液中；組織樣本有無干燥。

記錄接收日期、時(shí)間、檢測(cè)項(xiàng)目、樣本類型、臨床信息（如有）。

對(duì)異常樣本（如量不足、狀態(tài)不佳）進(jìn)行標(biāo)記，并通知申請(qǐng)科室或負(fù)責(zé)人。

將樣本按類型和檢測(cè)項(xiàng)目分類放置于指定區(qū)域。

注意事項(xiàng)：核對(duì)是防止錯(cuò)誤操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；異常樣本需妥善處理，避免誤檢。

2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

儀器校準(zhǔn)/檢查：檢查實(shí)時(shí)熒光PCR儀的溫度曲線、熒光檢測(cè)系統(tǒng)；酶標(biāo)儀的光路和讀數(shù)準(zhǔn)確性；離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和定時(shí)；天平的精度等。必要時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)或維護(hù)。

試劑檢查：檢查所有試劑（如PCR試劑盒、ELISA試劑、緩沖液、酶底物等）的名稱、批號(hào)、有效期。確保在有效期內(nèi)使用。檢查試劑有無變色、沉淀或渾濁。

耗材檢查：檢查PCR反應(yīng)管、酶標(biāo)板、拭子、移液器吸頭等耗材是否完好、無污染。一次性耗材需確保未開封或包裝完好。

工作液配制：按照說明書準(zhǔn)確配制所需工作液，如PCR反應(yīng)體系中各成分的最終濃度；ELISA中稀釋樣本和二抗的稀釋液等。配制后貼好標(biāo)簽，注明配制日期、濃度、有效期。

環(huán)境準(zhǔn)備：檢查生物安全柜的運(yùn)行狀態(tài)和風(fēng)量；確保實(shí)驗(yàn)區(qū)域清潔、整潔。

注意事項(xiàng)：儀器狀態(tài)直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；試劑和耗材的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)成功的保障；工作液配制需精確。

3.實(shí)驗(yàn)過程（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

樣本提取（PCR）：嚴(yán)格按照前述步驟進(jìn)行，注意無菌操作，避免交叉污染。記錄每個(gè)樣本的提取時(shí)間和操作人員。

加樣：使用移液器準(zhǔn)確加樣。設(shè)置梯度加樣，避免單點(diǎn)加樣。加樣過程盡量在生物安全柜內(nèi)完成。

孵育：確保樣本或反應(yīng)體系在正確的溫度和時(shí)間條件下孵育。如PCR的變性、退火、延伸溫度和時(shí)間；ELISA的孵育溫度和時(shí)間。

洗滌（ELISA）：使用洗板機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化洗滌，確保每次洗滌時(shí)間和液量一致。手動(dòng)洗滌時(shí)，需確保洗滌液充分覆蓋所有微孔，并徹底吸干或甩干。

讀數(shù)：及時(shí)進(jìn)行酶標(biāo)儀讀數(shù)，避免樣本長(zhǎng)時(shí)間暴露在環(huán)境中發(fā)生變化。

注意事項(xiàng)：移液器操作需規(guī)范，定期校準(zhǔn)；孵育條件必須嚴(yán)格控制；洗滌要徹底。

4.結(jié)果復(fù)核（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

目視檢查：檢查反應(yīng)管有無沉淀、顏色異常；酶標(biāo)板有無滲漏、劃痕；顯微鏡下觀察有無異常現(xiàn)象。

數(shù)據(jù)有效性判斷：檢查陰性對(duì)照是否為陰性，陽性對(duì)照是否為陽性。若陰性對(duì)照陽性或陽性對(duì)照陰性，說明實(shí)驗(yàn)過程可能存在問題，需重做。

結(jié)果計(jì)算與判讀：按照前述方法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算（如Cq值計(jì)算、OD值計(jì)算），并對(duì)照閾值或標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行判讀。

可疑結(jié)果確認(rèn)：對(duì)于接近閾值、重復(fù)性差或與預(yù)期不符的結(jié)果，需進(jìn)行至少一次重復(fù)檢測(cè)。必要時(shí)增加重復(fù)次數(shù)或進(jìn)行方法驗(yàn)證。

記錄與簽名：將最終結(jié)果記錄在檢測(cè)記錄單上，由檢測(cè)操作人員和復(fù)核人員分別簽名。

注意事項(xiàng)：復(fù)核是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的重要環(huán)節(jié)；多人復(fù)核可減少主觀誤差。

（三）結(jié)果報(bào)告（續(xù)）

1.報(bào)告內(nèi)容（續(xù)）：

標(biāo)準(zhǔn)要素：

實(shí)驗(yàn)室名稱及地址、聯(lián)系方式。

報(bào)告編號(hào)。

委托人信息（姓名、地址、電話等）。

樣本信息（樣本ID、接收日期、采集日期、樣本類型、臨床描述等）。

檢測(cè)項(xiàng)目全稱。

檢測(cè)方法（如實(shí)時(shí)熒光PCR、間接ELISA）。

檢測(cè)結(jié)果（明確標(biāo)明“陽性”或“陰性”，或給出具體數(shù)值如Cq值、OD值）。

參考范圍（如有）。

陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)或閾值。

檢測(cè)日期、報(bào)告發(fā)出日期。

檢測(cè)人員、審核人員簽名或電子簽名。

注意事項(xiàng)：如“結(jié)果僅供參考”、“陽性結(jié)果建議進(jìn)一步確認(rèn)”等。

2.特殊情況處理：

低陽性/臨界結(jié)果：報(bào)告中需特別注明結(jié)果為低陽性或臨界值，并建議進(jìn)行復(fù)查。

無法檢測(cè)/無效結(jié)果：如樣本不合格、實(shí)驗(yàn)過程異常等，需在報(bào)告中明確說明原因，如“樣本溶血”、“實(shí)驗(yàn)無效”等。

檢測(cè)項(xiàng)目未完成：如某項(xiàng)檢測(cè)因故未完成，需在報(bào)告中注明。

3.報(bào)告格式：

可采用標(biāo)準(zhǔn)化表格形式，清晰列出各項(xiàng)信息。

對(duì)于復(fù)雜的檢測(cè)項(xiàng)目（如多位點(diǎn)基因分型），可附上詳細(xì)的分型結(jié)果圖或列表。

4.報(bào)告發(fā)放：

通過指定途徑（如電子系統(tǒng)、郵寄）將報(bào)告發(fā)送給委托人。

確保報(bào)告送達(dá)并得到簽收（如適用）。

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六、應(yīng)急響應(yīng)與廢棄物處理（續(xù)）

（一）應(yīng)急響應(yīng)（續(xù)）

1.儀器故障應(yīng)急：

情況：實(shí)時(shí)熒光PCR儀無法上機(jī)、酶標(biāo)儀讀數(shù)異常、離心機(jī)故障等。

步驟：

立即檢查儀器電源、連接線、開關(guān)等簡(jiǎn)單故障。

若無法自行解決，聯(lián)系儀器維修人員或供應(yīng)商進(jìn)行維修。同時(shí)，評(píng)估受影響的樣本數(shù)量和檢測(cè)項(xiàng)目。

根據(jù)情況，與委托人溝通，協(xié)商調(diào)整檢測(cè)計(jì)劃或?qū)κ苡绊憳颖具M(jìn)行重測(cè)。必要時(shí)啟動(dòng)備用設(shè)備或外包檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：及時(shí)記錄故障情況和處理過程。

2.試劑/耗材短缺應(yīng)急：

情況：關(guān)鍵試劑（如Taq酶、引物探針）或重要耗材（如PCR管、酶標(biāo)板）突然短缺。

步驟：

立即檢查庫存，確認(rèn)短缺情況。

聯(lián)系供應(yīng)商緊急訂購(gòu)。評(píng)估能否從其他實(shí)驗(yàn)室或渠道臨時(shí)調(diào)撥（需確保質(zhì)量和批號(hào)兼容）。

若無法及時(shí)補(bǔ)充，需暫停相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目，并通知委托人。

優(yōu)先保障緊急臨床檢測(cè)需求。

注意事項(xiàng)：保持適量安全庫存；建立備用供應(yīng)商清單。

3.大量樣本涌入應(yīng)急：

情況：如突發(fā)公共衛(wèi)生事件期間，樣本量短時(shí)間內(nèi)激增。

步驟：

評(píng)估實(shí)驗(yàn)室容量（人員、設(shè)備、空間），確定最大處理能力。

與委托方溝通，根據(jù)優(yōu)先級(jí)排序樣本。

優(yōu)化工作流程，增加人員班次（如適用），提高樣本處理和檢測(cè)效率。

確保質(zhì)量控制環(huán)節(jié)不被遺漏，可考慮增加質(zhì)控頻率或使用自動(dòng)化設(shè)備。

如超出極限，需向上級(jí)或相關(guān)部門匯報(bào)，協(xié)調(diào)資源或分流樣本。

注意事項(xiàng)：制定應(yīng)急預(yù)案，明確不同情景下的應(yīng)對(duì)措施。

4.人員操作失誤應(yīng)急：

情況：檢測(cè)人員操作不當(dāng)，如加樣錯(cuò)誤、樣本混淆、忘記孵育等。

步驟：

立即停止操作，評(píng)估可能造成的后果。

如可能影響結(jié)果，需按規(guī)定重做實(shí)驗(yàn)或?qū)颖具M(jìn)行復(fù)核。

分析失誤原因，采取糾正措施，防止類似事件再次發(fā)生（如加強(qiáng)培訓(xùn)、優(yōu)化流程）。

按規(guī)定記錄事件經(jīng)過和處理結(jié)果。

注意事項(xiàng)：營(yíng)造開放、無指責(zé)的文化，鼓勵(lì)報(bào)告錯(cuò)誤以改進(jìn)流程。

（二）廢棄物處理（續(xù)）

1.分類收集：

醫(yī)療廢物：

感染性廢物：一次性使用的針頭、注射器、手術(shù)刀、解剖刀、培養(yǎng)皿、玻璃切片等銳器和沾染血液、體液的物品。

病理性廢物：化驗(yàn)標(biāo)本、手術(shù)切除組織、病理臘塊等。

藥物性廢物：過期、變質(zhì)、被污染的藥品。

化學(xué)性廢物：化學(xué)試劑、廢液等。

實(shí)驗(yàn)室常規(guī)廢物：廢棄的移液器吸頭、試管、培養(yǎng)皿（無污染）、紙張等。

方法：使用符合標(biāo)準(zhǔn)的、有明確標(biāo)識(shí)的專用包裝容器進(jìn)行收集。銳器放入防刺穿容器；液體廢物按化學(xué)性質(zhì)分類收集。

2.感染性廢物處理：

消毒/滅菌：如適用，對(duì)某些物品（如金屬器械）進(jìn)行高壓蒸汽滅菌或化學(xué)消毒。

收集：放入雙層防滲漏塑料袋，袋口系緊或用封口貼封口，表面用有效消毒劑噴灑消毒。

轉(zhuǎn)運(yùn)：由符合資質(zhì)的機(jī)構(gòu)進(jìn)行密閉轉(zhuǎn)運(yùn)。

處置：交由有資質(zhì)的醫(yī)療廢物處置單位進(jìn)行無害化處理（如高溫焚燒）。

3.化學(xué)性廢物處理：

分類收集：酸性廢液、堿性廢液、有機(jī)溶劑廢液等分開收集。

中和/處理：按照化學(xué)性質(zhì)，進(jìn)行中和處理（如酸堿中和）。有機(jī)溶劑需特殊處理，如蒸餾回收或交由專業(yè)機(jī)構(gòu)處理。

處置：處理后的廢液可按市政要求排放（需符合標(biāo)準(zhǔn)），或交由有資質(zhì)單位進(jìn)行專門處理。

4.實(shí)驗(yàn)室常規(guī)廢物處理：

分類收集：按上述分類放入相應(yīng)容器。

處置：一次性使用的塑料耗材等，若無感染風(fēng)險(xiǎn)，可按普通垃圾處理（需確認(rèn)當(dāng)?shù)卣撸?；紙張等可回收利用?/p>

5.注意事項(xiàng)：

所有廢棄物處理過程必須符合國(guó)家和地方關(guān)于環(huán)境保護(hù)和廢棄物管理的相關(guān)規(guī)定（此處僅描述操作方法，不涉及具體法規(guī)名稱）。

處理過程中需穿戴適當(dāng)?shù)膫€(gè)人防護(hù)裝備（PPE），如手套、防護(hù)服、護(hù)目鏡等。

廢棄物暫存點(diǎn)需遠(yuǎn)離人員活動(dòng)區(qū)，設(shè)置明顯警示標(biāo)識(shí)，定期清運(yùn)。

實(shí)驗(yàn)室需建立廢棄物處理記錄臺(tái)賬，記錄種類、數(shù)量、處理方式和日期。

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七、培訓(xùn)與監(jiān)督（續(xù)）

（一）人員培訓(xùn)（續(xù)）

1.上崗前培訓(xùn)：

內(nèi)容：

實(shí)驗(yàn)室規(guī)章制度和生物安全知識(shí)。

檢測(cè)項(xiàng)目的原理、操作規(guī)程（SOP）。

樣本采集、處理、保存要求。

儀器設(shè)備的基本操作和維護(hù)。

質(zhì)量控制方法。

廢棄物處理規(guī)定。

應(yīng)急處理預(yù)案。

形式：理論授課、操作演示、考核。

要求：新員工必須通過培訓(xùn)和考核后方可獨(dú)立上崗。

2.在崗培訓(xùn)：

內(nèi)容：

新技術(shù)、新方法的學(xué)習(xí)。

定期復(fù)訓(xùn)SOP，強(qiáng)化操作技能。

質(zhì)量控制新要求。

更新相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)。

特定實(shí)驗(yàn)（如高風(fēng)險(xiǎn)操作）的專項(xiàng)培訓(xùn)。

形式：定期講座、內(nèi)部交流會(huì)、技能比武、參加外部培訓(xùn)課程。

頻率：至少每年進(jìn)行一次全面復(fù)訓(xùn)和考核。根據(jù)需要可增加培訓(xùn)頻率。

3.培訓(xùn)記錄與評(píng)估：

建立培訓(xùn)檔案，記錄培訓(xùn)內(nèi)容、時(shí)間、講師、參訓(xùn)人員、考核結(jié)果等。

定期評(píng)估培訓(xùn)效果，如通過操作考核、結(jié)果準(zhǔn)確率等指標(biāo)。

根據(jù)評(píng)估結(jié)果調(diào)整培訓(xùn)計(jì)劃。

（二）監(jiān)督機(jī)制（續(xù)）

1.內(nèi)部審核：

組織：設(shè)立內(nèi)部質(zhì)量管理體系（QMS）小組，由經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員和管理人員組成。

內(nèi)容：

定期（如每月或每季度）對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作流程、SOP執(zhí)行情況、質(zhì)量控制措施等進(jìn)行檢查。

抽查樣本記錄、檢測(cè)記錄、結(jié)果報(bào)告等文檔的完整性和規(guī)范性。

對(duì)儀器設(shè)備的使用和維護(hù)情況進(jìn)行檢查。

對(duì)廢棄物處理流程進(jìn)行監(jiān)督。

形式：現(xiàn)場(chǎng)檢查、文件評(píng)審、人員訪談。

結(jié)果：輸出內(nèi)部審核報(bào)告，列出發(fā)現(xiàn)的問題，提出整改要求，并跟蹤整改落實(shí)情況。

2.人員資質(zhì)監(jiān)督：

確保所有操作人員持有相關(guān)資格證書（如檢驗(yàn)技師證等）。

監(jiān)督人員是否按照其資質(zhì)和授權(quán)范圍進(jìn)行操作。

對(duì)關(guān)鍵崗位人員（如負(fù)責(zé)人、SOP制定者）進(jìn)行定期評(píng)估。

3.外部監(jiān)督：

參與能力驗(yàn)證：定期參加由第三方機(jī)構(gòu)組織的能力驗(yàn)證計(jì)劃（ProficiencyTesting,PT），與其他實(shí)驗(yàn)室比對(duì)結(jié)果，評(píng)估自身檢測(cè)能力。

接受評(píng)審：根據(jù)需要，可接受外部機(jī)構(gòu)（如質(zhì)量管理體系認(rèn)證機(jī)構(gòu)、臨床實(shí)驗(yàn)室評(píng)審機(jī)構(gòu)等）的評(píng)審或檢查。

反饋處理：對(duì)外部監(jiān)督中發(fā)現(xiàn)的問題，要認(rèn)真分析原因，制定整改措施，并持續(xù)改進(jìn)。

4.持續(xù)改進(jìn)：

將內(nèi)部審核、外部監(jiān)督、能力驗(yàn)證、客戶反饋等信息納入質(zhì)量管理體系，定期進(jìn)行管理評(píng)審。

根據(jù)評(píng)審結(jié)果和實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行情況，持續(xù)優(yōu)化SOP、改進(jìn)流程、提升管理水平。

鼓勵(lì)員工提出改進(jìn)建議，營(yíng)造持續(xù)改進(jìn)的文化氛圍。

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一、概述

傳染病檢測(cè)是預(yù)防和控制傳染病傳播的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為確保檢測(cè)工作的科學(xué)性、規(guī)范性和有效性，特制定本技術(shù)規(guī)定。本規(guī)定涵蓋了檢測(cè)方法的選擇、樣本采集、實(shí)驗(yàn)室操作、結(jié)果報(bào)告及質(zhì)量控制等方面，旨在為相關(guān)機(jī)構(gòu)提供統(tǒng)一的操作指南，降低檢測(cè)誤差，提高公共衛(wèi)生應(yīng)急響應(yīng)能力。

二、檢測(cè)方法的選擇與實(shí)施

（一）檢測(cè)方法的選擇

1.根據(jù)傳染病的病原體類型（如病毒、細(xì)菌、真菌等）選擇合適的檢測(cè)技術(shù)。

2.常用檢測(cè)技術(shù)包括：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè)等。

3.優(yōu)先選擇高靈敏度、高特異性的檢測(cè)方法，確保結(jié)果準(zhǔn)確性。

（二）檢測(cè)方法的實(shí)施

1.PCR檢測(cè)：

(1)樣本提?。菏褂蒙虡I(yè)試劑盒或自行優(yōu)化提取方案，確保核酸完整性和純度。

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：優(yōu)化引物濃度、退火溫度及循環(huán)條件，設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。

(3)結(jié)果判讀：根據(jù)熒光曲線變化和閾值線判斷結(jié)果，陽性樣本需進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

2.ELISA檢測(cè)：

(1)樣本預(yù)處理：離心處理血清或血漿，去除雜質(zhì)。

(2)加樣與孵育：按照試劑盒說明書進(jìn)行加樣，設(shè)置空白對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和樣本孔。

(3)結(jié)果計(jì)算：通過酶標(biāo)儀讀取吸光度值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度。

三、樣本采集與處理

（一）樣本采集

1.根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)選擇合適的樣本類型，如呼吸道樣本（鼻咽拭子）、血液樣本、糞便樣本等。

2.采集過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，避免交叉污染。

3.樣本采集工具需一次性使用，采集后立即密封保存。

（二）樣本處理

1.呼吸道樣本：

(1)使用生理鹽水濕潤(rùn)拭子，深入鼻腔或口腔擦拭黏膜。

(2)將拭子頭置于保存液中充分混勻，立即送檢。

2.血液樣本：

(1)靜脈采血，采集量需滿足檢測(cè)需求（如3-5ml）。

(2)血液樣本需盡快分離血清或直接用于ELISA檢測(cè)。

四、實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范

（一）實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求

1.實(shí)驗(yàn)室需具備生物安全等級(jí)，配備通風(fēng)柜、超凈工作臺(tái)等設(shè)備。

2.操作區(qū)域需定期消毒，使用75%酒精或含氯消毒劑進(jìn)行表面處理。

（二）操作流程

1.樣本接收：核對(duì)樣本信息，檢查樣本完整性，記錄接收時(shí)間。

2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：校準(zhǔn)儀器，檢查試劑有效期，配制所需工作液。

3.實(shí)驗(yàn)過程：嚴(yán)格按照檢測(cè)方法步驟操作，每步完成后記錄關(guān)鍵參數(shù)（如溫度、時(shí)間）。

4.結(jié)果復(fù)核：檢測(cè)人員需獨(dú)立驗(yàn)證結(jié)果，陽性樣本需由雙人復(fù)核。

五、質(zhì)量控制與結(jié)果報(bào)告

（一）質(zhì)量控制措施

1.每批次檢測(cè)需包含陰性對(duì)照、陽性對(duì)照和空白對(duì)照，確保檢測(cè)有效性。

2.定期進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，使用質(zhì)控品評(píng)估檢測(cè)穩(wěn)定性，如連續(xù)3次檢測(cè)結(jié)果在允許范圍內(nèi)。

3.外部質(zhì)評(píng)：參與第三方機(jī)構(gòu)組織的檢測(cè)能力驗(yàn)證，確保實(shí)驗(yàn)室資質(zhì)。

（二）結(jié)果報(bào)告

1.報(bào)告內(nèi)容：包括樣本編號(hào)、檢測(cè)項(xiàng)目、結(jié)果（陽性/陰性）、檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)人員簽名。

2.異常結(jié)果處理：陽性樣本需立即復(fù)核，必要時(shí)進(jìn)行基因測(cè)序或進(jìn)一步檢測(cè)。

3.報(bào)告保存：檢測(cè)報(bào)告需存檔3年以上，便于追溯和審核。

六、應(yīng)急響應(yīng)與廢棄物處理

（一）應(yīng)急響應(yīng)

1.如出現(xiàn)檢測(cè)儀器故障或試劑失效，需立即更換設(shè)備或試劑，并重新檢測(cè)樣本。

2.遇疑似大規(guī)模感染，需啟動(dòng)應(yīng)急預(yù)案，增加檢測(cè)負(fù)荷，協(xié)調(diào)資源保障檢測(cè)效率。

（二）廢棄物處理

1.檢測(cè)廢棄物（如樣本管、拭子等）需分類收集，使用雙層垃圾袋封存。

2.化學(xué)廢棄物需經(jīng)滅活處理后無害化處理，生物廢棄物需高溫高壓滅菌。

七、培訓(xùn)與監(jiān)督

（一）人員培訓(xùn)

1.檢測(cè)人員需接受系統(tǒng)培訓(xùn)，掌握樣本采集、實(shí)驗(yàn)室操作、結(jié)果判讀等技能。

2.每年進(jìn)行技能考核，確保操作規(guī)范性。

（二）監(jiān)督機(jī)制

1.設(shè)立內(nèi)部審核小組，定期檢查檢測(cè)流程符合性。

2.外部機(jī)構(gòu)可進(jìn)行不定期抽查，確保持續(xù)改進(jìn)。

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二、檢測(cè)方法的選擇與實(shí)施

（一）檢測(cè)方法的選擇

1.根據(jù)傳染病的病原體類型（如病毒、細(xì)菌、真菌等）選擇合適的檢測(cè)技術(shù)。

病毒檢測(cè)：對(duì)于RNA病毒（如流感病毒、冠狀病毒）或DNA病毒（如皰疹病毒），PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）或測(cè)序技術(shù)是常用方法，能提供高靈敏度和高特異性?？乖瓩z測(cè)則速度快，適用于急性期篩查。對(duì)于某些病毒（如乙肝病毒），ELISA檢測(cè)可用于檢測(cè)病毒標(biāo)志物（如HBsAg、HBeAb）。

細(xì)菌檢測(cè)：常用的方法包括核酸檢測(cè)（如檢測(cè)細(xì)菌特定基因）、培養(yǎng)法（傳統(tǒng)但耗時(shí)長(zhǎng)）、以及快速抗原檢測(cè)（如肺炎鏈球菌抗原）。對(duì)于某些細(xì)菌感染，血清學(xué)檢測(cè)（如檢測(cè)抗體）也可作為輔助手段。

真菌檢測(cè)：真菌培養(yǎng)是金標(biāo)準(zhǔn)，但周期長(zhǎng)?？焖俜椒òㄕ婢乖瓩z測(cè)（如隱球菌抗原）、真菌核酸檢測(cè)（如檢測(cè)念珠菌DNA），以及顯微鏡下真菌形態(tài)學(xué)觀察。

2.根據(jù)檢測(cè)目的選擇方法：

診斷目的：需要高靈敏度和高特異性方法，如PCR或培養(yǎng)?？焖俸Y查可選用抗原檢測(cè)。

流行病學(xué)調(diào)查：可能需要高通量、快速的方法，如抗原檢測(cè)或PCR芯片，以覆蓋大量樣本。

病原體分型/溯源：需要測(cè)序技術(shù)（如基因測(cè)序、宏基因組測(cè)序）。

3.考慮樣本類型和檢測(cè)窗口期：

呼吸道樣本：PCR和抗原檢測(cè)是常用方法。

血液樣本：核酸檢測(cè)、ELISA、冷凝集試驗(yàn)等。

糞便樣本：核酸檢測(cè)（如輪狀病毒、寄生蟲）、培養(yǎng)法。

尿液樣本：ELISA、核酸檢測(cè)（如腎小球腎炎相關(guān)病毒）。

檢測(cè)窗口期是指感染后到能夠檢測(cè)出病原體的最短時(shí)間，選擇方法時(shí)需考慮。

4.結(jié)合實(shí)驗(yàn)室條件和技術(shù)能力：

設(shè)備要求：PCR、測(cè)序需要較復(fù)雜的儀器和環(huán)境；ELISA、抗原檢測(cè)相對(duì)設(shè)備要求較低。

人員資質(zhì)：操作復(fù)雜方法需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員。

試劑可獲得性：確保所需試劑的穩(wěn)定供應(yīng)。

5.參考臨床指南和專家建議：結(jié)合最新的研究進(jìn)展和臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，選擇成熟可靠的方法。

（二）檢測(cè)方法的實(shí)施

1.PCR檢測(cè)（以實(shí)時(shí)熒光PCR為例）：

(1)樣本提?。?/p>

步驟：

按照試劑盒說明書準(zhǔn)備提取試劑和緩沖液。

處理樣本：如拭子樣本需在保存液中充分懸??；血液樣本需分離上清液或直接使用全血；組織樣本需研磨勻漿。

加入裂解液：將處理后的樣本加入含有蛋白酶K等酶的裂解液中，用于破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，釋放核酸。

離心：室溫或特定溫度（如55°C）孵育一定時(shí)間后，高速離心，分離上清液（含核酸）。

吸取上清：小心吸取上清液至新的反應(yīng)管中，即可用于PCR反應(yīng)。整個(gè)過程需在生物安全柜內(nèi)操作，防止氣溶膠污染。

注意事項(xiàng)：避免反復(fù)凍融樣本；確保裂解充分；操作過程中嚴(yán)格無菌。

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)：

步驟：

體系配制：按照說明書比例混合反應(yīng)試劑（包含dNTPs、引物、探針/熒光染料、Taq酶等），加入提取的核酸模板，最后加入無核酸酶水補(bǔ)足體積。

反應(yīng)條件設(shè)置：在實(shí)時(shí)熒光PCR儀上設(shè)置循環(huán)參數(shù)。典型程序包括：

初始變性：如95°C，3-5分鐘（使模板DNA變性）。

循環(huán)變性-退火-延伸：如95°C，15-30秒；退火溫度（根據(jù)引物設(shè)計(jì)，如55-65°C），20-40秒；72°C，1分鐘（或根據(jù)Taq酶活性調(diào)整）。循環(huán)次數(shù)通常30-40次。

終末延伸：72°C，5-10分鐘。

保溫：4°C或25°C保存。

加樣：將配制好的反應(yīng)體系加入PCR反應(yīng)管，每個(gè)樣本設(shè)置2-3個(gè)重復(fù)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照（無模板）和陽性對(duì)照（已知陽性模板）。

運(yùn)行：將反應(yīng)管放入實(shí)時(shí)熒光PCR儀，開始運(yùn)行程序。

注意事項(xiàng)：試劑配比準(zhǔn)確；引物和探針特異性良好；反應(yīng)管無污染；設(shè)置合理的循環(huán)數(shù)。

(3)結(jié)果判讀：

步驟：

圖形分析：觀察實(shí)時(shí)熒光曲線。陽性樣本曲線在延伸階段呈現(xiàn)明顯的S型增長(zhǎng)，且在閾值設(shè)定范圍內(nèi)有明顯的熒光信號(hào)上升；陰性對(duì)照曲線平緩，熒光信號(hào)低于設(shè)定閾值。

閾值設(shè)置：在logamplificationplot上，選擇擴(kuò)增效率接近100%的直線段，設(shè)置一個(gè)合適的閾值線，該線應(yīng)位于熒光信號(hào)背景之上，且不觸及基線噪音。

Cq值（CycleQuantification）判斷：計(jì)算每個(gè)樣本的Cq值，即熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值所需的循環(huán)數(shù)。Cq值越小，表示模板初始濃度越高。通常，Cq值低于某個(gè)設(shè)定值（如35或根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定）判為陽性。

結(jié)果記錄：記錄每個(gè)樣本的Cq值和曲線形態(tài)，與陽性/陰性對(duì)照進(jìn)行比較，得出最終結(jié)果。

注意事項(xiàng)：陽性樣本需進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證；若結(jié)果可疑，可嘗試優(yōu)化反應(yīng)條件或重新提取樣本檢測(cè)。

2.ELISA檢測(cè)（以間接ELISA為例，檢測(cè)抗體）：

(1)樣本預(yù)處理：

步驟：收集血清或血漿樣本，室溫靜置30分鐘或4°C過夜析出。3000-5000rpm離心10分鐘，分離上清。吸取上清液，即可用于檢測(cè)。若樣本為全血，需先分離血清。

注意事項(xiàng)：避免溶血；及時(shí)分離血清；凍存樣本時(shí)需避免反復(fù)凍融。

(2)加樣與孵育：

步驟：

包被：將稀釋好的抗原包被于酶標(biāo)板微孔中，每孔加入100-200μl，4°C過夜。次日取出，洗滌（通常洗滌3-5次，每次用洗滌液200-300μl，洗滌后吸干或甩干）。

封閉：加入封閉液（如含牛血清白蛋白的溶液），每孔100-200μl，室溫孵育1-2小時(shí)。洗滌（同上）。

加樣（一抗）：加入待測(cè)樣本（血清），每孔100μl，設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照，室溫孵育1小時(shí)。洗滌（同上）。

加樣（二抗）：加入已用樣本稀釋液稀釋好的酶標(biāo)二抗（針對(duì)宿主種屬的抗體，如羊抗鼠IgG），每孔100μl，室溫孵育1小時(shí)。洗滌（同上）。

加底物：加入TMB（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine）等酶底物溶液，每孔100-200μl，避光室溫孵育15-30分鐘。底物顏色會(huì)由藍(lán)變黃。

注意事項(xiàng)：各步孵育時(shí)間、溫度需嚴(yán)格按照說明書；加樣均勻，避免氣泡；洗滌要徹底，防止交叉污染。

(3)結(jié)果計(jì)算：

步驟：

終止反應(yīng)：加入終止液（如硫酸或鹽酸），每孔100-200μl，終止酶反應(yīng)，溶液顏色由黃變橙黃。

酶標(biāo)儀讀數(shù)：立即使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值（OD值）。同時(shí)記錄空白孔（不含樣本和抗原的孔）的吸光度值，用于調(diào)零。

計(jì)算：計(jì)算樣本OD值=樣本孔OD值-空白孔OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本濃度或滴度。

注意事項(xiàng)：讀數(shù)應(yīng)在終止反應(yīng)后盡快進(jìn)行；標(biāo)準(zhǔn)曲線需用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制；結(jié)果判讀需結(jié)合cut-off值（閾值）。

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三、樣本采集與處理（續(xù)）

（二）樣本處理（續(xù)）

1.血液樣本（續(xù)）：

(1)靜脈采血：

步驟：

核對(duì)患者信息與樣本標(biāo)簽。

選擇合適部位（如肘正中靜脈），用75%酒精消毒皮膚。

按照采血量要求（如3-5ml），選擇合適尺寸的注射器或真空采血管。首次抽取的血液可棄去，以免污染。

緩慢注入采血管或直接注入試管，避免產(chǎn)生氣泡。

需要分離血清時(shí)，采血后立即顛倒混勻數(shù)次，然后置于離心機(jī)中，3000-4000rpm離心10分鐘。

小心吸取上清血清至新的樣本管或凍存管中，記錄吸取量。剩余部分可保留。

若需檢測(cè)細(xì)胞成分或進(jìn)行核酸檢測(cè)，可保留部分全血。

注意事項(xiàng)：采血過程避免溶血；不同檢測(cè)項(xiàng)目需使用不同類型的采血管（如含有EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝劑的管）；采血量需滿足所有檢測(cè)需求。

(2)全血樣本處理：

步驟：采血后立即置于冰浴或冷藏環(huán)境中，防止酶活性降解（如核酸檢測(cè)）。按需進(jìn)行裂解、核酸提取等步驟。

注意事項(xiàng)：核酸穩(wěn)定性受溫度影響，需盡快處理。

2.組織樣本：

(1)標(biāo)本獲?。?/p>

步驟：根據(jù)臨床需要獲取組織樣本（如活檢、手術(shù)切除等）。確保樣本包含目標(biāo)病變區(qū)域。

注意事項(xiàng)：快速送檢，避免樣本干燥。

(2)樣本固定：

步驟：立即將組織樣本放入預(yù)冷的固定液中（常用10%中性甲醛或乙醇溶液），確保組織完全浸沒。記錄固定開始時(shí)間。

注意事項(xiàng)：固定時(shí)間通常為24-48小時(shí)，具體根據(jù)固定液類型和組織大小決定。固定不充分會(huì)影響后續(xù)染色和檢測(cè)。

(3)樣本處理：

脫水：將固定好的組織依次放入不同濃度梯度乙醇溶液中脫水（如70%,80%,90%,95%,100%）。

透明：將組織置于二甲苯或透明劑中，使組織透明，便于后續(xù)包埋。

包埋：將透明后的組織包埋于石蠟或其他包埋介質(zhì)中，制成組織塊。

切片：使用切片機(jī)將組織塊切成4-7μm厚的切片。

染色：將切片置于載玻片上，進(jìn)行HE染色或其他特異性染色（如免疫組化、熒光染色）。

封片：染色后的切片干燥后，加蓋蓋玻片，使用封片劑封片，便于觀察。

注意事項(xiàng)：整個(gè)過程需嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間；切片厚度均勻；染色條件需優(yōu)化。

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四、實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范（續(xù)）

（二）操作流程（續(xù)）

1.樣本接收（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

接收樣本時(shí)，核對(duì)樣本標(biāo)簽上的信息（如樣本ID、采集時(shí)間、檢測(cè)項(xiàng)目等）是否與委托單一致。

檢查樣本容器是否完好無損，有無滲漏。

評(píng)估樣本狀態(tài)：如血液樣本有無凝塊；拭子樣本是否在保存液中；組織樣本有無干燥。

記錄接收日期、時(shí)間、檢測(cè)項(xiàng)目、樣本類型、臨床信息（如有）。

對(duì)異常樣本（如量不足、狀態(tài)不佳）進(jìn)行標(biāo)記，并通知申請(qǐng)科室或負(fù)責(zé)人。

將樣本按類型和檢測(cè)項(xiàng)目分類放置于指定區(qū)域。

注意事項(xiàng)：核對(duì)是防止錯(cuò)誤操作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)；異常樣本需妥善處理，避免誤檢。

2.實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

儀器校準(zhǔn)/檢查：檢查實(shí)時(shí)熒光PCR儀的溫度曲線、熒光檢測(cè)系統(tǒng)；酶標(biāo)儀的光路和讀數(shù)準(zhǔn)確性；離心機(jī)的轉(zhuǎn)速和定時(shí)；天平的精度等。必要時(shí)進(jìn)行校準(zhǔn)或維護(hù)。

試劑檢查：檢查所有試劑（如PCR試劑盒、ELISA試劑、緩沖液、酶底物等）的名稱、批號(hào)、有效期。確保在有效期內(nèi)使用。檢查試劑有無變色、沉淀或渾濁。

耗材檢查：檢查PCR反應(yīng)管、酶標(biāo)板、拭子、移液器吸頭等耗材是否完好、無污染。一次性耗材需確保未開封或包裝完好。

工作液配制：按照說明書準(zhǔn)確配制所需工作液，如PCR反應(yīng)體系中各成分的最終濃度；ELISA中稀釋樣本和二抗的稀釋液等。配制后貼好標(biāo)簽，注明配制日期、濃度、有效期。

環(huán)境準(zhǔn)備：檢查生物安全柜的運(yùn)行狀態(tài)和風(fēng)量；確保實(shí)驗(yàn)區(qū)域清潔、整潔。

注意事項(xiàng)：儀器狀態(tài)直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性；試劑和耗材的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)成功的保障；工作液配制需精確。

3.實(shí)驗(yàn)過程（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

樣本提?。≒CR）：嚴(yán)格按照前述步驟進(jìn)行，注意無菌操作，避免交叉污染。記錄每個(gè)樣本的提取時(shí)間和操作人員。

加樣：使用移液器準(zhǔn)確加樣。設(shè)置梯度加樣，避免單點(diǎn)加樣。加樣過程盡量在生物安全柜內(nèi)完成。

孵育：確保樣本或反應(yīng)體系在正確的溫度和時(shí)間條件下孵育。如PCR的變性、退火、延伸溫度和時(shí)間；ELISA的孵育溫度和時(shí)間。

洗滌（ELISA）：使用洗板機(jī)進(jìn)行自動(dòng)化洗滌，確保每次洗滌時(shí)間和液量一致。手動(dòng)洗滌時(shí)，需確保洗滌液充分覆蓋所有微孔，并徹底吸干或甩干。

讀數(shù)：及時(shí)進(jìn)行酶標(biāo)儀讀數(shù)，避免樣本長(zhǎng)時(shí)間暴露在環(huán)境中發(fā)生變化。

注意事項(xiàng)：移液器操作需規(guī)范，定期校準(zhǔn)；孵育條件必須嚴(yán)格控制；洗滌要徹底。

4.結(jié)果復(fù)核（續(xù)）：

詳細(xì)步驟：

目視檢查：檢查反應(yīng)管有無沉淀、顏色異常；酶標(biāo)板有無滲漏、劃痕；顯微鏡下觀察有無異常現(xiàn)象。

數(shù)據(jù)有效性判斷：檢查陰性對(duì)照是否為陰性，陽性對(duì)照是否為陽性。若陰性對(duì)照陽性或陽性對(duì)照陰性，說明實(shí)驗(yàn)過程可能存在問題，需重做。

結(jié)果計(jì)算與判讀：按照前述方法進(jìn)行結(jié)果計(jì)算（如Cq值計(jì)算、OD值計(jì)算），并對(duì)照閾值或標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行判讀。

可疑結(jié)果確認(rèn)：對(duì)于接近閾值、重復(fù)性差或與預(yù)期不符的結(jié)果，需進(jìn)行至少一次重復(fù)檢測(cè)。必要時(shí)增加重復(fù)次數(shù)或進(jìn)行方法驗(yàn)證。

記錄與簽名：將最終結(jié)果記錄在檢測(cè)記錄單上，由檢測(cè)操作人員和復(fù)核人員分別簽名。

注意事項(xiàng)：復(fù)核是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的重要環(huán)節(jié)；多人復(fù)核可減少主觀誤差。

（三）結(jié)果報(bào)告（續(xù)）

1.報(bào)告內(nèi)容（續(xù)）：

標(biāo)準(zhǔn)要素：

實(shí)驗(yàn)室名稱及地址、聯(lián)系方式。

報(bào)告編號(hào)。

委托人信息（姓名、地址、電話等）。

樣本信息（樣本ID、接收日期、采集日期、樣本類型、臨床描述等）。

檢測(cè)項(xiàng)目全稱。

檢測(cè)方法（如實(shí)時(shí)熒光PCR、間接ELISA）。

檢測(cè)結(jié)果（明確標(biāo)明“陽性”或“陰性”，或給出具體數(shù)值如Cq值、OD值）。

參考范圍（如有）。

陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)或閾值。

檢測(cè)日期、報(bào)告發(fā)出日期。

檢測(cè)人員、審核人員簽名或電子簽名。

注意事項(xiàng)：如“結(jié)果僅供參考”、“陽性結(jié)果建議進(jìn)一步確認(rèn)”等。

2.特殊情況處理：

低陽性/臨界結(jié)果：報(bào)告中需特別注明結(jié)果為低陽性或臨界值，并建議進(jìn)行復(fù)查。

無法檢測(cè)/無效結(jié)果：如樣本不合格、實(shí)驗(yàn)過程異常等，需在報(bào)告中明確說明原因，如“樣本溶血”、“實(shí)驗(yàn)無效”等。

檢測(cè)項(xiàng)目未完成：如某項(xiàng)檢測(cè)因故未完成，需在報(bào)告中注明。

3.報(bào)告格式：

可采用標(biāo)準(zhǔn)化表格形式，清晰列出各項(xiàng)信息。

對(duì)于復(fù)雜的檢測(cè)項(xiàng)目（如多位點(diǎn)基因分型），可附上詳細(xì)的分型結(jié)果圖或列表。

4.報(bào)告發(fā)放：

通過指定途徑（如電子系統(tǒng)、郵寄）將報(bào)告發(fā)送給委托人。

確保報(bào)告送達(dá)并得到簽收（如適用）。

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六、應(yīng)急響應(yīng)與廢棄物處理（續(xù)）

（一）應(yīng)急響應(yīng)（續(xù)）

1.儀器故障應(yīng)急：

情況：實(shí)時(shí)熒光PCR儀無法上機(jī)、酶標(biāo)儀讀數(shù)異常、離心機(jī)故障等。

步驟：

立即檢查儀器電源、連接線、開關(guān)等簡(jiǎn)單故障。

若無法自行解決，聯(lián)系儀器維修人員或供應(yīng)商進(jìn)行維修。同時(shí)，評(píng)估受影響的樣本數(shù)量和檢測(cè)項(xiàng)目。

根據(jù)情況，與委托人溝通，協(xié)商調(diào)整檢測(cè)計(jì)劃或?qū)κ苡绊憳颖具M(jìn)行重測(cè)。必要時(shí)啟動(dòng)備用設(shè)備或外包檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：及時(shí)記錄故障情況和處理過程。

2.試劑/耗材短缺應(yīng)急：

情況：關(guān)鍵試劑（如Taq酶、引物探針）或重要耗材（如PCR管、酶標(biāo)板）突然短缺。

步驟：

立即檢查庫存，確認(rèn)短缺情況。

聯(lián)系供應(yīng)商緊急訂購(gòu)。評(píng)估能否從其他實(shí)驗(yàn)室或渠道臨時(shí)調(diào)撥（需確保質(zhì)量和批號(hào)兼容）。

若無法及時(shí)補(bǔ)充，需暫停相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目，并通知委托人。

優(yōu)先保障緊急臨床檢測(cè)需求。

注意事項(xiàng)：保持適量安全庫存；建立備用供應(yīng)商清單。

3.大量樣本涌入應(yīng)急：

情況：如突發(fā)公共衛(wèi)生事件期間，樣本量短時(shí)間內(nèi)激增。

步驟：

評(píng)估實(shí)驗(yàn)室容量（人員、設(shè)備、空間），確定最大處理能力。

與委托方溝通，根據(jù)優(yōu)先級(jí)排序樣本。

優(yōu)化工作流程，增加人員班次（如適用），提高樣本處理和檢測(cè)效率。

確保質(zhì)量控制環(huán)節(jié)不被遺漏，可考慮增加質(zhì)控頻率或使用自動(dòng)化設(shè)備。

如超出極限，需向上級(jí)或相關(guān)部門匯報(bào)，協(xié)調(diào)資源或分流樣本。

注意事項(xiàng)：制定應(yīng)急預(yù)案，明確不同情景下的應(yīng)對(duì)措施。

4.人員操作失誤應(yīng)急：

情況：檢測(cè)人員操作不當(dāng)，如加樣錯(cuò)誤、樣本混淆、忘記孵育等。

步驟：

立即停止操作，評(píng)估可能造成的后果。

如可能影響結(jié)果，需按規(guī)定重做實(shí)驗(yàn)或?qū)颖具M(jìn)行復(fù)核。

分析失誤原因