ICS11.220

CCSB41

53

云南省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB53/T1057—2021

滇金絲猴腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取技術(shù)規(guī)程

RegulationfordataacquisitionofgutmicrobiotaforRhinopithecusbieti

2021-09-30發(fā)布2021-10-14實(shí)施

云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB53/T1057—2021

目??次

前言...................................................................................................................................................................III

1范圍.................................................................................................................................................................1

2規(guī)范性引用文件.............................................................................................................................................1

3術(shù)語和定義.....................................................................................................................................................1

4基本要求.........................................................................................................................................................2

4.1實(shí)驗(yàn)室通用要求.....................................................................................................................................2

4.2主要試劑及儀器設(shè)備.............................................................................................................................2

5樣品采集和保存.............................................................................................................................................2

6滇金絲猴腸道微生物總DNA提取及檢測(cè)....................................................................................................2

6.1試劑盒選取.............................................................................................................................................2

6.2腸道微生物總DNA提取.........................................................................................................................2

6.3腸道微生物總DNA質(zhì)量檢測(cè).................................................................................................................2

7腸道微生物組高通量測(cè)序.............................................................................................................................2

7.1腸道微生物16SrRNA基因引物選取及擴(kuò)增....................................................................................2

7.2腸道微生物16SrRNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)及純化..................................................................3

7.3腸道微生物16SrRNA基因測(cè)序.........................................................................................................3

7.4腸道微生物宏基因組測(cè)序.....................................................................................................................3

8腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取.................................................................................................................................3

8.116SrRNA基因數(shù)據(jù)質(zhì)控......................................................................................................................3

8.2宏基因組數(shù)據(jù)質(zhì)控.................................................................................................................................3

8.3宏基因組數(shù)據(jù)去除宿主信息.................................................................................................................3

8.4腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取.........................................................................................................................3

附錄A（規(guī)范性）主要試劑及儀器設(shè)備...................................................................................................4

附錄B（規(guī)范性）糞便樣品的采集和保存方法.......................................................................................5

附錄C（規(guī)范性）總DNA樣品的提取步驟、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及成像方法...................................8

附錄D（規(guī)范性）16SrRNAPCR引物、反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間及產(chǎn)物純化步驟..............................9

I

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前??言

本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起

草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。

本文件由云南省林業(yè)與草原局、云南省市場(chǎng)監(jiān)督管理局共同提出。

本文件由云南省林業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（YNTC02）歸口。

本文件主要起草單位：云南大學(xué)、云南省標(biāo)準(zhǔn)化研究院。

本文件主要起草人：于黎、黃艷梅、張志剛、朱勛程、李依恬、李寧、劉純兵、徐志茹、姚雪沁、

胡靖揚(yáng)、吳宏、匡衛(wèi)民。

III

DB53/T1057—2021

滇金絲猴腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取技術(shù)規(guī)程

1范圍

本文件規(guī)定了滇金絲猴（Rhinopithecusbieti）腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取的基本要求、樣品采集和保存、

腸道微生物總DNA提取及檢測(cè)、腸道微生物組高通量測(cè)序、腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取。

本文件適用于野外及圈養(yǎng)滇金絲猴微生物組數(shù)據(jù)獲取。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

腸道微生物gutmicrobiota

動(dòng)物腸道中存在的數(shù)量龐大的微生物，并幫助宿主完成多種生理生化功能的微生物群落。

3.2

腸道微生物總DNAgutmicrobiotatotalDNA

腸道內(nèi)所有微生物DNA和部分宿主DNA的總和。

3.3

宏基因組metagenome

特定環(huán)境下所有生物的遺傳物質(zhì)的總和，其中包括了樣品中所有微生物的遺傳信息。

3.4

16S核糖體RNA（16SrRNA）

細(xì)菌染色體上編碼核糖體RNA亞基的一個(gè)基因，存在于所有細(xì)菌的基因組中。

3.5

16S核糖體RNAV3-V4區(qū)（16SrRNAV3-V4）

16SrRNA基因序列中高度變化的區(qū)域。

3.6

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction，PCR

以一對(duì)寡核苷酸引物、四種脫氧核糖核苷酸(dNTPs)為原料，在合適的溫度、離子條件和耐熱DNA

聚合酶催化下，在體外人工合成特異的DNA片段的過程。

3.7

基因組測(cè)序genomesequencing

對(duì)生物體的基因組序列進(jìn)行測(cè)定，以獲得基因組信息。

1

DB53/T1057—2021

3.8

高通量測(cè)序high-throughputsequencing

能一次并行對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定的技術(shù)。

3.9

讀長(zhǎng)reads

高通量測(cè)序平臺(tái)產(chǎn)生的序列讀長(zhǎng)稱為reads，即測(cè)序讀到的堿基序列片段，是測(cè)序的最小單位。

3.10

宿主host

給微生物提供營養(yǎng)和場(chǎng)所的生物，本標(biāo)準(zhǔn)中指滇金絲猴。

4基本要求

4.1實(shí)驗(yàn)室通用要求

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)滿足GB19489中生物安全實(shí)驗(yàn)室的要求。

4.2主要試劑及儀器設(shè)備

主要試劑及儀器設(shè)備見附錄A。

5樣品采集和保存

腸道微生物從滇金絲猴糞便樣品中獲取，糞便樣品的采集和保存方法見附錄B。

6滇金絲猴腸道微生物總DNA提取及檢測(cè)

6.1試劑盒選取

選取滇金絲猴糞便樣品中提取腸道微生物總DNA，有多種商用試劑盒可供選擇。

6.2腸道微生物總DNA提取

參照商用試劑盒說明書進(jìn)行總DNA提取，提取步驟見附錄C。

6.3腸道微生物總DNA質(zhì)量檢測(cè)

使用微量分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)。糞便樣品提取的總DNA260/280在

1.7～2.1之間，濃度超過2ng/μL，總量超過0.25μg的DNA樣品為合格。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及成像方

法見附錄C。

7腸道微生物組高通量測(cè)序

7.1腸道微生物16SrRNA基因引物選取及擴(kuò)增

16SrRNA基因引物選擇V3-V4區(qū)的引物338F及806R。擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6SrRNA基因V3-V4區(qū)。引物序列及

反應(yīng)條件見附錄D。

7.2腸道微生物16SrRNAPCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)及純化

2

DB53/T1057—2021

7.2.1PCR擴(kuò)增完成后，取PCR產(chǎn)物3μL，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如電泳條帶清楚、片段大小正

確，表明PCR擴(kuò)增成功。不符合質(zhì)量要求的產(chǎn)物，可重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每個(gè)樣本進(jìn)行3個(gè)PCR重復(fù)，

需將3個(gè)重復(fù)的PCR產(chǎn)物混合，以達(dá)到測(cè)序量。

7.2.2PCR產(chǎn)物純化，流程參照商用試劑盒純化流程。純化步驟見附錄D。

7.3腸道微生物16SrRNA基因測(cè)序

16SrRNA基因測(cè)序使用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行。根據(jù)所使用的建庫試劑盒構(gòu)建文庫。根據(jù)高通量測(cè)

序試劑盒和測(cè)序儀操作說明完成試劑裝載，設(shè)置測(cè)序參數(shù)進(jìn)行測(cè)序。

7.4腸道微生物宏基因組測(cè)序

宏基因組測(cè)序可使用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行。根據(jù)所使用的建庫試劑盒構(gòu)建文庫。根據(jù)高通量測(cè)序試

劑盒和測(cè)序儀操作說明完成試劑裝載，設(shè)置測(cè)序參數(shù)進(jìn)行測(cè)序。

8腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取

8.116SrRNA基因數(shù)據(jù)質(zhì)控

16SrRNA基因測(cè)序數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行質(zhì)控，獲取16SrRNA基因數(shù)據(jù)。質(zhì)控去除雙端

引物序列和基因條形碼序列，過濾拼接后序列長(zhǎng)度小于400bp的序列，可使用QIIME2軟件“quality-filter”

默認(rèn)設(shè)置進(jìn)行初始質(zhì)量篩選，“Deblur”去除低豐度序列以及剪切序列末端，統(tǒng)一獲得前400bp區(qū)段的

高質(zhì)量序列，獲得滇金絲猴腸道微生物16SrRNA基因數(shù)據(jù)。

8.2宏基因組數(shù)據(jù)質(zhì)控

宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行質(zhì)控。宏基因組數(shù)據(jù)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)為堿基平均質(zhì)量閾值高

于20，最短reads長(zhǎng)度大于50bp。

8.3宏基因組數(shù)據(jù)去除宿主信息

使用滇金絲猴全基因組數(shù)據(jù)作為參考基因組，宏基因組質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)使用BWA軟件的MEM算法默認(rèn)參

數(shù)，與滇金絲猴全基因組序列比對(duì)，去除比對(duì)上的序列，獲取滇金絲猴腸道微生物宏基因組數(shù)據(jù)。

8.4腸道微生物組數(shù)據(jù)獲取

質(zhì)控后的16SrRNA基因數(shù)據(jù)以及質(zhì)控、去除宿主信息后的宏基因組數(shù)據(jù)即為滇金絲猴腸道微生物

組數(shù)據(jù)。

3

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AA

附錄A

（規(guī)范性）

主要試劑及儀器設(shè)備

A.1主要試劑

A.1.150×TAE緩沖液(TAEBuffer)：Tris堿242g和57.1mL冰醋酸，用雙蒸水定容到1L。

A.1.2GeneFinder核酸染料，用于凝膠成像顯示條帶。

A.1.36×上樣緩沖液（LoadingBuffer），含有溴酚藍(lán)，用于電泳和凝膠成像。

A.1.42.5mMdNTP試劑：dATP、dCTP、dGTP和dTTP的預(yù)混溶液。

A.1.55×PCRBuffer。

A.1.6FastPfu酶。

A.1.7無菌水：ddH2O。

A.1.8瓊脂糖。

A.1.91%瓊脂糖凝膠：用于DNA質(zhì)量檢測(cè)。1g瓊脂糖與100mL1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，60℃

時(shí)，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。

A.1.102%瓊脂糖凝膠：用于PCR產(chǎn)物檢測(cè)。2g瓊脂糖與100mL1×TAE緩沖液，加熱融化均勻，60℃

時(shí)，倒入膠槽，插上樣品梳。室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳。

A.1.11牛血清白蛋白（BSA）：球蛋白，PCR反應(yīng)過程中起到穩(wěn)定擴(kuò)增酶、降低PCR抑制物的作用。

A.1.12所使用的試劑盒中的相關(guān)試劑。

A.2儀器設(shè)備

A.2.1PCR儀。

A.2.2低溫高速離心機(jī)。

A.2.3單道可調(diào)移液器（2μL，10μL，200μL，1000μL）。

A.2.4電子天平（量程0.01mg～10000mg）。

A.2.5水浴恒溫振蕩器。

A.2.6普通離心機(jī)。

A.2.7超純水器。

A.2.8高壓滅菌器。

A.2.9電泳儀。

A.2.10凝膠成像系統(tǒng)。

A.2.11磁力攪拌器。

A.2.12超低溫冰箱（?80℃）。

A.2.13低溫冰箱（?20℃）。

B

4

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附錄B

（規(guī)范性）

糞便樣品的采集和保存方法

B.1采樣

B.1.1基本要求

采樣時(shí)，應(yīng)符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的福利和倫理的相關(guān)要求。

B.1.2采樣工具、標(biāo)本容器標(biāo)準(zhǔn)以及人員要求

B.1.2.1圈養(yǎng)滇金絲猴采樣工具

記錄表格、一次性PE手套、封口袋、5mL塑料樣品管、無水乙醇、記號(hào)筆、鉛筆、標(biāo)簽紙、剪刀、

鑷子、注射器、酒精棉等。

B.1.2.2野外滇金絲猴采樣工具

在B.1.2.1的基礎(chǔ)上，增加北斗定位系統(tǒng)、羅盤、地形圖等。

B.1.2.3標(biāo)本容器的標(biāo)準(zhǔn)

盛糞便標(biāo)本的容器應(yīng)清潔、干燥、有蓋，無吸水和滲漏。細(xì)菌學(xué)檢查，糞便標(biāo)本應(yīng)采集于滅菌、有

蓋的容器內(nèi)。

B.1.2.4采樣人員要求

樣本采集人員應(yīng)是經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的人員，嚴(yán)格穿戴個(gè)人防護(hù)裝備。

B.2糞便新鮮程度判定

以滇金絲猴糞便表面的完整程度、濕度顏色以及氣味等條件判斷滇金絲猴糞便的新鮮程度。新鮮的

糞便樣品表面完整光滑無雜質(zhì)，微微濕潤(rùn)有光澤感，呈綠色或深綠色。

B.3糞便樣品的選取原則

B.3.1采集滇金絲猴新鮮糞便，同一堆糞便只采集一份樣品，兩堆樣品的距離應(yīng)大于3m。

B.3.2滇金絲猴母幼糞便樣品，應(yīng)分開采集；依據(jù)母猴和幼猴的糞便大小有明顯差異作出判斷，并在

備注欄記錄。

B.3.3采集3g～5g新鮮糞便。

B.4樣品采集方法

B.4.1采集糞便內(nèi)部的樣品，并佩戴一次性PE手套。每次采樣時(shí)應(yīng)更換新的PE手套，以避免樣品間的

交叉污染。

B.4.2采集時(shí)，直接剝?nèi)》蛛x新鮮糞便的內(nèi)部部分，分別放入盛有無水乙醇的樣品管中，擰緊蓋子后

上下用力擺動(dòng)數(shù)次，使樣品得到充分濕潤(rùn)，并檢查是否有液體滲漏。貼上樣品標(biāo)簽紙，標(biāo)識(shí)樣品編號(hào)和

坐標(biāo)，將樣品管放入自封袋，并再次寫上樣品編號(hào)，以避免無水乙醇漏出導(dǎo)致編號(hào)丟失。

B.5樣品記錄與編號(hào)

5

DB53/T1057—2021

在采集糞便樣品時(shí)，應(yīng)填寫《滇金絲猴糞便樣品采集記錄表A》（見表B.1）和《滇金絲猴糞便樣

品采集記錄表B》（見表B.2）。記錄采樣包括樣品編號(hào)、采集管數(shù)、種群、采集地點(diǎn)、采集日期、采

集人、經(jīng)緯度、海拔、新鮮程度、糞粒大小等信息。

表B.1滇金絲猴糞便樣品采集記錄表A

樣品編號(hào)采集管數(shù)種群采集地點(diǎn)采集日期采集人

表B.2滇金絲猴糞便樣品采集記錄表B

樣品編號(hào)經(jīng)度緯度海拔（m）新鮮程度糞粒大?。╣)備注

B.6樣品的臨時(shí)保存

野外樣品采回后，應(yīng)仔細(xì)檢查核對(duì)標(biāo)簽和記錄，并補(bǔ)充無水乙醇至樣品完全浸沒。無水乙醇中的樣

品可以室內(nèi)常溫保存；有條件時(shí)可進(jìn)行冷藏或冷凍保存。

B.7樣品的運(yùn)輸及驗(yàn)收

B.7.1運(yùn)輸材料、設(shè)備和儀器

B.7.1.1樣本容器：容器僅指直接盛放樣本的瓶子、管子等小型容器。

B.7.1.2運(yùn)輸設(shè)備和器材：指車載冰箱、冰盒、冰袋、干冰。

B.7.2運(yùn)輸要求

B.7.2.1送樣時(shí)，樣品應(yīng)盡量使用冰盒（泡沫盒＋干冰＋冰袋）盛裝，以保證運(yùn)輸過程中的低溫條件。

由于保存DNA的無水乙醇是易燃易爆的化學(xué)品，樣品應(yīng)通過專用汽車運(yùn)送，并注意車內(nèi)通風(fēng)，車內(nèi)不

應(yīng)吸煙。運(yùn)輸過程中樣品應(yīng)遠(yuǎn)離火源，避免擠壓。

B.7.2.2填寫《樣本運(yùn)輸紀(jì)錄表》，具體見表B.3。

表B.3樣本運(yùn)輸記錄表

樣本編號(hào)運(yùn)輸方式貨單號(hào)樣本容器運(yùn)輸設(shè)備及器材樣本完整性

B.7.3樣本驗(yàn)收

B.7.3.1樣本接收時(shí)，應(yīng)觀察樣本容器的外觀，檢查有無破損，并記錄外觀狀態(tài)。

B.7.3.2查看《樣本運(yùn)輸紀(jì)錄表》，核對(duì)樣本數(shù)量及運(yùn)輸方式。

B.7.3.3如箱內(nèi)有溫度記錄設(shè)備，應(yīng)優(yōu)先取出核對(duì)箱內(nèi)溫度記錄。

6

DB53/T1057—2021

B.7.3.4樣本取出后，應(yīng)立即轉(zhuǎn)移進(jìn)入預(yù)制冷的低溫存儲(chǔ)設(shè)備中，并逐一登記入庫。

B.8樣本實(shí)驗(yàn)室保存

B.8.1糞便樣本應(yīng)放于?80℃冰箱進(jìn)行低溫保存，若條件不允許，可短期（1個(gè)月內(nèi)）在?20℃冰箱

中冷凍保存。注意在樣本凍存期間，請(qǐng)勿反復(fù)凍融。

B.8.2樣本的儲(chǔ)存容器應(yīng)有標(biāo)定的使用溫度，并能長(zhǎng)時(shí)間密封儲(chǔ)存在?80℃低溫環(huán)境下。本文件推薦

使用凍存管。

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CB

附錄C

（規(guī)范性）

總DNA樣品的提取步驟、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及成像方法

C.1總DNA樣品的提取步驟

本文件選取常用商品試劑盒進(jìn)行總DNA樣品的提取，可選取其他試劑盒進(jìn)行總DNA提取，按試

劑盒說明進(jìn)行提取，常用提取步驟如下（若試劑盒有特殊說明則按試劑盒說明進(jìn)行）：

a)添加500mg磁珠、0.5g樣品和1mLSLX-MlusBuffer到2mL離心管中，粉碎研磨儀45HZ

震蕩250s；

b)加入100μLDSBuffer，顛倒混勻；

c)70℃孵育10min，95℃孵育2min；

d)室溫13000rpm/min，離心5min；

e)轉(zhuǎn)移800μL上清至新的2mL離心管中，加入270μLP2Buffer以及100μLHTRReagent；

f)顛倒混勻，–20℃孵育5min；

g)室溫13000rpm/min離心5min；

h)轉(zhuǎn)移上清至新2mL離心管，加入等量XP5Buffer及40μL磁珠，上下顛倒混勻8min；

i)磁力架吸附，棄去殘液，取下管子，加入500μLXP5Buffer，混勻；

j)磁力架吸附，棄去殘液，取下管子，加入600μLPHB，混勻；

k)磁力架吸附，棄去殘液，取下管子，加入600μLSPWWashBuffer，混勻；

l)磁力架吸附，棄去殘液，取下管子，加入600μLSPWWashBuffer，混勻；

m)磁力架吸附，棄去殘液，室溫13000rpm/min，離心10s；

n)磁力架吸附，用移液槍棄去殘液，室溫靜置8min；

o)加入100μLElutionBuffer，混勻，靜置5min；

p)磁力架吸附，轉(zhuǎn)移上清至新的1.5mL離心管，得到總DNA。

C.2瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及成像方法

C.2.1配制濃度為1%的瓊脂糖凝膠（即1×TAE電泳緩沖液100mL加1g瓊脂糖），加熱融化混勻，冷

卻至60℃左右，加入濃度為0.005%Goldenview核酸染料（按每100mL瓊脂糖溶液中加入5μL核酸染

料溶液的比例），混勻后倒入膠槽，插上樣品梳。配置2%瓊脂糖凝膠需1×TAE電泳緩沖液100mL加2

g瓊脂糖。

C.2.2室溫下待凝膠凝固后，垂直向上拔出固定在凝膠中的樣品梳，將瓊脂糖凝膠和膠板置于電泳槽

中，使樣本孔位于電場(chǎng)負(fù)極，向電泳槽中加入1×TAE電泳緩沖液。

C.2.3取3μLDNA，加2μL上樣緩沖液并混勻，然后依次將DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、檢測(cè)樣品上樣到點(diǎn)樣

孔中。電泳電壓為130V，當(dāng)上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)條帶遷移至凝膠1/2的位置，停止電泳。最后取出瓊

脂糖凝膠，置于凝膠成像儀成像拍照、保存。

8

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DC

附錄D

（規(guī)范性）

16SrRNAPCR引物、反應(yīng)體系、反應(yīng)時(shí)間及產(chǎn)物純化步驟

D.1PCR反應(yīng)引物序列

表D.1給出PCR反應(yīng)引物序列。

表D.1PCR反應(yīng)引物序列

引物名稱序列

338FACTCCTACGGGAGGCAGCAG

806RGGACTACHVGGGTWTCTAAT

D.2PCR反應(yīng)體系

可使用多種PCR擴(kuò)增酶進(jìn)行擴(kuò)增，本標(biāo)準(zhǔn)使用FastPfu酶。表D.2給出PCR反應(yīng)體系。

表D.2PCR反應(yīng)體系（20μL）

組分用量（μL）

無菌水(ddH2O)6.8

5×PCRBuffer4

2.5mMdNTP2

338F(5μM)0.8

806R(5μM)0.8

Taq酶（2.5U/μL）0.4

牛血清白蛋白（20mg/μL）0.2

模板（總DNA2.0ng/μL）