固廢紡織原料中大腸埃希氏菌的快速檢驗(yàn)方法2023-09-20實(shí)施2023-09-20實(shí)施I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件由烏魯木齊海關(guān)提出。本文件由烏魯木齊海關(guān)歸口并組織實(shí)施。本文件起草單位：烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心、成都海關(guān)、新疆師范大學(xué)、新疆環(huán)疆綠源環(huán)?？萍加邢薇疚募饕鸩萑耍喊凸峁披?馬那提拜、劉俊、鞏志國、王翀、高沙爾.卡依爾哈力、劉冬志、塔伊爾·買買提江、萬永亮、王靜靜、房芳、張偉、車娟、王潔、白梅花、王斌、范偉功、謝偉、張飛宇、劉秀玲。本文件實(shí)施應(yīng)用中的疑問，請咨詢?yōu)豸斈君R海關(guān)海關(guān)技術(shù)中心。對本文件的修改意見建議，請反饋至烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心(烏魯木齊市南湖北路116號)、烏魯木齊海關(guān)(烏魯木齊市北京南路295號)、新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局(烏魯木齊市新華南路167烏魯木齊海關(guān)技術(shù)中心聯(lián)系電話郵編：830063烏魯木齊海關(guān)聯(lián)系電話郵編：830011新疆維吾爾自治區(qū)市場監(jiān)督管理局聯(lián)系電話郵編：830004I目前大多固廢紡織原料加工過程中僅靠添加抗菌劑和防腐劑來抑制其攜帶的微生物的增殖，并不能全面有效殺死其攜帶的有害微生物，因此固廢類紡織原料存在較大的生物安全隱患。常規(guī)培養(yǎng)和分離方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，操作復(fù)雜，周期較長。為快速檢驗(yàn)固廢紡織原料中的大腸埃希氏菌，特制定本文件。1固廢紡織原料中大腸埃希氏菌的本文件規(guī)定了固廢紡織原料中大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)的術(shù)語和定義、縮略語、原理、設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑，描述了檢驗(yàn)程序、操作步驟、結(jié)果報(bào)告的方法。僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本GB4789.6食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測1)dATP:脫氧腺苷三磷酸，deoxyadenosidetripho2)dCTP:脫氧胞苷三磷酸，deoxycytidinet3)dGTP:脫氧鳥苷三磷酸，deoxyguanosidetriphosphate4)dNTP:脫氧核苷三磷酸，deoxyribonucleosidetriphosphate5)dTTP:脫氧胸苷三磷酸，deoxythymidin2利用大腸埃希氏菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣、特異性生物酶β-葡萄糖醛酸酶(β-glucuronidase)、分解5溴-4氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷環(huán)己基胺鹽產(chǎn)生游離5溴-4氯-3-吲哚基的特性，在大腸埃希氏菌發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸條件下呈藍(lán)綠色的沉淀物，初篩判斷大腸埃希氏菌存在可能；編碼β-葡萄糖醛酸酶的uidA基因分布于幾乎所有大腸埃希氏菌體內(nèi)，屬于大腸埃希氏菌的特異性保守基因，置在電場當(dāng)中，在一定的電場強(qiáng)度下，不同分子以不同的速度遷移，從而分離出目標(biāo)DNA片段，與DNA分子量標(biāo)記物比對，確定樣品中是否存在目標(biāo)菌。除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：a)冰箱：2℃~5℃b)恒溫水浴箱：44.5℃c)天平：感量為0.1gd)拍擊式均質(zhì)器f)低溫高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速≥12000r/min,控溫4℃~8℃j)無菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器1)無菌錐形瓶：容量500mLa)生理鹽水：應(yīng)符合附錄A中A.1的要求b)改良EC肉湯：應(yīng)符合附錄A中A.2的要求c)無菌1mol/LNaOH:應(yīng)符合附錄A中A.3的要求g)50×TAE電泳緩沖液：應(yīng)符合附錄A中A.7的要求h)6×上樣緩沖液：應(yīng)符合附錄A中A.8的要求j)dNTPs:dATP、dTTP、dGTP、dCTP每種濃度為2.5mmol/L3o)DNA分子量標(biāo)記物(100bp-p)凝膠染色液濃度(0.5μg/mL)大腸埃希氏菌的定性檢驗(yàn)程序見圖1檢樣10檢樣10g+200mL生理鹽水取10mL改良EC肉湯50mL4樣品以無菌操作稱取檢樣10g,加入裝有200mL生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)取10mL樣液加入50mL改良EC肉湯試管(管內(nèi)有小倒管)中，44.5℃±0.2℃培養(yǎng)24h±2h,觀察小倒管內(nèi)是否產(chǎn)氣、產(chǎn)藍(lán)綠色沉淀。24h±2h未產(chǎn)氣、不產(chǎn)藍(lán)綠色沉淀的則判定為大腸埃希氏菌陰性；對產(chǎn)氣、產(chǎn)藍(lán)綠色沉淀者進(jìn)行PCR確認(rèn)實(shí)驗(yàn)。9.3PCR確認(rèn)實(shí)驗(yàn)離子水充分混勻菌體，于100℃水浴或者金屬浴維持10min;冰浴冷卻后，12000r/min離心3min,收模板直接用于PCR反應(yīng)或暫存于4℃并當(dāng)天進(jìn)行PCR反應(yīng)；否則，應(yīng)在-20℃以下保存?zhèn)溆?1周)。9.3.2.2陰性對照：非目標(biāo)菌提取DNA作為PCR反應(yīng)的模板；9.3.2.3陽性對照：大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株提取DNA作為PCR反應(yīng)的模板。9.3.3.110×引物工作液配制：引物干粉稀釋成100μmol/L儲存液后，根據(jù)目標(biāo)基因?qū)?yīng)PCR體系內(nèi)引物終濃度，使用滅菌去離子水配制10×引物工作液。引物在反應(yīng)體系內(nèi)的終濃度應(yīng)符合附錄9.3.3.2根據(jù)樣本數(shù)量設(shè)定所需要PCR反應(yīng)管數(shù)：1管空白對照+1管陰性對照+1管陽性對照+樣本9.3.3.3將10×引物工作液、10×PCR反應(yīng)緩沖液、離子水從-20℃冰箱中取出，融化并平衡至室溫，使用前混勻；5U/μLTaq酶在加樣前從-20℃冰箱取出。9.3.3.4PCR反應(yīng)體系為：總體積25μL,滅菌去離子水12.1μL;10×PCR反應(yīng)緩沖液2.5μL;預(yù)變性94℃10min;變性94℃30s,復(fù)性63℃30s,延伸72℃1.5min,30個(gè)循環(huán)；72℃9.3.5凝膠電泳9.3.5.1瓊脂糖凝膠制備應(yīng)符合下膠孔，小心上樣于孔中。陽性對照的PCR反應(yīng)產(chǎn)物加入至最后一個(gè)泳道；第一個(gè)泳道中加入2μL5電泳結(jié)果中空白對照應(yīng)無條帶出現(xiàn)，在陰性對照未出現(xiàn)條帶，陽性對照出現(xiàn)預(yù)期大條件下，如待測樣品未出現(xiàn)相應(yīng)大小的擴(kuò)增條帶，則可報(bào)告該樣品檢驗(yàn)結(jié)果為陰性；如待測樣品出現(xiàn)相應(yīng)大小擴(kuò)增條帶則可判定該樣品結(jié)果為陽性。根據(jù)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)、PCR確認(rèn)試驗(yàn)的結(jié)果，報(bào)告被檢樣品中檢出或未檢出大腸埃希氏菌。11.1檢測過程中嚴(yán)格分區(qū)操作，需符合GB/T27403的要求，以防止核酸的交叉污染。6(規(guī)范性)A.1.1成分及含量，見表A.1生理鹽水各成分及其含量氯化鈉(NaCl)將氯化鈉在蒸餾水中溶解，121℃高壓滅菌15min。磷酸氫二鉀(K2HP04)磷酸二氫鉀(KH2P04)氯化鈉1mg/mL5溴-4氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸苷環(huán)己基胺鹽溶液。A.2.3制法將成分A溶解于蒸餾水中，校正pH至6.9±0.2。分裝到有玻璃小倒管的試管中，121℃高壓滅菌7A.3.2制法A.4.1成分及含量，見表A.41mol/LHCI鹽酸(HC1)A.5.1成分及含量，見表A.5TE子水均勻，再定容至1000mL,121℃A.6.1成分及含量見表A.610×PCR氯化鉀(KC1)8將氯化鉀溶于1mol/LTris-HC1(pH8.5),定容至1000mL,121℃高壓滅菌15min,分裝后-20℃保存。A.750×TAE電泳緩沖液A.7.1成分及含量，見表A.750×TAE成分及其含量冰乙酸(CH3COOH)A.7.2制法Tris和EDTA-2Na溶于800mL滅菌去離子水，充分?jǐn)嚢杈鶆?；加入冰乙酸，充分溶解；?mol/LA.86×上樣緩沖液A.8.1成分及含量，見表A.86×上樣緩沖液成分及其含量甘油溴酚藍(lán)A.8.2制法0.5mol/LEDTA(pH8.0)溶于500mL滅菌去離子水中，加入溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF溶解，與