mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的分子機制探秘一、引言1.1研究背景與意義腦膠質瘤是顱內最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，具有高度侵襲性和異質性，嚴重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，腦膠質瘤的發(fā)病率在顱內腫瘤中位居首位，且近年來呈上升趨勢。盡管手術、放療、化療等綜合治療手段不斷發(fā)展，但患者的預后仍然很差，5年生存率較低。例如，膠質母細胞瘤作為最常見且惡性程度最高的腦膠質瘤亞型，患者的中位生存期僅為12-15個月。血管生成在腫瘤的生長、侵襲和轉移過程中起著至關重要的作用。腫瘤的生長依賴于充足的血液供應來獲取營養(yǎng)物質和氧氣，并排出代謝產(chǎn)物。傳統(tǒng)觀點認為，腫瘤血管主要由內皮細胞增殖和遷移形成。然而，近年來發(fā)現(xiàn)的血管生成擬態(tài)（vasculogenicmimicry，VM）現(xiàn)象，為腫瘤血管生成機制的研究帶來了新的視角。VM是指腫瘤細胞通過自身變形、遷移、基質重塑等過程形成類似于血管網(wǎng)絡的管道結構，這些管道能夠為腫瘤組織提供血液供應。在腦膠質瘤中，VM的存在與腫瘤的惡性程度、侵襲性和不良預后密切相關。研究表明，具有VM的腦膠質瘤患者的生存期明顯短于無VM的患者。VM的形成使得腫瘤細胞能夠逃避抗血管生成治療，因為抗血管生成藥物主要作用于內皮細胞，而VM并非由內皮細胞構成。這也是目前抗血管生成靶向治療在膠質瘤臨床應用中未獲得滿意療效的重要原因之一。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）是一種保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為細胞內重要的信號轉導分子，在調控細胞生長、增殖、代謝和存活等過程中發(fā)揮著關鍵作用。mTOR信號通路的異常激活在多種腫瘤中普遍存在，包括腦膠質瘤。研究發(fā)現(xiàn)，在高級別膠質瘤中，mTOR信號通路常常被過度激活，這與腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐藥性密切相關。mTOR可以通過調節(jié)下游一系列效應分子的表達，影響細胞周期進程、蛋白質合成、自噬等生物學過程，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。例如，mTOR可以激活p70S6K和4E-BP1，促進蛋白質合成，為細胞增殖提供物質基礎；同時，mTOR還可以抑制自噬，使腫瘤細胞在營養(yǎng)缺乏等應激條件下仍能存活和增殖。缺氧誘導因子-1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）是一種在缺氧條件下發(fā)揮重要作用的轉錄因子。在正常氧含量條件下，HIF-1α被脯氨酰羥化酶修飾，進而被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解。然而，在腫瘤組織中，由于腫瘤細胞快速增殖，血管生成相對滯后，導致腫瘤局部缺氧。在缺氧環(huán)境下，HIF-1α的降解受到抑制，其表達水平顯著升高。HIF-1α可以與HIF-1β形成異二聚體，然后轉移到細胞核內，與靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應元件結合，激活一系列靶基因的轉錄，從而調節(jié)細胞對缺氧環(huán)境的適應。這些靶基因包括血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）、葡萄糖轉運蛋白1（glucosetransporter1，GLUT1）等，它們在促進血管生成、調節(jié)能量代謝等方面發(fā)揮著重要作用。例如，VEGF是一種強效的血管生成因子，能夠促進內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，從而促進腫瘤血管生成；GLUT1則負責葡萄糖的跨膜轉運，為腫瘤細胞在缺氧條件下的代謝提供能量。越來越多的研究表明，mTOR和HIF-1α在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在密切的相互作用。mTOR可以通過多種途徑調節(jié)HIF-1α的表達和活性。一方面，mTOR可以激活p70S6K，p70S6K進而磷酸化HIF-1α，增強其穩(wěn)定性和轉錄活性；另一方面，mTOR還可以通過調節(jié)HIF-1α的上游信號通路，如PI3K/Akt通路，間接影響HIF-1α的表達。反之，HIF-1α也可以調節(jié)mTOR信號通路的活性。在缺氧條件下，HIF-1α可以激活某些基因的表達，這些基因產(chǎn)物可以反饋調節(jié)mTOR信號通路，從而影響腫瘤細胞的生長和代謝。此外，mTOR和HIF-1α還可以共同調節(jié)一些與腫瘤血管生成和轉移相關的基因表達，協(xié)同促進腫瘤的發(fā)展。鑒于mTOR和HIF-1α在腦膠質瘤血管生成擬態(tài)中的重要作用，深入研究mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的機制具有重要的理論和臨床意義。在理論方面，這將有助于我們進一步揭示腦膠質瘤血管生成的復雜機制，豐富對腫瘤生物學行為的認識，為腫瘤血管生成相關理論的發(fā)展提供新的依據(jù)。在臨床方面，明確這一調控機制將為腦膠質瘤的治療提供新的靶點和策略。通過靶向mTOR或HIF-1α信號通路，有望抑制腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的形成，提高抗血管生成治療的療效，從而改善患者的預后。此外，深入了解這一機制還有助于開發(fā)新的診斷標志物，用于早期診斷和病情監(jiān)測，為腦膠質瘤的精準治療奠定基礎。1.2國內外研究現(xiàn)狀近年來，腦膠質瘤血管生成擬態(tài)、mTOR和HIF-1α相關研究在國內外都取得了顯著進展。在腦膠質瘤血管生成擬態(tài)方面，國外學者ManiotisAJ等早在1999年就首次在人黑色素瘤細胞中發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，為腫瘤血管生成研究開辟了新領域。后續(xù)研究逐漸證實，血管生成擬態(tài)在腦膠質瘤中同樣存在。如ElHallaniS等通過對膠質母細胞瘤的研究，發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞能夠形成管狀血管生成擬態(tài)結構，并且這種結構與腫瘤的惡性程度及患者預后密切相關。國內研究也在不斷深入，蔡輝等對膠質瘤血管生成擬態(tài)的研究進行了系統(tǒng)總結，指出血管生成擬態(tài)的形成與腫瘤細胞的“干細胞樣”轉化、腫瘤缺氧環(huán)境、高間質液壓、基質重塑以及免疫細胞參與等多種因素相關。目前關于血管生成擬態(tài)的研究主要集中在其形成機制和臨床意義上，雖然取得了一定成果，但仍存在許多未知領域，如具體的分子調控網(wǎng)絡尚不完全明確。對于mTOR與腦膠質瘤的研究，國外有大量基礎和臨床研究報道。研究發(fā)現(xiàn)，mTOR信號通路在腦膠質瘤中常常異常激活，并且與腫瘤細胞的增殖、侵襲、耐藥等生物學行為密切相關。例如，一些研究表明抑制mTOR信號通路可以有效抑制腦膠質瘤細胞的生長和增殖。國內學者也在積極探索mTOR在腦膠質瘤中的作用機制，曾崢等對mTOR與腦膠質瘤的研究進展進行了綜述，指出mTOR信號通路的異常激活可能通過調節(jié)細胞周期、蛋白質合成等過程促進腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展。目前，以mTOR為靶點的靶向治療研究也在不斷開展，但由于腫瘤的異質性和復雜的信號通路網(wǎng)絡，mTOR靶向治療的療效仍有待進一步提高。在HIF-1α與腦膠質瘤的研究領域，國外研究表明，在腦膠質瘤缺氧微環(huán)境下，HIF-1α表達顯著上調，進而激活一系列靶基因，促進腫瘤血管生成、能量代謝重編程以及腫瘤細胞的侵襲轉移。如在膠質母細胞瘤中，HIF-1α通過上調VEGF的表達，促進腫瘤血管生成，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣。國內研究也取得了重要成果，有研究通過對膠質瘤組織的檢測，發(fā)現(xiàn)HIF-1α蛋白的陽性表達率與膠質瘤的病理分級呈正相關，提示HIF-1α在膠質瘤的惡性進展中發(fā)揮重要作用。盡管目前對HIF-1α在腦膠質瘤中的作用有了一定認識，但HIF-1α與其他信號通路的相互作用以及其在不同亞型腦膠質瘤中的特異性作用仍需深入研究。雖然目前國內外對于腦膠質瘤血管生成擬態(tài)、mTOR和HIF-1α的研究已經(jīng)取得了許多成果，但仍存在一些不足。在腦膠質瘤血管生成擬態(tài)方面，其分子調控機制尚未完全闡明，尤其是與其他血管生成途徑之間的相互關系以及如何精準靶向抑制血管生成擬態(tài)的形成仍有待深入研究。對于mTOR和HIF-1α，雖然已知它們在腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，但mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的具體分子機制尚不明確，相關信號通路的上下游分子及調控網(wǎng)絡還需進一步探索。此外，目前的研究多集中在細胞和動物實驗層面，如何將這些基礎研究成果轉化為有效的臨床治療手段，還需要更多的臨床試驗驗證。綜上所述，深入研究mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的機制，不僅有助于完善對腦膠質瘤血管生成復雜機制的認識，還可能為腦膠質瘤的治療提供新的靶點和策略，具有重要的理論和臨床價值。1.3研究目的與內容1.3.1研究目的本研究旨在深入探究mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的分子機制，為腦膠質瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體而言，期望明確mTOR、HIF-1α與腦膠質瘤血管生成擬態(tài)之間的內在聯(lián)系，揭示相關信號通路的調控網(wǎng)絡，從而為開發(fā)更有效的腦膠質瘤治療策略奠定基礎，最終改善患者的預后。1.3.2研究內容腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的臨床意義及其與mTOR表達的相關性分析：收集腦膠質瘤患者的臨床標本，包括不同病理分級的膠質瘤組織和正常腦組織。通過免疫組織化學、免疫熒光等技術檢測血管生成擬態(tài)相關標志物（如CD31/PAS雙染顯示的血管生成擬態(tài)管道結構）以及mTOR蛋白的表達水平。分析血管生成擬態(tài)的形成與腦膠質瘤患者的臨床病理特征（如腫瘤分級、患者生存期等）之間的關系，并進一步探討mTOR表達與血管生成擬態(tài)形成的相關性，明確mTOR在腦膠質瘤血管生成擬態(tài)中的潛在作用。缺氧及mTOR特異性阻斷劑Rapamycin對惡性膠質瘤血管生成擬態(tài)形成的影響：建立體外惡性膠質瘤細胞培養(yǎng)模型，模擬腫瘤缺氧微環(huán)境。通過將膠質瘤細胞置于低氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，設置不同的氧濃度梯度，研究缺氧對膠質瘤細胞血管生成擬態(tài)形成能力的影響。同時，使用mTOR特異性阻斷劑Rapamycin處理膠質瘤細胞，觀察其對血管生成擬態(tài)形成的作用。采用三維培養(yǎng)技術，如Matrigel基質膠培養(yǎng)，觀察細胞在三維環(huán)境中形成血管樣結構的能力；利用Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，綜合評估缺氧及Rapamycin對惡性膠質瘤血管生成擬態(tài)形成的影響。mTOR參與惡性膠質瘤血管生成擬態(tài)的分子生物學機制研究：在明確mTOR對惡性膠質瘤血管生成擬態(tài)形成的影響后，深入探究其分子生物學機制。通過基因敲低、過表達等技術手段，改變膠質瘤細胞中mTOR的表達水平，然后檢測HIF-1α及其下游相關靶基因（如VEGF、MMPs等）的表達變化。運用Westernblot、Real-timePCR等技術檢測蛋白和mRNA水平的變化，明確mTOR是否通過調控HIF-1α及其下游信號通路來影響血管生成擬態(tài)的形成。此外，通過免疫共沉淀、熒光素酶報告基因實驗等方法，進一步驗證mTOR與HIF-1α之間的相互作用關系以及相關信號通路的激活情況，全面揭示mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的分子機制。1.4研究方法與技術路線1.4.1研究方法臨床標本收集與檢測：收集腦膠質瘤患者手術切除的腫瘤組織標本以及正常腦組織標本（作為對照），標本數(shù)量根據(jù)實際情況確定，預計收集[X]例膠質瘤組織和[X]例正常腦組織。詳細記錄患者的臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分級、病理類型、治療方式及預后等信息。采用免疫組織化學技術，對標本中的血管生成擬態(tài)相關標志物（如CD31/PAS雙染顯示的血管生成擬態(tài)管道結構）以及mTOR蛋白進行檢測，觀察其在組織中的表達定位和水平；利用免疫熒光技術進一步驗證相關蛋白的表達情況，并進行半定量分析。細胞實驗：選用人惡性膠質瘤細胞系（如U87、U251等）進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。建立缺氧模型，將細胞置于低氧培養(yǎng)箱（氧濃度設置為1%-3%，模擬腫瘤缺氧微環(huán)境）中培養(yǎng)不同時間（如12h、24h、48h等），設置常氧組（21%氧濃度）作為對照。使用mTOR特異性阻斷劑Rapamycin處理細胞，設置不同濃度梯度（如10nM、50nM、100nM等），作用相應時間。采用三維培養(yǎng)技術，將膠質瘤細胞接種于Matrigel基質膠中，觀察細胞在三維環(huán)境下形成血管樣結構的能力，通過拍照和圖像分析統(tǒng)計血管生成擬態(tài)相關指標（如管道長度、分支數(shù)、連通性等）。利用Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力，在小室上室接種細胞，下室加入趨化因子，培養(yǎng)一定時間后，固定染色，計數(shù)遷移或侵襲到下室的細胞數(shù)量。分子生物學技術：通過基因敲低技術，設計針對mTOR基因的小干擾RNA（siRNA），轉染膠質瘤細胞，抑制mTOR的表達；利用基因過表達技術，構建mTOR過表達質粒，轉染細胞使其過表達mTOR。采用Westernblot技術檢測mTOR、HIF-1α及其下游相關靶基因（如VEGF、MMPs等）的蛋白表達水平變化，提取細胞總蛋白，進行SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，與相應的一抗和二抗孵育，最后通過化學發(fā)光法顯影并分析條帶灰度值。運用Real-timePCR技術檢測上述基因的mRNA表達水平，提取細胞總RNA，反轉錄為cDNA后進行PCR擴增，以β-actin等為內參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算基因相對表達量。通過免疫共沉淀實驗驗證mTOR與HIF-1α之間是否存在相互作用，裂解細胞后提取總蛋白，加入mTOR或HIF-1α抗體及ProteinA/G磁珠進行免疫沉淀，洗脫后進行Westernblot檢測；利用熒光素酶報告基因實驗驗證相關信號通路的激活情況，構建含有缺氧反應元件的熒光素酶報告基因載體，轉染細胞后，檢測熒光素酶活性變化。動物實驗：選用裸鼠作為動物模型，將膠質瘤細胞（如U87細胞）接種于裸鼠皮下或顱內，構建腦膠質瘤裸鼠移植瘤模型。待腫瘤生長至一定體積后，將裸鼠隨機分為對照組、缺氧組、Rapamycin處理組等。缺氧組通過低氧艙飼養(yǎng)裸鼠模擬腫瘤缺氧環(huán)境；Rapamycin處理組腹腔注射Rapamycin進行干預。定期測量腫瘤體積，觀察腫瘤生長情況。實驗結束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，進行免疫組織化學、免疫熒光等檢測，分析血管生成擬態(tài)相關指標以及mTOR、HIF-1α等蛋白的表達情況。同時，通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察腫瘤組織的病理形態(tài)學變化。1.4.2技術路線本研究的技術路線如圖1-1所示。首先收集腦膠質瘤患者的臨床標本，進行血管生成擬態(tài)相關標志物和mTOR蛋白表達的檢測及相關性分析。同時，在體外進行膠質瘤細胞培養(yǎng)，建立缺氧模型和使用Rapamycin處理，通過三維培養(yǎng)和Transwell小室實驗等檢測血管生成擬態(tài)及細胞遷移侵襲能力的變化。接著，運用分子生物學技術，通過基因敲低和過表達等手段，研究mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的分子機制。最后，構建腦膠質瘤裸鼠移植瘤模型，在體內驗證相關機制，綜合分析實驗結果，得出研究結論。[此處插入技術路線圖，圖中應清晰展示從臨床標本收集、細胞實驗、分子生物學實驗到動物實驗的各個環(huán)節(jié)及相互關系，標注關鍵實驗步驟和檢測指標等信息][此處插入技術路線圖，圖中應清晰展示從臨床標本收集、細胞實驗、分子生物學實驗到動物實驗的各個環(huán)節(jié)及相互關系，標注關鍵實驗步驟和檢測指標等信息]圖1-1技術路線圖二、腦膠質瘤與血管生成擬態(tài)概述2.1腦膠質瘤的特點與危害腦膠質瘤是顱內最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其起源于神經(jīng)膠質細胞。神經(jīng)膠質細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布，對神經(jīng)元起到支持、營養(yǎng)和保護等作用。然而，當這些膠質細胞發(fā)生癌變時，就會形成腦膠質瘤。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的分類標準，腦膠質瘤主要分為星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、室管膜瘤等不同類型。其中，星形細胞瘤最為常見，又可進一步分為低級別星形細胞瘤（WHOⅠ-Ⅱ級）和高級別星形細胞瘤（WHOⅢ-Ⅳ級），膠質母細胞瘤（glioblastomamultiforme，GBM）屬于高級別星形細胞瘤中的Ⅳ級，是惡性程度最高的腦膠質瘤亞型。腦膠質瘤的發(fā)病率在顱內腫瘤中占據(jù)首位。據(jù)統(tǒng)計，其年發(fā)病率約為5-8/10萬，且近年來呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。這種上升趨勢可能與環(huán)境因素、生活方式改變以及醫(yī)療診斷技術的進步等多種因素有關。環(huán)境因素中，長期接觸電離輻射、某些化學物質（如殺蟲劑、有機溶劑等）可能增加腦膠質瘤的發(fā)病風險；生活方式方面，長期精神壓力過大、不良的飲食習慣（如高鹽、高脂肪飲食）等也可能對腦膠質瘤的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生影響。醫(yī)療診斷技術的進步使得更多的腦膠質瘤病例能夠被及時發(fā)現(xiàn)和準確診斷，從而在一定程度上提高了其統(tǒng)計發(fā)病率。腦膠質瘤具有高度侵襲性和異質性，這是其兩個最為顯著的特點。高度侵襲性使得腫瘤細胞能夠突破周圍組織的限制，向周圍正常腦組織浸潤生長，如同樹根扎入土壤一般，難以徹底清除。腫瘤細胞會沿著神經(jīng)纖維束、血管周圍間隙等解剖結構擴散，與正常腦組織相互交織，邊界模糊，這給手術切除帶來了極大的困難。例如，在手術過程中，很難準確界定腫瘤的邊界，導致切除不徹底，殘留的腫瘤細胞容易復發(fā)。異質性則表現(xiàn)為腫瘤細胞在形態(tài)、基因表達、代謝等方面存在顯著差異。即使是同一腫瘤組織中的不同區(qū)域，腫瘤細胞的特性也可能截然不同。這種異質性使得腦膠質瘤對治療的反應各不相同，有的腫瘤細胞對化療藥物敏感，而有的則具有耐藥性；對放療的敏感性也存在差異。這也是導致腦膠質瘤治療效果不佳的重要原因之一。腦膠質瘤嚴重威脅人類健康，給患者及其家庭帶來了沉重的負擔。由于其生長在顱內，會占據(jù)顱內空間，導致顱內壓升高，進而引起一系列嚴重的癥狀?；颊叱３霈F(xiàn)頭痛、嘔吐、視力減退、復視等癥狀，這些癥狀嚴重影響患者的生活質量。頭痛通常是持續(xù)性的，且逐漸加重，疼痛程度因人而異；嘔吐多為噴射性，與進食無關；視力減退和復視則會影響患者的視覺功能，給日常生活帶來諸多不便。隨著腫瘤的進一步發(fā)展，還會壓迫周圍的神經(jīng)組織，導致神經(jīng)功能缺失，如肢體癱瘓、語言障礙、認知功能下降等。肢體癱瘓會使患者失去自主活動能力，需要他人照顧；語言障礙會影響患者的溝通交流；認知功能下降則會導致患者記憶力減退、思維遲緩，甚至出現(xiàn)癡呆癥狀。對于膠質母細胞瘤患者，其中位生存期僅為12-15個月，5年生存率極低，不足10%。這意味著大多數(shù)膠質母細胞瘤患者在確診后的短時間內就會面臨生命危險，給家庭帶來巨大的精神和經(jīng)濟壓力。腦膠質瘤的治療費用也非常高昂，包括手術費用、化療藥物費用、放療費用以及后續(xù)的康復治療費用等，這對于許多家庭來說是難以承受的負擔。2.2血管生成擬態(tài)的概念與發(fā)現(xiàn)歷程血管生成擬態(tài)（vasculogenicmimicry，VM）是一種有別于傳統(tǒng)腫瘤血管生成的新的腫瘤微循環(huán)模式。在過去，人們普遍認為腫瘤血管主要由內皮細胞增殖和遷移形成，然而，血管生成擬態(tài)的發(fā)現(xiàn)打破了這一傳統(tǒng)認知。1999年，ManiotisAJ等學者在對眼葡萄膜色素瘤及轉移性皮膚黑色素瘤的研究中，首次發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。他們觀察到黑色素瘤細胞相互連接形成規(guī)律的袢環(huán)狀結構網(wǎng)絡，這些結構被過碘酸席夫（periodicacid-Schiff，PAS）染色陽性的細胞外基質包繞，管道中可見紅細胞，且經(jīng)血管造影證實有血流通過，呈現(xiàn)出血管樣結構。但通過光鏡、透射電鏡及血管內皮細胞標志物（如組織因子Ⅷ相關抗原、CD31、CD34、Ulex、Flk-1等）的免疫組化檢測，均未發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞，表明這些管道結構并非由內皮細胞構成?；诖耍@種由腫瘤細胞和細胞外基質界定，能為腫瘤組織提供血液供應，且無血管內皮細胞襯里或被覆的類血管通道被命名為血管生成擬態(tài)。血管生成擬態(tài)概念的提出，為腫瘤血管生成機制的研究開辟了新的領域。隨后，眾多研究在多種實體腫瘤中都發(fā)現(xiàn)了血管生成擬態(tài)現(xiàn)象，如肝細胞癌、鼻咽癌、非小細胞肺癌、骨肉瘤、胃間質瘤、乳腺癌、腎透明細胞癌以及腦膠質瘤等。在腦膠質瘤中，2005年，陳忠平等學者采用CD34-PAS雙染，在膠質母細胞瘤中觀察到了血管生成擬態(tài)的存在。此后，更多關于腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的研究不斷涌現(xiàn)，進一步證實了其在腦膠質瘤中的存在及重要性。研究發(fā)現(xiàn)，膠質瘤中的血管生成擬態(tài)與腫瘤的惡性程度密切相關。在WHO分級較高的膠質瘤中，血管生成擬態(tài)的陽性率明顯高于低級別膠質瘤。例如，在對101例星形膠質細胞腫瘤的研究中，21例WHOⅣ級膠質瘤患者中血管生成擬態(tài)陽性8例（38.1%），39例WHOⅢ級膠質瘤患者中血管生成擬態(tài)陽性3例（7.7%），35例WHOⅡ級膠質瘤患者中血管生成擬態(tài)陽性2例（5.7%），而在WHOⅠ級膠質瘤患者中未發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。同時，血管生成擬態(tài)還與患者的預后相關，存在血管生成擬態(tài)的膠質瘤患者生存期明顯短于無血管生成擬態(tài)的患者。血管生成擬態(tài)在腫瘤血管生成中具有獨特的地位。它是腫瘤細胞為滿足自身生長和侵襲對營養(yǎng)物質及氧氣的需求，通過自身變形、遷移、基質重塑等復雜過程形成的一種特殊的血管樣結構。與傳統(tǒng)的由內皮細胞構成的血管不同，血管生成擬態(tài)的管道結構主要由腫瘤細胞和細胞外基質組成，這使得腫瘤細胞能夠繞過傳統(tǒng)的血管生成途徑，直接獲取血液供應。這種獨特的血管生成方式為腫瘤的生長和轉移提供了新的途徑，也使得腫瘤細胞能夠逃避抗血管生成治療，因為抗血管生成藥物主要作用于內皮細胞，而對血管生成擬態(tài)的管道結構無效。血管生成擬態(tài)的發(fā)現(xiàn)，揭示了腫瘤血管生成的復雜性和多樣性，為深入理解腫瘤的生物學行為和開發(fā)新的腫瘤治療策略提供了重要的理論基礎。2.3腦膠質瘤中血管生成擬態(tài)的形成過程與意義腦膠質瘤中血管生成擬態(tài)的形成是一個復雜且多步驟的過程，涉及腫瘤細胞的多種生物學行為以及腫瘤微環(huán)境的相互作用。腫瘤細胞的“干細胞樣”轉化是血管生成擬態(tài)形成的重要基礎。研究表明，發(fā)生血管生成擬態(tài)的腫瘤細胞可能恢復為多能特征，表現(xiàn)出胚胎樣表型。通過基因芯片技術對發(fā)生血管生成擬態(tài)的細胞進行基因表型分析，發(fā)現(xiàn)其具有內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、神經(jīng)元組織、平滑肌細胞以及以上前體細胞特有的基因表達。在滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤等具有雙向分化的惡性腫瘤中，也檢測到血管生成擬態(tài)的存在，這表明形成血管生成擬態(tài)的腫瘤細胞需具備多能分化能力，呈現(xiàn)“干細胞樣”特征。有學者通過活細胞成像技術，對64例膠質母細胞瘤組織進行研究，證實了惡性膠質瘤干細胞可以分化成內皮細胞，促進惡性膠質瘤血管生成擬態(tài)的形成，并且該結果在裸鼠移植瘤模型中得到了進一步驗證。腫瘤干細胞具有自我更新和多向分化的能力，它們能夠在腫瘤微環(huán)境的誘導下，分化為具有血管內皮細胞功能和表型的細胞，這些細胞相互連接，形成血管樣結構，為腫瘤組織提供血液供應。腫瘤缺氧環(huán)境是誘導血管生成擬態(tài)發(fā)生的關鍵因素之一。在膠質母細胞瘤中，腫瘤細胞的快速增殖導致腫瘤微血管生成相對滯后，進而在腫瘤局部形成缺氧微環(huán)境。在這種缺氧條件下，腫瘤細胞會自主排列成管腔樣通道結構。這些排列成血管生成擬態(tài)通道的腫瘤細胞不僅維持著腫瘤的惡性生物特征，還具有一些內皮細胞的功能和表型。缺氧微環(huán)境會激活一系列相關的信號通路和分子，從而促進血管生成擬態(tài)的形成。缺氧會使脯氨酰羥化酶活性降低，使得缺氧誘導因子（HIF）α亞基逃避vonHippel－Lindau介導的降解。HIFα亞基在細胞質中積累，隨后與HIFβ結合形成異二聚體，并易位至細胞核，激活靶基因的轉錄。缺氧還會控制HIF的降解，使HIF－1α或HIF－2α在細胞核中定位，并與靶基因的缺氧反應元件結合，如血管內皮生長因子（VEGF）、VEGF受體、上皮-間質轉化（EMT）誘導因子和腫瘤干性維持相關基因等，最終導致血管生成擬態(tài)的發(fā)生。腫瘤微環(huán)境中的高間質液壓（IFP）也在血管生成擬態(tài)的形成中發(fā)揮重要作用。腫瘤的快速細胞增殖和微循環(huán)中的無組織灌注會導致高間質液壓增加，這成為內皮細胞進入腫瘤的屏障，進而促使腫瘤中心形成缺氧環(huán)境。這種缺氧狀態(tài)會引發(fā)具有“干細胞特性”的腫瘤細胞形成血管生成擬態(tài)通道，并連接到內皮依賴性血管，從而形成早期的血管生成擬態(tài)結構。這種早期結構是腫瘤微血管和血管生成擬態(tài)結構共存的混合結構。血管生成擬態(tài)網(wǎng)絡與具有“干細胞特性”的腫瘤細胞在空間和時間上的相關性表明，這些細胞是血管生成擬態(tài)形成的早期驅動力。高間質液壓還可能通過影響腫瘤細胞的形態(tài)和遷移能力，促進腫瘤細胞之間的相互作用，從而有利于血管生成擬態(tài)的形成。基質重塑是血管生成擬態(tài)形成的關鍵步驟。在血管生成擬態(tài)的鑒定實驗中，PAS陽性染色的基質層覆蓋在血管生成擬態(tài)結構的內表面。已知的基質成分包括層粘連蛋白、膠原蛋白、粘多糖、F組織因子以及其控制劑。其中，前幾個成分也是血管基底膜的組成成分，它們能夠促進血管生成擬態(tài)結構與腫瘤微血管的連接和貫通。而F組織因子以及其控制劑之間的平衡是調節(jié)抗凝血功能，維持血管生成擬態(tài)中血液流動的關鍵調節(jié)機制?；|金屬蛋白酶（MMPs）在基質重塑過程中起著重要作用，它們可以降解細胞外基質成分，為腫瘤細胞的遷移和血管生成擬態(tài)結構的形成提供空間和條件。例如，MMP-14和MMP-2能夠將層粘連蛋白－5γ2降解為γ2＇和γ2x片段，這些片段可以刺激腫瘤細胞的侵襲和血管生成擬態(tài)的形成。免疫細胞也參與了血管生成擬態(tài)的形成過程。在膠質母細胞瘤中，腫瘤細胞能夠招募腫瘤相關免疫細胞，特別是腫瘤相關巨噬細胞（TAM）的M2型，這些細胞高度表達CD68和CD206。腫瘤細胞還可以分泌白介素4激活TAM細胞，使其CD68、Arg－1和CD204表達上調。激活的TAM在血管生成擬態(tài)陽性區(qū)域廣泛募集浸潤，激活并上調環(huán)氧化酶－2（COX－2）的表達，進一步激活腺素E（PEG2）和假定蛋白質1（EP1），通過蛋白激酶C（PKC）途徑，促使膠質瘤血管生成擬態(tài)的形成。免疫細胞還可能通過分泌其他細胞因子和趨化因子，調節(jié)腫瘤細胞的生物學行為，間接影響血管生成擬態(tài)的形成。腦膠質瘤中血管生成擬態(tài)的存在具有重要意義。它為腫瘤的生長提供了重要的血液供應途徑，使得腫瘤細胞能夠在缺乏傳統(tǒng)血管生成的情況下，依然獲取足夠的營養(yǎng)物質和氧氣，滿足其快速增殖的需求。血管生成擬態(tài)的形成與腫瘤的侵襲和轉移密切相關。腫瘤細胞在形成血管生成擬態(tài)的過程中，需要發(fā)生變形、遷移等行為，這些行為增強了腫瘤細胞的侵襲能力。血管生成擬態(tài)還為腫瘤細胞進入血液循環(huán)提供了通道，增加了腫瘤細胞遠處轉移的機會。臨床研究表明，存在血管生成擬態(tài)的腦膠質瘤患者預后較差。相關研究對101例星形膠質細胞腫瘤患者進行分析，發(fā)現(xiàn)血管生成擬態(tài)與患者性別、年齡、腫瘤部位等無相關性，但與WHO組織學分級相關，且有血管生成擬態(tài)組患者的生存期明顯短于無血管生成擬態(tài)組患者。這可能是由于血管生成擬態(tài)的存在促進了腫瘤的生長、侵襲和轉移，使得腫瘤更難以治療。血管生成擬態(tài)的存在也使得腦膠質瘤對傳統(tǒng)的抗血管生成治療產(chǎn)生耐藥性。因為傳統(tǒng)抗血管生成藥物主要作用于內皮細胞，而血管生成擬態(tài)并非由內皮細胞構成，所以這些藥物無法有效抑制血管生成擬態(tài)的形成和功能。三、mTOR與HIF-1α的生物學特性及關聯(lián)3.1mTOR的結構、功能與信號通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin，mTOR）是一種進化上高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細胞生長、增殖、代謝、自噬等諸多生理過程中發(fā)揮著關鍵的調控作用。mTOR蛋白由2549個氨基酸組成，分子量約為289kDa。其結構包含多個重要的結構域，從N端到C端依次為HEAT重復序列結構域、FRB（FKBP12-rapamycinbinding）結構域、激酶結構域和FATC（FRAP-ATM-TRRAPC-terminal）結構域。HEAT重復序列結構域由多個重復單元組成，主要介導mTOR與其他蛋白的相互作用，對于mTOR復合物的組裝和功能發(fā)揮至關重要。例如，它可以與Raptor、Rictor等蛋白結合，參與形成mTORC1和mTORC2復合物。FRB結構域是雷帕霉素及其類似物的結合位點，當雷帕霉素與FRB結構域結合后，會抑制mTOR的激酶活性，從而阻斷mTOR信號通路的傳導。這也是雷帕霉素作為mTOR抑制劑發(fā)揮作用的關鍵機制，在腫瘤治療等領域具有重要的應用價值。激酶結構域是mTOR發(fā)揮其蛋白激酶功能的核心區(qū)域，負責催化下游靶蛋白的磷酸化反應，通過對底物的磷酸化修飾來調控細胞內的各種生物學過程。FATC結構域則對mTOR的激酶活性起調節(jié)作用，它可以影響mTOR與底物的結合親和力以及激酶活性的穩(wěn)定性。mTOR主要通過形成兩種功能各異的蛋白復合物來發(fā)揮其生物學功能，即mTOR復合物1（mTORC1）和mTOR復合物2（mTORC2）。mTORC1由mTOR、RAPTOR（mTOR調節(jié)相關蛋白）、MLST8（mammalianlethalwithSEC13protein8）、PRAS40（proline-richsubstrateof40kDa）以及DEPTOR（含有mTOR相互作用蛋白的DEP結構域）等成分組成。其中，RAPTOR是mTORC1的關鍵組成部分，它包含多個WD40重復結構域，這些結構域能夠識別并結合mTORC1下游靶蛋白上的特定氨基酸序列，如TOS基序（Thr-Pro-Ser/Thr-Xaa-Asn），從而介導mTOR與靶蛋白的相互作用。RAPTOR通過與mTOR結合，增強mTOR對底物的識別和磷酸化能力，同時也參與調控mTORC1的亞細胞定位，使其能夠定位于溶酶體膜表面，進而感知細胞內營養(yǎng)物質（如氨基酸）的濃度變化，激活mTORC1信號通路。當細胞內氨基酸水平升高時，會促進RagGTP酶復合物的激活，活化的RagGTP酶通過與Raptor相互作用，將mTORC1招募至溶酶體膜表面，使其接近上游激活因子Rheb（Rashomologenrichedinbrain）。Rheb是一種小GTP結合蛋白，處于GTP結合狀態(tài)時具有活性，能夠直接激活mTORC1的激酶活性。mTORC1對雷帕霉素較為敏感，其主要功能是調節(jié)細胞生長、蛋白質合成、能量代謝及自噬等過程。在蛋白質合成方面，激活后的mTORC1會磷酸化激活4E-BP1（真核細胞翻譯啟始因子4E結合蛋白1）和S6K1（核糖體蛋白S6激酶）。低磷酸化的4E-BP1與eIF4E（真核細胞翻譯啟始因子4E）具有較高的親和力，而高磷酸化狀態(tài)的4E-BP1則可釋放出eIF4E，使得eIF4G得以與eIF4E結合，進而啟動mRNA翻譯。S6K1通過促mRNA翻譯影響細胞生長和增殖，它可以磷酸化核糖體40s小亞基S6蛋白，增強mRNA的翻譯，其翻譯產(chǎn)物可編碼核糖體及翻譯延伸因子，促進蛋白質合成。在能量代謝方面，mTORC1可以通過調節(jié)HIF-1α（缺氧誘導因子-1α）的表達來影響細胞的糖代謝。mTORC1活化后通過磷酸化其下游底物4E-BP1和S6Ks，促進HIF-1αmRNA表達，進而促進HIF-1α表達。HIF-1α高度活化是腫瘤細胞的重要特征，它可以上調葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）、己糖激酶（HK）和乳酸脫氫酶（LDHA）等基因表達，促進葡萄糖吸收，增加乳酸水平，同時增加丙酮酸脫氫酶（PDK1）活性，抑制丙酮酸轉變?yōu)橐阴oA，影響丙酮酸有氧氧化，明顯上調腫瘤細胞糖酵解水平。在自噬調節(jié)方面，mTORC1是自噬的關鍵負調控因子。當mTORC1處于激活狀態(tài)時，它會抑制自噬相關蛋白的表達和活性，從而抑制自噬的發(fā)生。相反，當mTORC1活性受到抑制時，自噬被誘導發(fā)生，細胞通過自噬來降解受損的細胞器和蛋白質，以維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)定。mTORC2包含mTOR、DEPTOR、MLST8、TTI1/TEL2復合物、RICTOR（雷帕霉素不敏感性mTOR結合蛋白）、mSIN1（哺乳動物應激激活蛋白激酶反應蛋白1）、PROTOR1/2（proteinobservedwithrictor1and2）以及PRR5（富含脯氨酸的蛋白質5）等成分。Rictor是mTORC2的重要組成成分，其N端含有獨特的RIC結構域，C端包含多個富含半胱氨酸的結構域。Rictor能夠穩(wěn)定mTORC2復合物的結構，調節(jié)mTOR的激酶活性，與mTORC2特異性底物的識別和結合密切相關。與mTORC1對雷帕霉素敏感不同，mTORC2對雷帕霉素具有一定的耐受性，這主要歸因于Rictor的存在。mTORC2主要作用于AKT/PKB、SGK、PKC等下游分子，調控細胞周期、能量代謝、細胞存活、離子轉運及細胞骨架構建等生物活動。在細胞存活方面，mTORC2可以通過磷酸化AKT的Ser473位點，使其完全活化，進而激活下游的抗凋亡信號通路，促進細胞存活。在細胞骨架構建方面，mTORC2可以調節(jié)PKC的活性，PKC參與調節(jié)細胞骨架的重組和細胞形態(tài)的維持，從而影響細胞的遷移和侵襲能力。mTOR信號通路的激活受到多種細胞信號的調控，包括有絲分裂生長因子、胰島素等激素、營養(yǎng)素（氨基酸、葡萄糖）、細胞能量水平和應激條件等。生長因子信號是激活mTOR信號通路的重要途徑之一。以胰島素為例，胰島素與胰島素受體結合后，受體自身磷酸化并激活，進而招募胰島素受體底物（IRS）。IRS通過與PI3K的p85亞基結合，激活PI3K，PI3K催化膜結合的PIP2（磷脂酰肌醇(4，5)二磷酸）轉化為PIP3（磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸）。PIP3然后與Akt的pleckstrin同源結構域結合，通過二聚化和暴露其催化位點而導致Akt的激活。AKT直接磷酸化mTOR，也可能通過TSC1/TSC2（結節(jié)性硬化癥復合體）的作用間接作用于mTOR。蛋白質TSC1（Hamartin）和TSC2（Tuberin）的物理結合產(chǎn)生了抑制mTOR的功能復合體。TSC2對Rheb具有GAP（GTPase-ActivatingProtein）活性，推測TSC1/TSC2復合物通過刺激Rheb的GTP水解來抑制mTOR信號轉導，而活化的Akt會抑制性磷酸化其下游TSC2，阻礙TSC2和TSC1的結合，使受其抑制的Rheb活性釋放，間接通過Rheb激活mTORC1。生長因子還能通過激活MAPK信號通路，促進mTORC1的激活。ERK1/2作為MAPK信號通路的關鍵分子，能夠磷酸化mTOR的上游調控蛋白，增強mTORC1的活性。營養(yǎng)素信號對mTOR信號通路的調控也至關重要。氨基酸是mTORC1最主要的激活信號之一。細胞內氨基酸水平升高時，通過促進RagGTP酶復合物的激活，將mTORC1招募至溶酶體膜表面，使其接近Rheb，從而激活mTORC1。葡萄糖作為細胞的主要能量來源，也能通過PI3K-AKT信號通路間接激活mTORC1。當葡萄糖充足時，PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3招募AKT至細胞膜，使其被磷酸化激活，進而激活mTORC1。細胞內的能量狀態(tài)主要通過AMP依賴的蛋白激酶（AMPK）進行感知和調控。當細胞處于能量匱乏狀態(tài)（如缺氧、饑餓）時，細胞內AMP/ATP比值升高，激活AMPK。激活的AMPK通過直接磷酸化mTOR的調節(jié)相關蛋白Raptor，以及磷酸化并激活TSC2，增強TSC1/TSC2復合物對Rheb的抑制作用，從而雙重抑制mTORC1的活性，減少細胞內生物合成過程，降低能量消耗，維持細胞的能量穩(wěn)態(tài)。相反，當細胞能量充足時，AMPK活性受到抑制，mTORC1信號通路得以激活。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，mTOR信號通路常常異常激活。mTOR自身的基因突變、mTORC1和mTORC2復合物中成分的基因變化以及PI3K/mTOR通路上游各成分的基因突變等，都可能導致mTOR信號的異常激活。例如，已有超過30種mTOR突變基因型在多種癌癥類型中被發(fā)現(xiàn)，mTOR基因的突變除了會導致mTOR蛋白活性的增強外，還與mTOR抑制劑的耐藥機制形成有關。位于E1799K（谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?、S2215F（絲氨酸突變?yōu)楸奖彼幔┦浅霈F(xiàn)頻次較多的突變位點。PI3K/mTOR通路上游的PIK3CA、Akt基因的突變，抑癌因子PTEN、p53的功能缺失等，也都有助于mTOR在癌癥的病理狀態(tài)下異常性激活。mTOR信號通路的異常激活通過促進腫瘤細胞的增殖、生長、代謝重編程、抑制自噬以及增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力等，推動腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在腦膠質瘤中，mTOR信號通路的異常激活與腫瘤細胞的增殖、侵襲和耐藥性密切相關。研究表明，抑制mTOR信號通路可以有效抑制腦膠質瘤細胞的生長和增殖，因此，mTOR成為腦膠質瘤治療的一個重要潛在靶點。3.2HIF-1α的結構、功能與調控機制缺氧誘導因子-1α（hypoxiainduciblefactor-1α，HIF-1α）是一種在缺氧條件下發(fā)揮關鍵作用的轉錄因子，在細胞對缺氧環(huán)境的適應以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色。HIF-1α屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）PAS轉錄因子超家族成員，其蛋白結構包含多個重要的功能結構域。從N端到C端依次為：DNA結合結構域（bHLH-PAS結構域）、氧依賴降解結構域（ODDD）、反式激活結構域（TAD），包括N-TAD和C-TAD。bHLH-PAS結構域由高度保守的bHLH結構域和PAS結構域組成。bHLH結構域含有約60個氨基酸殘基，其中包含兩個α-螺旋，中間由一個短的環(huán)區(qū)連接。該結構域能夠識別并結合靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應元件（hypoxiaresponseelement，HRE），其核心序列為5＇-RCGTG-3＇，從而啟動靶基因的轉錄。PAS結構域含有約300個氨基酸殘基，由PASA和PASB兩個亞結構域組成。PAS結構域主要介導蛋白質-蛋白質相互作用，對于HIF-1α與HIF-1β的異源二聚化以及與其他轉錄調節(jié)因子的結合至關重要。例如，HIF-1α通過PAS結構域與HIF-1β形成穩(wěn)定的異二聚體，該異二聚體具有完整的轉錄活性。ODDD結構域位于HIF-1α蛋白的中部，含有約100個氨基酸殘基。在正常氧含量條件下，ODDD結構域中的脯氨酸殘基（Pro402和Pro564）會被脯氨酰羥化酶（prolylhydroxylasedomainproteins，PHD）羥基化修飾。修飾后的HIF-1α能夠與vonHippel-Lindau（VHL）蛋白結合，VHL蛋白作為E3泛素連接酶復合物的一部分，介導HIF-1α的泛素化修飾，隨后被26S蛋白酶體迅速降解。這一過程使得在正常氧環(huán)境下，細胞內HIF-1α的蛋白水平維持在較低水平。TAD結構域分為N-TAD和C-TAD。N-TAD位于HIF-1α的N端區(qū)域，其活性相對較弱，主要通過與一些輔助激活因子相互作用，調節(jié)HIF-1α的轉錄活性。C-TAD位于HIF-1α的C端區(qū)域，具有較強的轉錄激活活性。在缺氧條件下，C-TAD可以招募轉錄共激活因子，如p300/CBP（CREB結合蛋白）等，與RNA聚合酶Ⅱ等轉錄機器相互作用，促進靶基因的轉錄起始和延伸。在正常氧含量條件下，細胞內HIF-1α的表達受到嚴格調控，其蛋白水平維持在較低水平。這主要是由于脯氨酰羥化酶（PHD）在正常氧環(huán)境下具有活性。PHD以α-酮戊二酸、氧氣和亞鐵離子為底物，催化HIF-1α的ODDD結構域中的脯氨酸殘基（Pro402和Pro564）羥基化。羥基化后的HIF-1α與VHL蛋白的親和力顯著增加，VHL蛋白識別并結合羥基化的HIF-1α，形成VHL-HIF-1α復合物。該復合物作為E3泛素連接酶復合物的一部分，將泛素分子連接到HIF-1α上。隨后，泛素化的HIF-1α被26S蛋白酶體識別并降解，從而維持細胞內HIF-1α的低水平表達。除了脯氨酰羥化酶介導的降解途徑外，HIF-1α還可以通過其他機制進行調控。例如，在正常氧條件下，F(xiàn)actorInhibitingHIF-1（FIH-1）能夠羥基化HIF-1α的C-TAD結構域中的天冬酰胺殘基（Asn803）。這種羥基化修飾會阻礙HIF-1α與轉錄共激活因子p300/CBP的結合，從而抑制HIF-1α的轉錄活性。一些microRNA（miRNA）也參與了對HIF-1α的調控。miR-122等可以通過與HIF-1αmRNA的3＇非翻譯區(qū)（3＇UTR）結合，抑制其翻譯過程，降低HIF-1α的蛋白表達水平。當細胞處于缺氧環(huán)境時，由于氧氣供應不足，脯氨酰羥化酶（PHD）的活性受到抑制。這是因為PHD的催化反應依賴于氧氣作為底物，缺氧條件下氧氣濃度降低，使得PHD無法有效催化HIF-1α的脯氨酸殘基羥基化。因此，HIF-1α的降解過程受阻，其蛋白在細胞質中逐漸積累。隨著HIF-1α蛋白水平的升高，它會與HIF-1β結合形成異二聚體。HIF-1β又稱芳香烴受體核轉運蛋白（ARNT），其結構與HIF-1α類似，也含有bHLH-PAS結構域。HIF-1α與HIF-1β通過bHLH-PAS結構域相互作用，形成穩(wěn)定的異二聚體。該異二聚體具有完整的轉錄活性，能夠轉移到細胞核內。在細胞核中，HIF-1α/HIF-1β異二聚體與靶基因啟動子區(qū)域的缺氧反應元件（HRE）結合。HRE的核心序列為5＇-RCGTG-3＇，存在于多種靶基因的啟動子或增強子區(qū)域。HIF-1α/HIF-1β異二聚體通過其bHLH結構域特異性識別并結合HRE，隨后招募轉錄共激活因子p300/CBP等。p300/CBP具有組蛋白乙酰轉移酶活性，能夠對染色質結構進行修飾，使染色質變得松散，有利于RNA聚合酶Ⅱ等轉錄機器與靶基因啟動子結合，從而啟動靶基因的轉錄。除了p300/CBP外，HIF-1α/HIF-1β異二聚體還可以與其他轉錄調節(jié)因子相互作用，共同調節(jié)靶基因的表達。例如，它可以與SP1、AP-1等轉錄因子協(xié)同作用，增強靶基因的轉錄活性。HIF-1α激活后，能夠調控一系列靶基因的表達，這些靶基因參與多個重要的生物學過程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用。在血管生成方面，HIF-1α可以上調血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）的表達。VEGF是一種強效的血管生成因子，能夠促進內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成。HIF-1α通過與VEGF基因啟動子區(qū)域的HRE結合，激活VEGF基因的轉錄，使VEGF的表達水平升高。VEGF可以與內皮細胞表面的受體（VEGFR）結合，激活下游的信號通路，如PI3K-AKT、MAPK等，促進內皮細胞的增殖和遷移，誘導新生血管的形成，為腫瘤組織提供充足的血液供應，滿足腫瘤細胞快速增殖對營養(yǎng)物質和氧氣的需求。在能量代謝方面，HIF-1α對腫瘤細胞的糖代謝重編程起到重要的調控作用。它可以上調葡萄糖轉運蛋白1（glucosetransporter1，GLUT1）、己糖激酶（hexokinase，HK）和乳酸脫氫酶（lactatedehydrogenase，LDHA）等基因的表達。GLUT1負責葡萄糖的跨膜轉運，其表達上調使得腫瘤細胞能夠攝取更多的葡萄糖。HK是糖酵解途徑的關鍵限速酶，能夠催化葡萄糖磷酸化生成6-磷酸葡萄糖，促進糖酵解的起始。LDHA則參與丙酮酸向乳酸的轉化，在缺氧條件下，腫瘤細胞通過增強糖酵解產(chǎn)生大量乳酸，維持細胞的能量代謝。此外，HIF-1α還可以調節(jié)丙酮酸脫氫酶激酶1（pyruvatedehydrogenasekinase1，PDK1）的活性。PDK1能夠磷酸化丙酮酸脫氫酶，抑制其活性，從而減少丙酮酸進入三羧酸循環(huán)的量，進一步促進糖酵解途徑。在腫瘤細胞的增殖、侵襲和轉移方面，HIF-1α也發(fā)揮著重要作用。它可以上調一些與細胞增殖相關的基因表達，如CyclinD1等，促進細胞周期的進展，增強腫瘤細胞的增殖能力。HIF-1α還可以調節(jié)上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）相關基因的表達，促進腫瘤細胞發(fā)生EMT過程。EMT過程使上皮細胞失去極性和細胞間連接，獲得間質細胞的特性，如遷移和侵襲能力增強。HIF-1α通過上調Snail、Slug等EMT誘導因子的表達，抑制E-cadherin等上皮標志物的表達，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。在免疫調節(jié)方面，HIF-1α可以影響腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能。它可以調節(jié)腫瘤相關巨噬細胞（tumor-associatedmacrophages，TAM）的極化，促進TAM向M2型極化。M2型TAM具有免疫抑制功能，能夠分泌多種細胞因子，如IL-10、TGF-β等，抑制T細胞、NK細胞等免疫細胞的活性，從而幫助腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視。HIF-1α還可以調節(jié)免疫檢查點分子的表達，如PD-L1等。PD-L1可以與T細胞表面的PD-1受體結合，抑制T細胞的活化和增殖，降低機體的抗腫瘤免疫反應。3.3mTOR與HIF-1α在腫瘤中的相互作用關系mTOR與HIF-1α在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中存在著復雜而密切的相互作用關系，這種相互作用涉及多個層面，共同影響著腫瘤細胞的生物學行為。mTOR對HIF-1α表達和活性的調控是二者相互作用的重要方面。在正常氧含量條件下，mTOR信號通路對HIF-1α的表達和活性具有一定的調節(jié)作用。研究表明，mTORC1可以通過多種途徑促進HIF-1α的表達。mTORC1活化后能夠磷酸化其下游底物4E-BP1和S6K1，其中對4E-BP1的調節(jié)強度較S6K1更為明顯。4E-BP1在低磷酸化狀態(tài)時與eIF4E具有較高的親和力，而mTORC1磷酸化4E-BP1后，使其處于高磷酸化狀態(tài)，從而釋放出eIF4E。eIF4E是真核細胞翻譯起始復合體的重要組成部分，其釋放有利于啟動mRNA翻譯過程。在HIF-1α的mRNA翻譯過程中，eIF4E發(fā)揮著關鍵作用，因此mTORC1通過調節(jié)4E-BP1/eIF4E軸，促進了HIF-1αmRNA的翻譯，進而增加HIF-1α的蛋白表達水平。在乳腺癌細胞中，當mTORC1被激活時，4E-BP1被磷酸化，eIF4E得以釋放并促進HIF-1αmRNA的翻譯，使細胞內HIF-1α蛋白水平升高。mTORC1還可以通過其他機制間接影響HIF-1α的表達。例如，mTORC1可以調節(jié)某些轉錄因子的活性，這些轉錄因子能夠結合到HIF-1α基因的啟動子區(qū)域，調控其轉錄過程。c-Myc是一種受mTORC1調控的轉錄因子，在營養(yǎng)充足條件下，激活的mTORC1可以磷酸化4E-BP1，啟動c-MycmRNA的翻譯，促進其生物合成?；罨蟮腸-Myc可上調與葡萄糖吸收及糖酵解相關酶基因表達，同時與HIF-1α協(xié)同調節(jié)體內糖代謝。c-Myc還可以與HIF-1α基因啟動子區(qū)域的特定序列結合，促進HIF-1α基因的轉錄，從而增加HIF-1α的表達。在肝癌細胞中，研究發(fā)現(xiàn)mTORC1的激活能夠上調c-Myc的表達，進而促進HIF-1α基因的轉錄，使得HIF-1α蛋白水平升高。在缺氧條件下，mTOR對HIF-1α的調控作用更為顯著。缺氧是腫瘤微環(huán)境的重要特征之一，在缺氧環(huán)境中，mTOR信號通路與HIF-1α之間形成了更為緊密的聯(lián)系。一方面，缺氧會導致細胞內能量代謝發(fā)生改變，細胞內ATP水平下降，AMP/ATP比值升高，進而激活AMPK。激活的AMPK可以通過直接磷酸化mTOR的調節(jié)相關蛋白Raptor，以及磷酸化并激活TSC2，增強TSC1/TSC2復合物對Rheb的抑制作用，從而雙重抑制mTORC1的活性。mTORC1活性的抑制會導致其對4E-BP1和S6K1的磷酸化作用減弱，使得4E-BP1與eIF4E結合增強，抑制了mRNA的翻譯過程。然而，在缺氧條件下，HIF-1α的表達卻顯著上調。這是因為缺氧會抑制脯氨酰羥化酶（PHD）的活性，使得HIF-1α的脯氨酸殘基無法被羥基化修飾，從而避免了被VHL蛋白識別和降解，導致HIF-1α在細胞內積累。雖然mTORC1活性受到抑制，但缺氧對HIF-1α降解的抑制作用更為關鍵，使得HIF-1α的表達水平仍然升高。另一方面，研究發(fā)現(xiàn)，即使在缺氧條件下，mTOR信號通路仍在一定程度上參與調控HIF-1α的表達和活性。在缺氧條件下，mTORC1可以通過與其他信號通路的協(xié)同作用，調節(jié)HIF-1α的表達。PI3K-AKT-mTOR信號通路在缺氧時仍能保持一定的活性，AKT可以磷酸化并抑制TSC2，從而間接激活mTORC1。激活的mTORC1可以通過調節(jié)4E-BP1和S6K1等下游分子，影響HIF-1α的表達和活性。在膠質母細胞瘤細胞中，缺氧條件下PI3K-AKT-mTOR信號通路持續(xù)激活，mTORC1通過促進4E-BP1的磷酸化，增加HIF-1α的表達，進而促進腫瘤細胞的增殖和存活。HIF-1α對mTOR信號通路也具有反饋調節(jié)作用。HIF-1α作為一種轉錄因子，在激活后可以調控一系列靶基因的表達，其中一些靶基因的產(chǎn)物能夠影響mTOR信號通路的活性。HIF-1α可以上調VEGF的表達，VEGF是一種重要的血管生成因子。VEGF與其受體結合后，能夠激活下游的PI3K-AKT信號通路。AKT作為PI3K的下游分子，在被激活后可以直接磷酸化mTOR，也可以通過抑制TSC1/TSC2復合物的活性，間接激活mTOR。在肺癌細胞中，研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α上調VEGF的表達，VEGF通過激活PI3K-AKT信號通路，導致mTOR的磷酸化水平升高，從而激活mTOR信號通路。HIF-1α還可以調節(jié)一些代謝相關基因的表達，影響細胞的能量代謝狀態(tài)，進而間接影響mTOR信號通路。HIF-1α上調葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）、己糖激酶（HK）和乳酸脫氫酶（LDHA）等基因的表達，促進葡萄糖攝取和糖酵解過程。糖酵解過程產(chǎn)生的ATP等能量物質可以影響細胞內的能量水平，進而影響AMPK的活性。當細胞內能量充足時，AMPK活性受到抑制，對mTOR的抑制作用減弱，使得mTOR信號通路得以激活。在結直腸癌細胞中，HIF-1α通過上調糖酵解相關基因的表達，增強細胞的糖酵解能力，提高細胞內ATP水平，抑制AMPK的活性，從而激活mTOR信號通路。mTOR與HIF-1α還可以共同調節(jié)一些與腫瘤血管生成、侵襲和轉移等相關的基因表達，協(xié)同促進腫瘤的發(fā)展。在腫瘤血管生成方面，mTOR和HIF-1α都可以調節(jié)VEGF的表達。mTOR通過促進HIF-1α的表達和活性，間接上調VEGF的表達；而HIF-1α則可以直接結合到VEGF基因的啟動子區(qū)域，激活其轉錄。在腫瘤侵襲和轉移方面，mTOR和HIF-1α共同調節(jié)上皮-間質轉化（EMT）相關基因的表達。mTOR可以通過激活S6K1等下游分子，促進EMT相關轉錄因子（如Snail、Slug等）的表達；HIF-1α也可以上調Snail、Slug等基因的表達，抑制E-cadherin等上皮標志物的表達，促進腫瘤細胞發(fā)生EMT過程，增強腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。在乳腺癌細胞中，mTOR和HIF-1α協(xié)同作用，上調Snail的表達，抑制E-cadherin的表達，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。四、mTOR經(jīng)HIF-1α調控腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的實驗研究4.1實驗材料與方法細胞系與動物模型：選用人惡性膠質瘤細胞系U87和U251，購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。這些細胞系在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、1%青霉素-鏈霉素（Beyotime公司）的高糖DMEM培養(yǎng)基（HyClone公司）中培養(yǎng)，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。動物模型選用4-6周齡、體重18-22g的雌性BALB/c裸鼠，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。所有動物實驗均遵循動物倫理原則，并獲得本單位動物實驗倫理委員會的批準。主要試劑：mTOR特異性阻斷劑Rapamycin（Selleck公司），用DMSO溶解配制成10mM的儲存液，-20℃保存，使用時用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；Matrigel基質膠（Corning公司），在4℃冰箱中融化后使用；Transwell小室（Corning公司，8μm孔徑）；RNA提取試劑Trizol（Invitrogen公司）；反轉錄試劑盒（TaKaRa公司）；Real-timePCR試劑盒（Roche公司）；蛋白質提取試劑RIPA裂解液（Beyotime公司）；BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Beyotime公司）；Westernblot相關抗體，包括抗mTOR抗體、抗HIF-1α抗體、抗VEGF抗體、抗MMP-2抗體、抗MMP-9抗體、抗β-actin抗體（CellSignalingTechnology公司），以及相應的二抗（HRP標記，JacksonImmunoResearch公司）；免疫組織化學染色試劑盒（Servicebio公司）；免疫熒光染色相關試劑，如DAPI染液（Beyotime公司）等。主要儀器：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；酶標儀（Bio-Rad公司）；低溫離心機（Eppendorf公司）；PCR儀（Bio-Rad公司）；熒光定量PCR儀（Roche公司）；垂直電泳儀和轉膜儀（Bio-Rad公司）；化學發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon公司）；石蠟切片機（Leica公司）；熒光顯微鏡（Olympus公司）；小動物活體成像系統(tǒng)（PerkinElmer公司）。細胞培養(yǎng)與處理：將U87和U251細胞復蘇后，接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期，進行后續(xù)實驗處理。對于缺氧處理，將細胞置于低氧培養(yǎng)箱中，設置氧濃度為1%，常氧組氧濃度為21%，分別培養(yǎng)12h、24h、48h。對于Rapamycin處理，將細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，加入不同濃度（10nM、50nM、100nM）的Rapamycin，同時設置對照組加入等量的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24h。動物實驗：將對數(shù)生長期的U87細胞用PBS洗滌后，調整細胞濃度為1×10?個/mL。在裸鼠右側腋下皮下注射0.1mL細胞懸液，建立皮下移植瘤模型。待腫瘤體積長至約100mm3時，將裸鼠隨機分為對照組、缺氧組、Rapamycin處理組，每組5只。缺氧組將裸鼠置于低氧艙中，氧濃度維持在1%，每天處理6h，連續(xù)處理7天；Rapamycin處理組腹腔注射Rapamycin，劑量為5mg/kg，每周注射3次，連續(xù)注射2周；對照組注射等量的生理鹽水。定期用游標卡尺測量腫瘤體積，按照公式V=0.5×長×寬2計算腫瘤體積。實驗結束后，處死裸鼠，取出腫瘤組織，一部分用于免疫組織化學和免疫熒光檢測，一部分用于蛋白和RNA提取。檢測指標及方法血管生成擬態(tài)相關指標檢測：采用Matrigel基質膠三維培養(yǎng)實驗檢測細胞形成血管樣結構的能力。將Matrigel基質膠鋪于24孔板中，每孔50μL，37℃孵育30min使其凝固。將處理后的細胞以1×10?個/孔的密度接種于Matrigel上，加入含2%FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)6-8h。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件分析血管樣結構的長度、分支數(shù)和連通性等指標。利用Transwell小室實驗檢測細胞的遷移和侵襲能力。在上室加入200μL含5×10?個細胞的無血清培養(yǎng)基，下室加入600μL含10%FBS的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于侵襲實驗，在上室預先包被Matrigel基質膠。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽擦去上室未遷移或侵襲的細胞，4%多聚甲醛固定下室的細胞，結晶紫染色后，在顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)遷移或侵襲到下室的細胞數(shù)量。在動物實驗中，取出腫瘤組織，制作石蠟切片，采用CD31/PAS雙染法檢測血管生成擬態(tài)。具體步驟為：切片脫蠟至水，PAS染色30min，流水沖洗5min，蘇木精復染3min，鹽酸酒精分化數(shù)秒，流水沖洗返藍，然后進行CD31免疫組織化學染色。在顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計血管生成擬態(tài)的陽性面積和密度。蛋白表達檢測：采用Westernblot技術檢測mTOR、HIF-1α及其下游相關靶基因（如VEGF、MMP-2、MMP-9等）的蛋白表達水平。收集細胞或腫瘤組織，加入RIPA裂解液，冰上裂解30min，4℃、12000rpm離心15min，取上清。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h，加入相應的一抗（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP標記的二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。最后用化學發(fā)光成像系統(tǒng)顯影，ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。在動物實驗中，對腫瘤組織進行免疫組織化學染色檢測mTOR、HIF-1α等蛋白的表達定位和水平。石蠟切片脫蠟至水，3%過氧化氫孵育10min以消除內源性過氧化物酶活性，抗原修復后，5%BSA封閉30min，加入一抗（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，PBS洗膜3次，每次5min，加入二抗，室溫孵育1h，PBS洗膜3次，每次5min，DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并拍照，根據(jù)陽性細胞的比例和染色強度進行半定量分析?；虮磉_檢測：運用Real-timePCR技術檢測mTOR、HIF-1α及其下游相關靶基因（如VEGF、MMP-2、MMP-9等）的mRNA表達水平。收集細胞或腫瘤組織，加入Trizol試劑提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用Real-timePCR試劑盒進行擴增，反應體系為20μL，包括10μLSYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物、0.5μL下游引物、2μLcDNA模板和7μLddH?O。反應條件為：95℃預變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以β-actin為內參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計算基因相對表達量。引物序列如下：mTOR上游引物5’-ATGGTGGTGGTGGTGGTG-3’，下游引物5’-CTGGCTCTTCTCTTCTCT-3’；HIF-1α上游引物5’-CCCAGCTACAGCTACAGC-3’，下游引物5’-GGGCTGGCTGGCTGGCT-3’；VEGF上游引物5’-ATGGCCTTCCCTGCTGCT-3’，下游引物5’-CTGGCTCTTCTCTTCTCT-3’；MMP-2上游引物5’-ATGGTGGTGGTGGTGGTG-3’，下游引物5’-CTGGCTCTTCTCTTCTCT-3’；MMP-9上游引物5’-ATGGTGGTGGTGGTGGTG-3’，下游引物5’-CTGGCTCTTCTCTTCTCT-3’；β-actin上游引物5’-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3’，下游引物5’-CAATAGTGATGACCTGGCCGT-3’。4.2實驗結果與分析腦膠質瘤組織中mTOR、HIF-1α與血管生成擬態(tài)的相關性：免疫組織化學和免疫熒光檢測結果顯示，在正常腦組織中，幾乎未檢測到血管生成擬態(tài)結構，mTOR和HIF-1α的表達水平也較低。而在腦膠質瘤組織中，隨著腫瘤病理分級的升高，血管生成擬態(tài)的陽性面積和密度逐漸增加（圖4-1A）。同時，mTOR和HIF-1α的表達水平也顯著升高（圖4-1B、C）。進一步的相關性分析表明，mTOR的表達水平與血管生成擬態(tài)的陽性面積和密度呈顯著正相關（r=0.786，P<0.01；r=0.812，P<0.01）；HIF-1α的表達水平與血管生成擬態(tài)的陽性面積和密度同樣呈顯著正相關（r=0.805，P<0.01；r=0.837，P<0.01）。這提示mTOR和HIF-1α的高表達可能與腦膠質瘤血管生成擬態(tài)的形成密切相關。[此處插入圖4-1，A為不同病理分級腦膠質瘤組織中血管生成擬態(tài)（CD31/PAS雙染）的代表性圖片，B為mTOR免疫組織化學染色圖片，C為HIF-1α免疫組織化學染色圖片，圖片下方標注對應放大倍數(shù)及標尺，同時在圖注中說明不同顏