15DetectionofPseudomonpsaeruginosainanimalbedding2021-01-25發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定I動(dòng)物墊料中綠膿桿菌檢測GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格GB/T33682基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒別微生物方SN/T1538.1培養(yǎng)基制備指南第1部分：實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基制SN/T1538.2培養(yǎng)基制備指南第2部分：培養(yǎng)基性能用于吸收動(dòng)物排泄物，使動(dòng)物保持舒適生活環(huán)境4設(shè)備和材料4.1冰箱：2℃~5℃。4.2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)。4.3飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。4.4二級(jí)生物安全柜。4.8高壓滅菌器。4.9無菌量筒：250mL。4.10無菌試管：18mm×180mm。14.13無菌接種針、接種環(huán)。4.14光學(xué)顯微鏡。4.15無菌培養(yǎng)皿：15mm×904.16無菌試管：18mm×180mm。4.20無菌勺。4.21無菌載玻片。5.12革蘭氏陰性菌生化鑒定卡。5.13飛行時(shí)間質(zhì)譜儀靶板。5.14綠膿桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853，或等2423應(yīng)遵循隨機(jī)性、代表性的原則。取樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來對(duì)送檢樣品包裝內(nèi)不同部位樣品進(jìn)行隨機(jī)多點(diǎn)取樣至少250g，充分混勻后無菌稱取25g顆粒狀或粉末狀墊料樣品，加入225mLSCDLP，充分振搖或均質(zhì)無菌操作將滅菌規(guī)格板（5cmí5cm）放在平面墊料表面，用浸有無菌稀釋液（磷酸緩沖液或生理鹽水）的棉拭子，在規(guī)格板內(nèi)來回均勻涂抹整個(gè)方格3次，并隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子，然后用滅菌剪刀剪去棉拭子與手接觸的部分，將棉拭子頭置入裝有25mL無菌稀釋液的無菌錐形瓶中，根據(jù)樣品面積大小1234±2h，觀察菌落形態(tài)。綠膿桿菌在這兩種平板上通常呈現(xiàn)圓形、平滑、濕潤的黃綠色菌落，在紫外光挑取營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，綠膿桿菌為革蘭氏陰性桿4挑取營養(yǎng)瓊脂平板上的純培養(yǎng)物，進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)加入三氯甲烷3mL～5mL,充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于三氯甲烷液內(nèi),待液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時(shí)判為陽性,表示被檢樣品中有綠膿菌素存在。若結(jié)果為陰性，則繼續(xù)進(jìn)行硝2℃~8℃冰箱10min～30min，仍呈溶液狀為明膠液化試驗(yàn)陽性，凝固不溶為陰性。綠膿桿菌生化特征見表2?；蚩捎蒙b定試劑盒進(jìn)行綠膿桿菌生化鑒定++/-+++可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況，選用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定系統(tǒng)或飛行時(shí)間質(zhì)譜儀等進(jìn)行鑒定，具體操作依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)5綜合生化鑒定結(jié)果和輔助鑒定結(jié)果，報(bào)告25g（cm2）動(dòng)物墊料樣品中檢出或未9生物安全措施檢測過程中的廢棄物需經(jīng)121℃高壓滅菌處理至少306A.1培養(yǎng)基制備及質(zhì)量保證A.2.1成分A.2.2制法將上述各成分加熱煮沸至完全溶解，調(diào)節(jié)pH至7.2～7.3，分裝適宜容器，121℃高壓滅菌20mA.3.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.3.1.1成分十六烷三甲基溴化胺0.A.3.1.2制法A.3.2CFC添加劑A.3.2.1成分十六烷三甲基溴化胺7A.3.2.2制法取無菌水和無水乙醇各1mL混合均勻，將上述成分溶解于混合A.3.3使用方法待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，每500mA.4.1基礎(chǔ)培養(yǎng)基A.4.1.1成分A.4.1.2制法A.4.2.1成分十六烷三甲基溴化胺1A.4.2.2制法取無菌水和無水乙醇各1mL混合均勻，將上述成分溶解于混合A.4.3使用方法待基礎(chǔ)培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，500A.5氧化酶試驗(yàn)A.5.1試劑A.5.2試驗(yàn)方法8取白色潔凈濾紙沾取菌落，加鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液1滴，陽性結(jié)果呈現(xiàn)粉紅色，并逐漸加再加a-萘酚乙醇溶液1滴，陽性結(jié)果在0.5min內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色，陰性結(jié)果2min內(nèi)不變色?；蛴妹?xì)管吸A.6革蘭氏染液A.6.1染液制備A.6.1.1結(jié)晶紫染色液A.6.1.2革蘭氏碘液將碘與碘化鉀先進(jìn)行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300A.6.1.3脫色液A.6.1.4復(fù)染液A.6.1.4.1沙黃復(fù)染液A.6.1.4.2石碳酸復(fù)紅工作液稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95%乙醇100mL放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL，加5%石碳酸水溶液90mL混合，即為石碳酸復(fù)紅原液。再取此液10mA.6.2染色法A.7綠膿菌素測定培養(yǎng)基A.7.1成分9A.7.2制法將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱使其溶解，調(diào)節(jié)pH至7.4，加入瓊?cè)芙猓盅b于試管內(nèi)，115℃高壓滅菌20mA.8硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基A.8.1成分A.8.2制法將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶解，調(diào)pH為7.2，煮沸過濾后補(bǔ)足液量，鉀和亞硝酸鈉，