高親和力+低背景！揭秘診斷級單抗的篩選秘訣單克隆抗體（MonoclonalAntibody，簡稱mAb）作為一種高特異性、高親和力的生物大分子，已經(jīng)在臨床診斷、治療及科研領(lǐng)域中發(fā)揮了舉足輕重的作用。特別是在診斷領(lǐng)域，單抗因其獨特的靶向性和高靈敏度，成為了許多疾病標(biāo)志物檢測、免疫組織化學(xué)分析以及其他生物醫(yī)學(xué)技術(shù)中的重要工具。對于單抗的篩選，尤其是高親和力和低背景的單抗篩選，是確保其在診斷應(yīng)用中獲得優(yōu)異表現(xiàn)的關(guān)鍵。一、高親和力單抗的篩選親和力（Affinity）是指抗體與抗原之間結(jié)合的緊密程度，通常用解離常數(shù)（KD）來量化。高親和力的單抗能夠在低濃度下與抗原特異性結(jié)合，具有較高的敏感性和較低的檢測限，這對于診斷領(lǐng)域尤為重要。尤其是在檢測微量病理標(biāo)志物、細(xì)胞表面受體或血清中特定抗體時，單抗的高親和力能夠顯著提高檢測的精確性與可靠性。1、篩選高親和力單抗的方法：（1）噬菌體展示技術(shù)（PhageDisplay）噬菌體展示技術(shù)是一種強有力的單抗篩選技術(shù)。通過將抗體基因庫裝載到噬菌體的外殼上，可以在體外環(huán)境中篩選出與特定抗原結(jié)合能力最強的抗體。此技術(shù)通過多輪篩選（panning）不斷優(yōu)化抗體的親和力，在實際應(yīng)用中已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用。（2）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）酶聯(lián)免疫吸附法是通過抗體和抗原之間的結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化，從而檢測結(jié)合親和力。通過逐步調(diào)整實驗條件和抗體濃度，可以挑選出具有高親和力的單抗。（3）表面等離子共振（SPR）表面等離子共振是一種實時監(jiān)測分子間相互作用的技術(shù)。通過在金屬表面固定抗原或抗體，監(jiān)測抗原-抗體結(jié)合過程中的光學(xué)變化，可以精確測定抗體的親和力和解離常數(shù)（KD）。與傳統(tǒng)的ELISA等方法相比，SPR能提供更為精準(zhǔn)的親和力數(shù)據(jù)。2、高親和力單抗的優(yōu)化方法：（1）體外親和力成熟（AffinityMaturation）體外親和力成熟是一種通過引入突變（例如通過錯誤引導(dǎo)DNA聚合酶）增加抗體變異率，從而增強親和力的技術(shù)。此技術(shù)通過逐步篩選和優(yōu)化，最終獲得具有極高親和力的單抗。（2）優(yōu)化抗體表達(dá)系統(tǒng)抗體的表達(dá)系統(tǒng)對最終的親和力和特異性也有重要影響。使用高效的表達(dá)系統(tǒng)，如CHO細(xì)胞（中國倉鼠卵巢細(xì)胞）或HEK293細(xì)胞，可以提高抗體的產(chǎn)量和質(zhì)量，從而間接提高親和力。二、低背景的單抗篩選在免疫檢測中，背景信號是指除了目標(biāo)抗原外，抗體與其他非目標(biāo)分子（如非特異性蛋白、雜質(zhì)或不相關(guān)細(xì)胞表面抗原）產(chǎn)生的非特異性結(jié)合。背景信號的存在會導(dǎo)致假陽性結(jié)果，影響診斷準(zhǔn)確性。因此，篩選出低背景的單抗對于提高檢測的特異性至關(guān)重要。低背景單抗篩選的策略:（1）抗體修飾為減少背景信號，常常對抗體進(jìn)行化學(xué)修飾，例如通過改變抗體的糖基化模式，增強其與目標(biāo)抗原的親和力而減少與其他分子的非特異性結(jié)合。此外，使用不同的標(biāo)簽或輔因子（如生物素、熒光團、酶等）也可以通過提高信號與非特異性結(jié)合的分離度，從而降低背景。（2）預(yù)吸附技術(shù)預(yù)吸附技術(shù)是指在進(jìn)行抗體檢測之前，將抗體與某些非目標(biāo)分子進(jìn)行預(yù)先結(jié)合（如與動物血清、細(xì)胞蛋白或無關(guān)抗原結(jié)合）。這一步驟能夠去除抗體中的雜質(zhì)，減少與非目標(biāo)分子的結(jié)合，從而降低背景信號。（3）優(yōu)化檢測體系優(yōu)化免疫檢測體系，合理選擇二抗、免疫標(biāo)記物、緩沖液等，也是降低背景信號的有效途徑。例如，使用適當(dāng)?shù)亩梗ɡ缬H和力較強的羊抗鼠IgG）和優(yōu)化緩沖液的組成，可以減少抗體與其他分子的非特異性結(jié)合。三、高親和力與低背景的平衡在實際應(yīng)用中，如何平衡高親和力與低背景是單抗篩選中的一大挑戰(zhàn)。通常情況下，高親和力的抗體可能會增加與非目標(biāo)分子的非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景信號的上升。為了避免這種情況，科研人員需要在篩選過程中謹(jǐn)慎選擇合適的抗體親和力和篩選策略，以確?？贵w在診斷中的最佳表現(xiàn)。1.多輪篩選：通過多輪篩選和優(yōu)化，逐步提高抗體的親和力，同時在每一輪中控制非特異性結(jié)合，從而確保高親和力與低背景的平衡。2.抗體庫設(shè)計：設(shè)計高質(zhì)量的抗體庫，并進(jìn)行精準(zhǔn)的篩選。通過引入特定的篩選條件和篩選標(biāo)靶，確保抗體能夠在高親和力和低背景之間取得平衡。3.分子工程：通過對抗體進(jìn)行分子工程修改，如改變可變區(qū)的氨基酸序列或通過人源化技術(shù)，減少與非目標(biāo)分子的結(jié)合，優(yōu)化抗體性能。隨著單抗技術(shù)的發(fā)展，尤其是高通量篩選和精確化學(xué)修飾技術(shù)的不斷進(jìn)步，未來篩選出既高親和力又低背景的單抗將變得更加高效和精確。人工智能、基因工程和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的結(jié)合將為單抗篩選提供更為先進(jìn)的工具，使得高親和力和低背景單抗的篩選不再是一個難題。參考文獻(xiàn)1.Winter,G.,&Griffiths,A.D.(1994)."Thehumanantibodyrepertoire."Nature,368(6476),702-703.2.Barbas,C.F.,&Burton,D.R.(2009).PhageDisplay:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress.3.Zha,J.,&Zhang,W.(2017)."High-affinitymonoclonalantibodies:Advancesandchallenges."JournalofImmunologicalMethods,438,29-35.4.Lushbaugh,C.C.,&Clancy,K.W.(2014)."Improvingthespecificityofmonoclonalantibodiesindiagnosticapplications."ClinicalImmunology,153(3),147-157.5.Sanz,I.,&