152024-06-14發(fā)布本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。ISNP標(biāo)記法鑒定油莎豆種質(zhì)資源、品種和純度技術(shù)規(guī)程GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程扦樣GB/T3543.4農(nóng)作物種子檢驗(yàn)規(guī)程3.1SNP標(biāo)記singlenucleotidepo3.23.3品種在DNA分子標(biāo)記基因分型方面一致的程度，用供檢樣品中本品種1從樣品中隨機(jī)抽取10粒塊莖發(fā)苗。分單株剪取0.1g幼苗葉片用液氮研磨成粉末。將研磨粉末轉(zhuǎn)入2mL離心管，加入0.7mLCTAB提取緩沖液充分混勻。在55℃~65℃恒浴1h。加入0.7mL氯仿：異戊醇（24:1），上下輕搖5min。10000×g，室溫下離心10min。取上清液，加入上清液三分之冷異丙醇，上下輕搖5min，-20℃冰箱放置30min。10000×g，4℃離心10min。注：以上為推薦用于種質(zhì)資源和品種鑒定的DNA提取方法，其他能夠達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的DNA提取方法都適用于按照GB/T3543.4規(guī)定的方法，從送檢樣品中提取不少于100粒塊莖發(fā)苗。提取方法同4.1.2。4.2PCR擴(kuò)增72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃10m4.3基因分型檢測(cè)采用一代測(cè)序（Sanger測(cè)序），對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)4,4數(shù)據(jù)分析與判定根據(jù)樣品在73個(gè)SNP位點(diǎn)基因型的差異進(jìn)行品種鑒定，具體判定標(biāo)——差異位點(diǎn)數(shù)≥3，判定為不同品種；——差異位點(diǎn)數(shù)=0，判定為極近似或相同品種。對(duì)利用附錄A中73組引物仍未檢測(cè)到≥3個(gè)差異位點(diǎn)數(shù)的樣品，必要時(shí)可增加篩選引物進(jìn)2品種純度計(jì)算公式：品種純度%=（供檢種子粒數(shù)3AACATGTCCCGGACTTTGCTAACTGCAGATGGGAGCATTAGAATCATTCCACAACTGGACTTTGACCAAATCCACAAAAGCTGAGTCCAATTGGGAGTTTGTTGAAATCAAGTGAGCAAGGCTACATCGTCCTCGTCGTAGATCAGTGAGAGAACTTTGCCTTACCATTAACATCTCGATCAGGGGTAGATGGTGAATTTAGATGCCGACCATACACAACATCATTGCAAGCAGAAACCGCTGAGAACTGGTACACAGAAAGAGCTCCCAGAAGCAAAAGGAAAACAGCCATCTGCAGACCCAATACCATTACGCAGAAGAAATGGGTCTAGCAGAAACCAATGGATGGATGAGGAAAGAACAAGCACAATCATCCGACCTCTAGTCCAGCGTTTATTATGCTCACTTCAATATGCGGTGAGGAT4AGATCATGGCAGAGTGGCTTTAACCGGACTAAAATAAGGGCAGGGAAGGAAAGAGTGAACATTTGTTCTTTACTCAGGCCTATGAACACTACGCATTGTGCAATTAGGGAGGAAGCCTGTCAAAGAGTCGGTGGTCTCTCTCTCAAATGTAAGCTTTTGACAAACCAGATATCCCTGACTCGTTCACATGCATGCAGAAGATGATGAGAGGAAATGCAGCTTTGCTATGATCATATTGTGATGGCAGCTGCAGGAGGAAACGTGATGACATTAACACCTCCAAGAGATCCACTTCAGTCGATAAAACAAGAGCATGGGGAATGTATCTGCACAA5AATCCAAATCTACTGCAGCGAAACTGTGATTCGATCTGTCACAATCCAAATCTACTGCAGCGAAAGAACTGTGATTCGATCTGTCACATGGGGAATGTATCTGCACAAAATAACCCATCCGAACCTAGCATTATTAGGGTTGTTGCTTGCTGGATACCACCATTGGAACCATACATCCTGAGGAATGGTTCTGACACTGAAGTGCCTCCAAACACTAAGCCAAATAGTGCTCGATCTGAAGGTTGAGAGACGTTTGAACAGTGGAGAGCGCCTTTTTATA6TCAATGTTATTTTCTGATATGTTCTCGGGCTAGTGAAACTTATGCAACGGTGGACCTAACTACATGATATATT[T/C]AGATAAGGGTTAAGCTAATTGAACCCCAAACTTTCCCCGGACTTGTACCCCGCAAAATTTCCATAATTCTCCAAAAAAGAAATTGTGCAAAGATCAATAATTTTATTTGAAATTAAGCATTTCGCTAAAAAAAAAA[A/T]ACAAATAATTTTTTTTTTTTGATTCATTGTGCTAATTATATATACTTCCAGAAAATAACACCACGAGTATCTAAACAGCTCGGAGGCTACACAGAAAAGCCGGCTAAATCTGTTTCCATGGAGAGATACAACA[G/A]ATCTTTAGCCAAGGTACTTACTTTCTTTTGTATAAACAACACTCGGATCATTGAAGTGAATCTACATAAATA8TCTATGTGCTGCAGTAAACTGAAATCTGGGACCCAGTCAAATACTCAATACAGACTGAGAATGTAACAA[T/C]TAGATCTGATTGTGTAAAATTGATCTGAGTTTGTACTATAGATGCTATGGACAGATATTCTATGGAAGCATCTGATCGTACGATATACTTGAAATTTAGAGAACGTGGTAACTCTGGGATAGCACATCAGCTTCC[A/G]TAATATTTAGTTCTCTAAGACCAAGGAGACTGTAGCCGGTAATGACTTTAGAGATTTTGCATTTTG8TCCAATTGAAGCCATCGCTGGTCGAGGCATTTACTATGCTATTCGCTGACCGGAAGGCTCTGCAAAGTG[T/C]GCCACTGGAGATGGAGATAACTCGGAAGATCGTTGTGAATTGAGGTTCATTTGTGCCTGAGCAGTTGTCATCCCTCCATATCCTCTGCAGCGCTGCACTGTGTAGGGCGAAATTTGAACTCATCTTGAGATCTGT[G/T]CTTGCTCAATCTTGAGATGATCTAACGGTTCACGCGCTACACAGTGCAGCGCTACAGAGGATGAG2TGAAATTTTAAGCTTCATCAGAAATTATTGTACCCCCTGGTCATGAGTCTAGCTAGCGTTCCTGCAAACATGT[T/G]AGCCAAAAAATGTTAACCCATGATCAATATATGCAGATCTAATTTTAGTTTTGCCGGTAAACGTAGAT2CTGTGAAGGAACTGCAGGATGAGAAGAATTAAGCAGCCAGATGGTATAAACGTACTGGCCAGACTTGAAACAG[C/T]GCTCACCCCATATGCAAATTAAACACCATTATTTGATATTGATTTTTCTGGACTTCTCATTCAAA5GTTCCACCTTATCTGCATTTGTCAGGTCATTGAATTTTTCCTCGAATGCTGAGGAAACGACTCGGGCTG[G/T]AAGAATTTTAGCAGGCTGAACATCTCGCCAAGGTTGTTCTGCAGGGGTGTCCCCGTCAATAAAACCCGC0GGCAGGGGATTAGGAAACTCGACGAATGGGTATTCGATTGGACTATTGGTATGAATGAGCAACACATT[G/GGA]GAAAGAAGAATATTCATACACTGCAAATCTAGAGTTCACACTTGATAGTTGATACAGATGTAAAA73TCCCCGCGGCTAGTTTGCAGCGCCAAGGTGCCCGTCCTTCACCATACACAACAAAGCAAGCTCCTTGCA[T/C]GACGTCCACCTCTAGGATCCCAGCAACGCACATCGTTGCTCCGCAAAGCAGTCCCTGCCACCTCGTCAAGTGATGCCAGTATAGGAACAGTATGTTCCATGAATACAAGTGATTCGTTTTGTTGTTATCTGCATTGTAA[C/A]GAAGGCGTTCTTAATTAGTAATTCTCGTATAAGAATATAATTACAAAAATTAAGATTTGTGAAAC3AGTGCGAGATGTACTCTTGCGTGCACTCCTCTGACATGCCACAGCAGGTGCACCCTCCACTTCTGATAT[A/G]GAGCTGAGTTTTGTCGACTCCTTCGCCTCCTTGCTCAAAAGAGAGGTCGGAAAGAGCCCGATGACTGAGAAGAGTTTAACGGTAGATTTACGCACCGCTGTTCAATGGTCAAGGTGCTGATTGAGCGGAGAGG[C/T]GGTGAGCTCACCGAGGCTCTTCAGAGAACCCCGACTGGAATTCTCAAGAAGCGCAGGGCACTATT1TCTTCAGGCAGCTGACACAGTCCCAAATCGACTACATGAATGACATCAGGAGCTGATCTACAACTACTG[T/C]TATGACACCAAGAGATTCAACGGCGCCATGAGTGCTACCTCCCTGCTTACTGATAAAGGCATGGT2CTTTATACCCTTTACAGCTTGTTCCTAATTAAATGAACTTTACCGATTCGATATCTATTCGTCTCTTAG[C/T]TGTCCCCAATTACAACCTTCCCTCTCCCCAATTTCTTTTATCTATATTATTTAAATGGAATAATTCAACAGCAACTATGCATGTGTGTTCTGTTCTCTTAATTAATTAATTAATGCTAATAATATAATATAATCTAC[T/C]CTAGCTAGCAAGCTGATGGAGCTGTTCAACCTTTTTGAACATAACAGCTAGGCCTAGGCCTAGGCATGGC6CAGAATTTTTTTCTTCTCATTTTGTTTTGGGAACATTTTCTTTTCCACCCTTTTAAAATTAAATGCACT[C/A]AAGTTCTCCTCTGAAACTTTCTAAAGCTGAAATTTCTTGACCAGATATAATTCAAACATAATAGC8CTAGTAACTTAATTAATCTTCAACATTTCAAGAAAACCGGGGAAAGCAAAATTTCACTGAATGATCCAATTGC[C/T]ATGCAAGTAACTAACACCTTCGAGCAACTGAGCCGCTTAACTTCGCTCGAGCTGAAGGGCTTAAT3GATTGGATTTCTGCAGGTAAACTGTTACAATCATCACCATCCGAG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