ICS11.220B41備案號:38105-2013DB42Enzyme-linkedimmunosorbentassaytodetecttheantibodyagainstApxⅣofActinobacilluspleuropneumoniae湖北省質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB42/T894—2013前言 II III 12規(guī)范性引用文件 13縮略語 14檢測原理 15檢測條件 26檢測材料 27檢測方法 28結(jié)果判定 39注意事項 3 4 6DB42/T894—2013本文件按照GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構和編寫》給出的規(guī)則起草。本標準由華中農(nóng)業(yè)大學提出。本標準由湖北省農(nóng)業(yè)廳歸口。本標準起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學、武漢科前動物生物制品有限責任公司、湖北省動物疫病預防控制本標準主要起草人：周銳、金梅林、陳煥春、宋念華、董曉輝、金卉。DB42/T894—2013豬傳染性胸膜肺炎（porcinecontagiouspleuropneumonia）是由胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacilluspleuropneumoniae,APP）引起的一種豬的重要呼吸道傳染病，以纖維性、出血性、壞死性胸膜炎和肺炎為主要特征，多呈急性經(jīng)過，導致感染豬急性死亡。急性感染耐過豬或隱性感染豬會影響日增重，延遲出欄時間。本病呈世界性分布，是危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴重的呼吸道細菌性傳染病之一。ApxIVA是APP特異性的體內(nèi)誘導抗原。本標準以ApxIVA重組蛋白為抗原建立的間接ELISA抗體檢測方法，不僅適用于APP感染的特異性診斷，而且可以用于區(qū)分APP滅活疫苗或ApxIV基因缺失疫苗免疫豬與自然感染豬的鑒別診斷。本標準參照國家二類新獸藥“豬胸膜肺炎放線桿菌ApxIV-ELISA抗體檢測試劑盒”（2010新獸藥證字49號）的質(zhì)量標準及其使用說明書制定，為國內(nèi)首次提出。DB42/T894—20131豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣ-ELISA抗體檢測方法本標準規(guī)定了豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣ抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測方法的縮略語、檢測原理、檢測條件、檢測材料、檢測方法、結(jié)果判定和注意事項等。本標準適用于豬血清中胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣ的抗體的檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。獸用生物制品質(zhì)量標準匯編（2010）豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌ApxⅣ-ELISA抗體檢測試劑盒質(zhì)量標準。GB/T6682-2008中國實驗室用水國家標準。3縮略語下列縮略語適用于本標準。豬胸膜肺炎放線桿菌ActinobacilluspleuropneumoniaeAPP胸膜肺炎放線桿菌ApxIV毒素的A蛋白ApxIVA酶聯(lián)免疫吸附試驗Enzyme-linkedimmunosorbentassayELISA630納米波長處的吸光值OD630nm值陽性對照孔OD630nm值的平均值P樣品孔OD630nm值S4檢測原理ApxIVA毒素是APP種特異性的外毒素，但在體外培養(yǎng)APP時并不能夠檢測到ApxIVA毒素，只有在感染豬體內(nèi)才能夠檢測到ApxIVA毒素及其抗體，因此，通過檢測豬血清中ApxIVA毒素的抗體，可以診斷豬是否感染了APP。APP的ApxIVA抗體ELISA檢測技術是利用被檢樣品中的抗體與包被在酶標板上的ApxIVA抗原發(fā)生反應，然后通過洗滌把未結(jié)合的抗體及其他物質(zhì)去除。再加入羊抗豬IgG酶標抗體，酶標抗體與抗原抗體復合物結(jié)合，加入底物后，底物被酶催化成有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的顏色深淺與樣品中抗體的量呈正相關，故可根據(jù)OD630nm值判定被檢樣品中ApxIVA的抗體水平。5檢測條件2DB42/T894—20135.1環(huán)境溫度檢測過程宜在室溫（18℃~25℃)進行。5.2主要儀器臺式低溫離心機、微量移液器、2℃~8℃冰箱、恒溫箱、酶標檢測儀。6檢測材料豬胸膜肺炎放線桿菌重組ApxIVA蛋白、陽性對照血清、陰性對照血清、羊抗豬IgG酶標抗體、96孔酶標板、包被液、封閉液、樣品稀釋液、洗滌液、底物液A、底物液B、終止液。試劑的配制見附錄A。7檢測方法7.1樣品處理取待檢測豬的血液，待血液凝固后，以4000r/min離心10min，收集血清。也可采集血液，待凝固后自然析出血清。血清呈淡黃色，無嚴重溶血。具體血液采集與樣品處理注意事項見附錄B。7.2包被用包被液將抗原（豬胸膜肺炎放線桿菌重組ApxIVA蛋白）稀釋到工作濃度（6.25μg/mL）加入酶標板孔內(nèi)，每孔100μL，37℃孵育1h后，再置2℃~8℃,8h～10h。7.3封閉取出抗原包被板，棄去孔中包被液，在干凈的吸水紙上拍干。每孔加入洗滌液120μL，靜置3min，棄去洗滌液后拍干，重復洗滌3次。然后加封閉液，200μL/孔，于37℃封閉2h，甩干封閉液，自然干燥。于2℃~8℃保存（密封可保存6個月）。7.4樣品稀釋將待檢血清用樣品稀釋液按1:40的比例稀釋（195μL樣品稀釋液中加5μL待檢血清對照血清用血清稀釋液按1:4的比例稀釋（180μL樣品稀釋液中加60μL對照血清）。7.5加樣將稀釋好的待檢血清和對照血清各取100μL加入到抗原包被板的孔中，待檢血清作1孔，陰性對照和陽性對照各作2孔，輕輕振勻孔中樣品（勿溢出置37℃下孵育30min。7.6洗滌棄去96孔酶標板孔中的溶液，加入洗滌液200μL/孔，靜置3min后棄去洗滌液，并在干凈的吸水紙上拍干，重復洗滌5次。7.7加酶標抗體DB42/T894—20133每孔加酶標抗體100μL，置37℃下孵育30min，按7.6中的方法洗滌5次。7.8加底物每孔先加底物液A50μL，再加底物液B50μL，輕輕振蕩混勻，室溫（18℃~25℃)避光顯色10min。7.9終止反應每孔加終止液50μL，輕輕振蕩混勻，10min內(nèi)測定結(jié)果。7.10測定吸光值在酶標檢測儀上于630nm波長處測定各孔的OD630nm值。8結(jié)果判定結(jié)果成立的條件：陽性對照孔OD630nm值均≥0.8，且＜1.6；陰性對照孔OD630nm值均＜0.2。如果S≥P×0.25，判為陽性；如果S＜P×0.25，判為陰性。9注意事項檢測過程中注意做好個人的生物安全防護措施，廢棄物做無害化處理（詳見附錄B）。DB42/T894—20134（規(guī)范性附錄）試劑的配制A.1酶標抗體將羊抗豬IgG酶標抗體（SouthernBiotechnologyAssociates（SBA）公司）用樣品稀釋液按1:5000稀釋，置4℃保存可使用7天。A.2包被液碳酸鈉（Na2CO3）碳酸氫鈉(NaHCO3)2.93g加蒸餾水至1000mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。A.3封閉液牛血清白蛋白（BSA）0.5g蔗糖（C12H22O11）加洗滌液至100mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆谩.4樣品稀釋液牛血清白蛋白（BSA）0.5g加洗滌液至100mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。A.5洗滌液氯化鈉（NaCl）8.0g氯化鉀（KCl）0.2g磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O)2.9g磷酸二氫鈉（NaH2PO4）0.2g吐溫-20（Tween-20）0.5mL加蒸餾水至1000mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆谩.6底物液A磷酸氫二鈉（Na2HPO4）檸檬酸（C6H8O7）9.33gDB42/T894—20135過氧化脲（CH6N2O3）0.52g加蒸餾水至1000mL用HCl調(diào)pH值至5.0～5.4，置2℃~8℃下保存?zhèn)溆谩.7底物液B四甲基聯(lián)苯胺（TMB）20mg無水乙醇（C2H6O）加蒸餾水至1000mL置2℃~8℃下避光保存?zhèn)溆?。A.8終止液40%的氫氟酸(HF)625μL加蒸餾水至100mL置2℃~8℃下保存?zhèn)溆?。DB42/T894—20136（規(guī)范性附錄）注意事項B.1血樣采集及處理過程，應進行無菌操作，防止樣本因污染發(fā)生變質(zhì)。存放血樣的容器應無菌，可使用一次性滅菌容器。B.2血液自然凝固后無菌