酸奶中益生菌分離技術(shù)進(jìn)展引言酸奶作為傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，其健康價(jià)值主要源于其中的益生菌，如乳桿菌屬（*Lactobacillus*）、雙歧桿菌屬（*Bifidobacterium*）等。這些益生菌通過調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫力、改善消化功能等機(jī)制發(fā)揮益生作用。然而，酸奶中的益生菌往往與雜菌（如腐敗菌、其他乳酸菌）共存，且部分菌株因培養(yǎng)條件苛刻難以分離。因此，高效、精準(zhǔn)的益生菌分離技術(shù)是篩選優(yōu)良菌株、開發(fā)功能型酸奶及研究益生菌作用機(jī)制的關(guān)鍵。本文綜述了酸奶中益生菌分離技術(shù)的傳統(tǒng)方法、現(xiàn)代分子技術(shù)及新型前沿技術(shù)，分析其原理、優(yōu)缺點(diǎn)及應(yīng)用場(chǎng)景，為益生菌研究與產(chǎn)業(yè)應(yīng)用提供參考。一、傳統(tǒng)分離技術(shù)：基于培養(yǎng)的經(jīng)典方法傳統(tǒng)分離技術(shù)以微生物培養(yǎng)為核心，通過選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，使目標(biāo)益生菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)分離。這類方法操作簡(jiǎn)單、成本低，仍是實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中的基礎(chǔ)手段。（一）稀釋平板法原理：將酸奶樣品梯度稀釋后，涂布于固體培養(yǎng)基上，通過菌落形態(tài)、大小、顏色等特征識(shí)別目標(biāo)益生菌。操作步驟：1.樣品預(yù)處理：酸奶樣品經(jīng)無菌生理鹽水梯度稀釋（10?1~10??）；2.涂布平板：取稀釋液涂布于選擇性培養(yǎng)基（如MRS、BS培養(yǎng)基）；3.培養(yǎng)：厭氧或微需氧條件下（37℃，24~48h）培養(yǎng)；4.挑取單菌落：根據(jù)菌落形態(tài)（如乳桿菌的圓形、光滑菌落，雙歧桿菌的不規(guī)則、乳白色菌落）挑取疑似菌株，進(jìn)一步純化。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便、成本低，適合初步篩選；缺點(diǎn)：耗時(shí)（需2~3天）、選擇性差（雜菌易生長(zhǎng)）、無法分離難培養(yǎng)菌株（如某些雙歧桿菌）。（二）劃線分離法原理：通過接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面劃線，使樣品中的微生物逐步稀釋，最終形成單菌落。操作步驟：1.樣品稀釋：取少量酸奶樣品與無菌水混合；2.劃線：用接種環(huán)蘸取稀釋液，在培養(yǎng)基表面作“Z”字形劃線；3.培養(yǎng)與挑?。号囵B(yǎng)后挑取單菌落純化。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：無需特殊設(shè)備，適合小規(guī)模分離；缺點(diǎn)：效率低（需多次劃線）、易污染，難以分離低豐度菌株。二、選擇性分離技術(shù)：基于生理特性的靶向篩選傳統(tǒng)方法的局限性促使研究者開發(fā)選擇性分離技術(shù)，即利用益生菌與雜菌在碳源利用、pH耐受性、抗生素敏感性等生理特性上的差異，設(shè)計(jì)特定培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件，抑制雜菌生長(zhǎng)，富集目標(biāo)益生菌。（一）選擇培養(yǎng)基法原理：通過添加特定碳源、抑制劑或調(diào)整pH，使目標(biāo)益生菌優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)。乳桿菌分離：MRS培養(yǎng)基（含蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸鈉）是經(jīng)典選擇培養(yǎng)基，其中乙酸鈉可抑制革蘭氏陰性菌，而乳桿菌能利用葡萄糖產(chǎn)酸，進(jìn)一步抑制雜菌；雙歧桿菌分離：BS培養(yǎng)基（含乳糖、羊血、酵母提取物）中，雙歧桿菌可利用乳糖產(chǎn)酸，而羊血中的血紅素能促進(jìn)其生長(zhǎng)，同時(shí)抑制需氧菌；耐酸/耐膽鹽篩選：酸奶中的益生菌需通過胃和小腸（pH2~3，膽鹽0.3%~0.5%）才能定植腸道，因此可在培養(yǎng)基中添加鹽酸（pH2.5）或牛膽鹽（0.3%），篩選耐酸耐膽鹽菌株。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：針對(duì)性強(qiáng)，可富集目標(biāo)菌株；缺點(diǎn)：部分益生菌（如某些雙歧桿菌）對(duì)培養(yǎng)基成分敏感，可能無法生長(zhǎng)；抑制劑濃度需嚴(yán)格控制，否則會(huì)抑制目標(biāo)菌株。（二）厭氧分離技術(shù)多數(shù)益生菌（如雙歧桿菌、乳桿菌）為厭氧菌或微需氧菌，而雜菌（如芽孢桿菌）多為需氧菌。因此，厭氧培養(yǎng)是分離益生菌的關(guān)鍵步驟。方法：常用厭氧罐（含厭氧袋，產(chǎn)生H?和CO?，通過鈀催化劑轉(zhuǎn)化為水）或厭氧工作站（維持低氧環(huán)境，<1%O?）；優(yōu)化：可添加還原劑（如L-半胱氨酸），降低培養(yǎng)基中的氧化還原電位（Eh<-150mV），進(jìn)一步促進(jìn)厭氧菌生長(zhǎng)。應(yīng)用場(chǎng)景：主要用于分離雙歧桿菌、乳桿菌等厭氧菌，避免需氧雜菌污染。三、分子生物學(xué)輔助分離技術(shù)：快速精準(zhǔn)的現(xiàn)代手段傳統(tǒng)培養(yǎng)法無法分離難培養(yǎng)菌株（如“未培養(yǎng)微生物”），且鑒定過程繁瑣（需生理生化試驗(yàn)）。分子生物學(xué)技術(shù)通過檢測(cè)微生物的遺傳物質(zhì)（DNA/RNA），實(shí)現(xiàn)快速、精準(zhǔn)的分離與鑒定，是當(dāng)前益生菌研究的熱點(diǎn)。（一）PCR-DGGE技術(shù)原理：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增16SrRNA基因（細(xì)菌通用基因），然后通過變性梯度凝膠電泳（DGGE）分離不同序列的PCR產(chǎn)物（基于堿基組成差異，在變性劑梯度中解鏈溫度不同），從而識(shí)別樣品中的菌群結(jié)構(gòu)。操作步驟：1.提取酸奶樣品總DNA；2.用16SrRNA通用引物（如338F/518R）擴(kuò)增V3可變區(qū)；3.DGGE分離：將PCR產(chǎn)物加載到變性梯度凝膠（尿素+甲酰胺梯度6%~12%）中，電泳后，不同序列的DNA片段因解鏈溫度不同而分離，形成不同條帶；4.條帶回收與測(cè)序：切取目標(biāo)條帶，測(cè)序后與數(shù)據(jù)庫（如NCBI）比對(duì)，鑒定菌株種類。應(yīng)用：分析酸奶中的菌群結(jié)構(gòu)，識(shí)別優(yōu)勢(shì)益生菌（如*L.bulgaricus*、*B.longum*）；跟蹤益生菌在發(fā)酵過程中的動(dòng)態(tài)變化（如發(fā)酵0h、6h、12h的菌群變化）；分離難培養(yǎng)菌株：通過DGGE條帶測(cè)序，可發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)菌株，再通過設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行分離。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：快速（2~3天）、可檢測(cè)未培養(yǎng)菌株；缺點(diǎn)：無法定量，且條帶分辨率有限（相似序列可能無法分離）。（二）實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）原理：通過熒光染料（如SYBRGreen）或探針（如TaqMan）實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過程，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌株的定量分析。應(yīng)用：定量酸奶中益生菌數(shù)量（如*L.acidophilus*的含量）；篩選高豐度菌株：通過比較不同樣品的qPCR結(jié)果，選擇益生菌含量高的樣品進(jìn)行分離；驗(yàn)證分離效果：分離后的菌株可通過qPCR確認(rèn)是否為目標(biāo)菌株。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：快速（1~2天）、定量準(zhǔn)確；缺點(diǎn)：需要特異性引物（如*L.casei*的引物：5’-GAGTGGCGAACGGGTGAGT-3’/5’-TGCTTCAGCGTCTCGTGTTG-3’），設(shè)計(jì)難度大；易受污染（如DNA殘留）導(dǎo)致假陽性。（三）熒光原位雜交（FISH）原理：用熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針（針對(duì)16SrRNA基因）與細(xì)胞內(nèi)的rRNA雜交，通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)目標(biāo)菌株。應(yīng)用：直接觀察酸奶中的益生菌（如*B.bifidum*），無需培養(yǎng)；結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)（FACS）：將雜交后的細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀，根據(jù)熒光信號(hào)分離目標(biāo)菌株，實(shí)現(xiàn)高通量分離。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：無需培養(yǎng)，可檢測(cè)活細(xì)胞；缺點(diǎn)：探針設(shè)計(jì)需高度特異，否則會(huì)交叉雜交；細(xì)胞需固定處理，可能影響活性；成本高（熒光探針價(jià)格昂貴）。（四）宏基因組學(xué)技術(shù)原理：提取酸奶樣品總DNA，構(gòu)建宏基因組文庫，通過測(cè)序（如Illumina、Nanopore）分析菌群結(jié)構(gòu)，識(shí)別新的益生菌菌株。應(yīng)用：發(fā)現(xiàn)未培養(yǎng)益生菌：如2023年研究發(fā)現(xiàn)，酸奶中存在一種未培養(yǎng)的*Lactobacillus*菌株，其16SrRNA基因與已知菌株相似度<97%；功能基因篩選：通過宏基因組測(cè)序，可篩選編碼益生功能（如產(chǎn)短鏈脂肪酸、黏附腸道上皮細(xì)胞）的基因，為后續(xù)菌株分離提供靶點(diǎn)。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：全面分析菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)新菌株；缺點(diǎn)：成本高（測(cè)序費(fèi)用貴）；數(shù)據(jù)量大，需生物信息學(xué)分析（如OTU聚類、物種注釋）；無法直接分離菌株，需結(jié)合傳統(tǒng)方法驗(yàn)證。四、新型分離技術(shù)：前沿與創(chuàng)新隨著科技發(fā)展，新型分離技術(shù)（如微流控、免疫磁珠、CRISPR）逐漸應(yīng)用于益生菌分離，解決了傳統(tǒng)方法的瓶頸（如效率低、選擇性差）。（一）微流控技術(shù)原理：利用微通道（1~1000μm）中的流體力學(xué)原理，通過細(xì)胞大小、電荷、親和力等差異，實(shí)現(xiàn)高效分離?；诖笮》蛛x：益生菌（如乳桿菌，直徑0.5~2μm）比雜菌（如芽孢桿菌，直徑1~5μm）小，可通過微濾膜（孔徑0.8μm）分離；基于親和力分離：在微通道表面修飾益生菌特異性抗體（如抗*L.rhamnosus*抗體），當(dāng)樣品流過時(shí)，目標(biāo)菌株被捕獲，雜菌則被沖洗掉；基于電場(chǎng)分離：益生菌與雜菌的表面電荷不同，可通過電場(chǎng)（如介電電泳）將其分離。應(yīng)用：2022年，研究者開發(fā)了一種微流控芯片，結(jié)合抗體修飾和電場(chǎng)分離，實(shí)現(xiàn)了酸奶中*L.acidophilus*的高效分離（純度>95%，回收率>80%）。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：高通量（每分鐘處理10?~10?個(gè)細(xì)胞）、純度高、可連續(xù)操作；缺點(diǎn)：設(shè)備復(fù)雜（需微加工技術(shù)）、成本高、易堵塞（微通道易被細(xì)胞或雜質(zhì)阻塞）。（二）免疫磁珠分離技術(shù)（IMB）原理：將益生菌特異性抗體（如抗*B.longum*抗體）偶聯(lián)到磁珠（如Fe?O?納米磁珠）表面，與酸奶樣品混合后，抗體與目標(biāo)菌株結(jié)合，通過磁場(chǎng)分離磁珠-菌株復(fù)合物，再洗脫獲得純菌株。優(yōu)化：磁珠大?。杭{米磁珠（直徑10~100nm）比微米磁珠（直徑1~10μm）具有更大的比表面積，結(jié)合效率更高；抗體修飾：采用生物素-親和素系統(tǒng)（biotin-avidin），可提高抗體與磁珠的結(jié)合穩(wěn)定性；洗脫條件：通過調(diào)整pH（如pH2.0）或添加競(jìng)爭(zhēng)抗原（如目標(biāo)菌株的表面蛋白），溫和洗脫菌株，保持其活性。應(yīng)用：工業(yè)生產(chǎn)中，IMB技術(shù)常用于分離高純度益生菌（如*L.casei*），用于制備益生菌粉或功能型酸奶。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：特異性強(qiáng)（抗體識(shí)別）、純度高（>90%）、速度快（30~60分鐘）；缺點(diǎn)：抗體價(jià)格昂貴、磁珠需回收（否則會(huì)殘留于產(chǎn)品中）、對(duì)低豐度菌株（<103CFU/mL）分離效率低。（三）CRISPR-Cas系統(tǒng)輔助分離原理：CRISPR-Cas系統(tǒng)是細(xì)菌的“免疫系統(tǒng)”，可識(shí)別并切割外源DNA。通過設(shè)計(jì)靶向雜菌的sgRNA（向?qū)NA），將CRISPR-Cas系統(tǒng)導(dǎo)入酸奶樣品中，切割雜菌的DNA，從而富集目標(biāo)益生菌。應(yīng)用：2023年，研究者利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了靶向酸奶中常見雜菌（如*E.coli*、*Staphylococcus*）的sgRNA，成功將*L.plantarum*的豐度從10%提高到85%。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：特異性極強(qiáng)（sgRNA可精準(zhǔn)識(shí)別雜菌）、效率高（可快速清除雜菌）；缺點(diǎn)：技術(shù)復(fù)雜（需構(gòu)建CRISPR-Cas系統(tǒng)）、可能影響益生菌活性（Cas蛋白可能切割目標(biāo)菌株的DNA）、成本高。五、應(yīng)用與挑戰(zhàn)（一）應(yīng)用場(chǎng)景實(shí)驗(yàn)室研究：傳統(tǒng)分離法（稀釋平板+MRS）適合初步篩選；分子技術(shù)（PCR-DGGE、qPCR）適合快速鑒定；宏基因組學(xué)適合發(fā)現(xiàn)新菌株；工業(yè)生產(chǎn)：免疫磁珠分離（IMB）適合高純度菌株制備；微流控適合大規(guī)模連續(xù)分離；質(zhì)量控制：qPCR可定量酸奶中益生菌含量（如GB____要求，酸奶中*Lactobacillus*含量≥10?CFU/g）。（二）挑戰(zhàn)難培養(yǎng)菌株分離：部分益生菌（如某些雙歧桿菌）對(duì)培養(yǎng)條件（如氧氣、溫度、培養(yǎng)基成分）極其敏感，無法在體外培養(yǎng)，需依賴分子技術(shù)（如FISH、宏基因組學(xué)）檢測(cè)；低豐度菌株分離：酸奶中益生菌含量可能較低（如10?~10?CFU/g），而雜菌（如*Pseudomonas*）含量可能更高（10?~10?CFU/g），需通過選擇性培養(yǎng)基或免疫磁珠富集；活性保持：分離過程中（如離心、洗脫）可能損傷益生菌活性，需優(yōu)化操作條件（如低溫、溫和洗脫液）；功能驗(yàn)證：分離后的菌株需進(jìn)行益生功能驗(yàn)證（如黏附腸道上皮細(xì)胞、產(chǎn)短鏈脂肪酸、抑制致病菌），以及安全性評(píng)價(jià)（如無致病性、無耐藥性），這是后續(xù)應(yīng)用的關(guān)鍵。結(jié)論與展望酸奶中益生菌分離技術(shù)經(jīng)歷了從傳統(tǒng)培養(yǎng)法到現(xiàn)代分子技術(shù)，再到新型前沿技術(shù)的發(fā)展歷程。傳統(tǒng)方法（如稀釋平板、選擇培養(yǎng)基）仍是基礎(chǔ)，適合初步篩選；分子技術(shù)（如PCR-DGGE、qPCR）提高了分離的精準(zhǔn)性和速度；新型技術(shù)（如微流控、免疫磁珠、CRISPR）則解決了傳統(tǒng)方法的瓶頸（如效率低、選擇性差）。未來，益生菌分離技術(shù)的發(fā)展方向?qū)⒓性谝韵聨讉€(gè)方面：多技術(shù)融合：如傳統(tǒng)培養(yǎng)法與分子技術(shù)結(jié)合（如