人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞特性及耐藥機(jī)制的體外解析一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率一直居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年胃癌新發(fā)病例約108.9萬(wàn)例，死亡病例約76.9萬(wàn)例，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病和死亡的第5位和第4位。在我國(guó)，胃癌同樣是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，由于人口基數(shù)大，發(fā)病人數(shù)眾多，嚴(yán)重影響國(guó)民健康和生活質(zhì)量。目前，臨床上針對(duì)胃癌的治療手段主要包括手術(shù)切除、化療、放療以及近年來(lái)興起的靶向治療和免疫治療等。早期胃癌患者通過(guò)根治性手術(shù)切除，5年生存率相對(duì)較高；然而，大部分患者確診時(shí)已處于中晚期，腫瘤往往發(fā)生了局部浸潤(rùn)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，單純手術(shù)治療效果不佳，需要聯(lián)合化療等綜合治療手段?；熾m然在一定程度上能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散，但由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性，使得化療的療效受到限制，患者的預(yù)后仍然較差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，中晚期胃癌患者的5年生存率僅為20%-30%，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者死亡的主要原因。腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）假說(shuō)的提出為腫瘤的研究和治療帶來(lái)了新的思路。CSCs被認(rèn)為是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化潛能和致瘤能力的一小部分細(xì)胞亞群，它們?cè)谀[瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。旁群細(xì)胞（SidePopulationcells，SP細(xì)胞）作為一種具有腫瘤干細(xì)胞特性的細(xì)胞亞群，最早在小鼠骨髓細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。當(dāng)細(xì)胞被Hoechst33342染色后，通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，發(fā)現(xiàn)有一小部分細(xì)胞表現(xiàn)出Hoechst低染的特征，這部分細(xì)胞就被定義為SP細(xì)胞。研究表明，SP細(xì)胞高表達(dá)ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，如ABCG2等，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⑦M(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hoechst33342等染料主動(dòng)泵出細(xì)胞外，從而使SP細(xì)胞呈現(xiàn)出低染的特性。近年來(lái)，在多種腫瘤細(xì)胞系和腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)了SP細(xì)胞的存在，如乳腺癌、肺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等。越來(lái)越多的證據(jù)表明，SP細(xì)胞與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。由于SP細(xì)胞能夠高效地排出化療藥物，使其對(duì)化療藥物具有較強(qiáng)的耐受性，這可能是導(dǎo)致腫瘤化療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因之一。此外，SP細(xì)胞還具有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，能夠在腫瘤組織中不斷自我更新并分化為其他腫瘤細(xì)胞，維持腫瘤的生長(zhǎng)和發(fā)展。因此，深入研究SP細(xì)胞的生物學(xué)特性和功能，對(duì)于揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、提高腫瘤治療效果具有重要意義。在胃癌研究領(lǐng)域，雖然目前對(duì)于胃癌中SP細(xì)胞的研究相對(duì)較少，但已有一些研究報(bào)道顯示，人胃癌細(xì)胞系中存在SP細(xì)胞，并且這些SP細(xì)胞表現(xiàn)出一些與腫瘤干細(xì)胞相似的生物學(xué)特性，如耐藥性、自我更新能力等。然而，關(guān)于人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞的具體特性、其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制以及與其他腫瘤細(xì)胞亞群的差異等方面，仍存在許多未知之處。進(jìn)一步開(kāi)展對(duì)人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞的體外研究，有助于我們更加深入地了解胃癌的發(fā)病機(jī)制，為尋找新的胃癌治療靶點(diǎn)和策略提供理論依據(jù)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞的生物學(xué)特性，包括其耐藥性、自我更新能力、增殖能力以及在體外培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)特征等方面。通過(guò)對(duì)這些特性的全面解析，期望能夠揭示SP細(xì)胞在胃癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的具體作用機(jī)制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。胃癌作為消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。目前，雖然手術(shù)切除、化療、放療以及靶向治療等多種手段被應(yīng)用于胃癌的臨床治療，但由于腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性，治療效果仍不盡人意。SP細(xì)胞作為腫瘤干細(xì)胞的一種，具有獨(dú)特的生物學(xué)特性，可能在胃癌的耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用。深入研究BGC-823中SP細(xì)胞，有助于我們更好地理解胃癌的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)更有效的治療策略提供理論支持。具體而言，本研究的意義主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：揭示胃癌耐藥機(jī)制：通過(guò)研究BGC-823中SP細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，明確其耐藥機(jī)制，有助于開(kāi)發(fā)克服耐藥性的新方法，提高化療的療效，改善患者的預(yù)后。為靶向治療提供依據(jù)：SP細(xì)胞可能是胃癌治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。深入了解其生物學(xué)特性，能夠?yàn)殚_(kāi)發(fā)針對(duì)SP細(xì)胞的靶向治療藥物提供理論依據(jù)，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的治療。完善腫瘤干細(xì)胞理論：胃癌中SP細(xì)胞的研究相對(duì)較少，本研究有助于進(jìn)一步豐富和完善腫瘤干細(xì)胞理論，為腫瘤生物學(xué)的發(fā)展做出貢獻(xiàn)。指導(dǎo)臨床治療：研究結(jié)果可為臨床醫(yī)生在胃癌治療方案的選擇和制定上提供參考，幫助他們更合理地應(yīng)用現(xiàn)有治療手段，提高治療效果，減少?gòu)?fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系BGC-823購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Invitrogen公司）進(jìn)行消化傳代。1.3.2SP細(xì)胞的鑒定與分選采用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合Hoechst33342染色法鑒定和分選SP細(xì)胞。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液分為兩組，一組作為實(shí)驗(yàn)組，加入終濃度為5μg/mL的Hoechst33342（Sigma公司）；另一組作為對(duì)照組，加入5μg/mL的Hoechst33342和50μmol/L的維拉帕米（Sigma公司），維拉帕米是ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑，可阻斷Hoechst33342的外排。將兩組細(xì)胞在37℃、5%CO?條件下避光孵育90min，期間每隔15min輕輕振蕩一次，使細(xì)胞與染料充分接觸。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，加入碘化丙啶（PI，終濃度為1μg/mL，Sigma公司）染色5min，以排除死細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀（BDFACSAriaIII）進(jìn)行檢測(cè)分析，激發(fā)光波長(zhǎng)為355nm，Hoechst33342的發(fā)射光通過(guò)450/50nm（藍(lán)色熒光）和675/20nm（紅色熒光）濾光片收集，PI的發(fā)射光通過(guò)585/42nm濾光片收集。在Hoechst33342藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的二維散點(diǎn)圖上，SP細(xì)胞表現(xiàn)為Hoechst低染的側(cè)向小亞群，位于主群細(xì)胞的左下角。對(duì)照組中由于維拉帕米阻斷了染料外排，SP細(xì)胞比例應(yīng)顯著降低或消失。根據(jù)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，設(shè)置分選門，將SP細(xì)胞和非SP（Non-SP）細(xì)胞分選出，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.3.3耐藥性實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU，Sigma公司）的耐藥性。將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞分別以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0、1、5、10、50、100μmol/L）的5-FU，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，Sigma公司），37℃孵育4h后，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO（Sigma公司），振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC）在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率繪制藥物濃度-效應(yīng)曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??），比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性差異。1.3.4自我更新能力實(shí)驗(yàn)通過(guò)成球?qū)嶒?yàn)檢測(cè)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的自我更新能力。將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞以1×103個(gè)/孔的密度接種于超低吸附96孔板（Corning公司）中，培養(yǎng)體系為含20ng/mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF，PeproTech公司）、10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，PeproTech公司）、B27添加劑（1:50，Gibco公司）和1%青霉素-鏈霉素的無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)基（Hyclone公司）。每隔3天半量換液，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞球的形成情況，10-14天后統(tǒng)計(jì)細(xì)胞球數(shù)量，計(jì)算成球率，公式為：成球率（%）=（形成的細(xì)胞球數(shù)量/接種的細(xì)胞數(shù)量）×100%。比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的成球率，評(píng)估其自我更新能力的差異。1.3.5增殖能力實(shí)驗(yàn)采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標(biāo)記法檢測(cè)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的增殖能力。將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。向培養(yǎng)體系中加入終濃度為10μmol/L的EdU，繼續(xù)培養(yǎng)2h。然后棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，再用Click反應(yīng)液避光孵育30min，使EdU與熒光染料結(jié)合。最后用Hoechst33342復(fù)染細(xì)胞核10min，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和總細(xì)胞（藍(lán)色熒光）數(shù)量，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，公式為：EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（%）=（EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量）×100%。比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，判斷其增殖能力的差異。1.3.6體外培養(yǎng)特征觀察將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞分別接種于普通細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和貼壁情況等，記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。每隔24h對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)7天，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中的生長(zhǎng)特性差異。1.3.7技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：首先進(jìn)行人胃癌細(xì)胞系BGC-823的復(fù)蘇與培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，利用Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)鑒定和分選SP細(xì)胞與Non-SP細(xì)胞。接著，對(duì)分選后的兩種細(xì)胞亞群分別進(jìn)行耐藥性實(shí)驗(yàn)（MTT法檢測(cè)對(duì)5-FU的耐藥性）、自我更新能力實(shí)驗(yàn)（成球?qū)嶒?yàn)）、增殖能力實(shí)驗(yàn)（EdU標(biāo)記法）以及體外培養(yǎng)特征觀察（繪制生長(zhǎng)曲線等）。通過(guò)對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，深入探究人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞的生物學(xué)特性。[此處插入技術(shù)路線圖，圖1：人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞體外研究技術(shù)路線圖，清晰展示從細(xì)胞培養(yǎng)到各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)及結(jié)果分析的整個(gè)流程]二、人胃癌細(xì)胞系BGC-823及SP細(xì)胞概述2.1BGC-823細(xì)胞系特性2.1.1細(xì)胞來(lái)源與分化程度BGC-823細(xì)胞系源自一位62歲男性的低分化原發(fā)胃腺癌組織，于1986年由蔡玉暉、谷鈺之等學(xué)者成功建立。低分化意味著癌細(xì)胞的形態(tài)和功能與正常胃腺細(xì)胞差異較大，其細(xì)胞分化極不成熟，但仍保留少量原來(lái)源組織痕跡。這種低分化的特性賦予了BGC-823細(xì)胞較強(qiáng)的惡性程度，表現(xiàn)為生長(zhǎng)迅速、侵襲和轉(zhuǎn)移能力較強(qiáng)。在腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中，低分化的BGC-823細(xì)胞更容易突破組織屏障，侵入周圍組織和血管，從而增加了腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，這也是臨床上胃癌患者預(yù)后較差的重要原因之一。研究表明，低分化胃癌細(xì)胞的增殖活性明顯高于高分化胃癌細(xì)胞，其細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制存在異常，導(dǎo)致細(xì)胞不斷進(jìn)行分裂增殖。此外，低分化的BGC-823細(xì)胞可能存在更多的基因變異和信號(hào)通路異常，這些改變進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的惡性生物學(xué)行為。2.1.2細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)特性在體外培養(yǎng)條件下，BGC-823細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞之間通過(guò)緊密連接和橋粒等結(jié)構(gòu)相互連接，形成較為緊密的細(xì)胞單層。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合狀態(tài)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)接觸抑制現(xiàn)象，即細(xì)胞停止增殖并保持相對(duì)靜止的狀態(tài)。但在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，這種接觸抑制機(jī)制可能會(huì)被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)增殖并出現(xiàn)堆積、重疊生長(zhǎng)的現(xiàn)象。BGC-823細(xì)胞的生長(zhǎng)具有一定的規(guī)律性。在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞接種后會(huì)經(jīng)歷潛伏期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期。潛伏期是細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境的階段，此時(shí)細(xì)胞代謝活躍，但增殖緩慢；隨后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)，代謝旺盛，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求較高；當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗、代謝產(chǎn)物的積累以及空間限制等因素，細(xì)胞生長(zhǎng)速度逐漸減緩，進(jìn)入平臺(tái)期，此時(shí)細(xì)胞數(shù)量基本保持穩(wěn)定。群體細(xì)胞倍增時(shí)間約為45小時(shí)，分裂指數(shù)較高，這表明BGC-823細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力。在培養(yǎng)過(guò)程中，BGC-823細(xì)胞需要富含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，如含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，以滿足其快速生長(zhǎng)和代謝的需求。此外，細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和氣體成分也較為敏感，適宜的培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱，以維持細(xì)胞的正常生理功能和生長(zhǎng)狀態(tài)。2.2SP細(xì)胞的定義與特性2.2.1SP細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)與定義SP細(xì)胞最早于1996年由Goodell等人在研究鼠造血干細(xì)胞時(shí)被發(fā)現(xiàn)。在利用DNA熒光結(jié)合染料Hoechst33342對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析時(shí)，他們觀察到一群染色強(qiáng)度顯著低于其他細(xì)胞的特殊細(xì)胞亞群。這些細(xì)胞能夠迅速將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hoechst33342染料泵出細(xì)胞外，從而在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中呈現(xiàn)出低熒光強(qiáng)度的特征，被命名為旁群細(xì)胞（SidePopulationcells，SP細(xì)胞）。當(dāng)時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，這部分SP細(xì)胞雖然僅占整個(gè)骨髓細(xì)胞的0.1%，卻具有強(qiáng)大的造血干細(xì)胞活性，其能夠重建受致死劑量放射線照射的小鼠的髓系和淋巴系血細(xì)胞，且重建能力是普通骨髓細(xì)胞的1000倍，這一發(fā)現(xiàn)引起了科學(xué)界對(duì)SP細(xì)胞的廣泛關(guān)注。隨后，在人和猴的骨髓中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了類似的SP細(xì)胞，它們?cè)诔审w有核骨髓細(xì)胞中所占比例同樣不足0.1%，但卻富含高度濃縮的骨髓干細(xì)胞成分。隨著研究的不斷深入，SP細(xì)胞在多種種屬和組織類型中被證實(shí)存在，包括骨骼肌、心肌、皮膚、乳腺、神經(jīng)、腦、肝臟、脾臟、腎臟、肺、小腸等正常組織，以及膽囊癌、胃癌、胰腺癌、肝癌、口腔癌、骨肉瘤、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、喉癌、卵巢癌、垂體瘤、腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種腫瘤組織及相應(yīng)細(xì)胞系。在腫瘤研究領(lǐng)域，SP細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞（CancerStemCells，CSCs）的一種重要存在形式。腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為，腫瘤組織中存在一小部分具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，它們能夠自我更新、多向分化并具有致瘤能力，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的根源。SP細(xì)胞由于其獨(dú)特的生物學(xué)特性，如高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員（如ABCG2等），能夠?qū)⒒熕幬锏韧庠葱晕镔|(zhì)排出細(xì)胞外，從而表現(xiàn)出對(duì)化療藥物的耐藥性；同時(shí)具有較強(qiáng)的自我更新和增殖能力，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此被視為腫瘤干細(xì)胞研究的重要對(duì)象之一。目前，SP細(xì)胞的定義主要基于其獨(dú)特的流式細(xì)胞術(shù)表型，即經(jīng)Hoechst33342染色后，在流式細(xì)胞儀檢測(cè)的Hoechst藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的二維散點(diǎn)圖上，呈現(xiàn)為位于主群細(xì)胞左下角的Hoechst低染的側(cè)向小亞群。然而，需要注意的是，SP細(xì)胞并非一個(gè)均一的細(xì)胞群體，其內(nèi)部可能存在異質(zhì)性，不同組織來(lái)源的SP細(xì)胞在分子標(biāo)志物表達(dá)、生物學(xué)功能等方面可能存在差異，這也為SP細(xì)胞的深入研究帶來(lái)了一定的挑戰(zhàn)。2.2.2SP細(xì)胞的生物學(xué)特性多向分化潛能：SP細(xì)胞具有向多種細(xì)胞類型分化的能力，這一特性使其在組織修復(fù)和再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在正常組織中，如骨髓來(lái)源的SP細(xì)胞，在特定的誘導(dǎo)條件下，不僅能夠分化為各種血細(xì)胞，包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等，還能夠跨胚層分化為其他組織細(xì)胞，如心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。Jackson等人將骨髓干細(xì)胞中提純的SP細(xì)胞植入鼠心肌梗塞區(qū)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的SP細(xì)胞成功分化成心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并參與了有功能組織的形成，為心肌梗塞的治療提供了新的思路。在腫瘤組織中，SP細(xì)胞的多向分化潛能則可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性增加，使其在形態(tài)、功能和對(duì)治療的反應(yīng)等方面表現(xiàn)出多樣性。例如，在乳腺癌細(xì)胞系中，SP細(xì)胞能夠分化為非SP細(xì)胞，形成具有不同生物學(xué)特性的腫瘤細(xì)胞亞群，這些亞群在腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和耐藥等方面可能發(fā)揮不同的作用，增加了腫瘤治療的難度。自我更新能力：自我更新是干細(xì)胞的重要特征之一，SP細(xì)胞也具備較強(qiáng)的自我更新能力。SP細(xì)胞能夠通過(guò)非對(duì)稱性分裂，產(chǎn)生一個(gè)與自身相同的SP細(xì)胞和一個(gè)分化程度更高的非SP細(xì)胞，從而維持自身細(xì)胞數(shù)量的穩(wěn)定并為組織提供分化細(xì)胞。以乳腺SP細(xì)胞為例，Welm等研究發(fā)現(xiàn)乳腺SP細(xì)胞僅占乳腺上皮細(xì)胞的0.2-2%，但在體外培養(yǎng)條件下，這些SP細(xì)胞能夠分裂產(chǎn)生SP和非SP細(xì)胞，并且將其注射到乳腺脂肪墊后，SP細(xì)胞可以同時(shí)分化產(chǎn)生導(dǎo)管組織和小葉組織。在肝癌細(xì)胞系中，SP細(xì)胞的自我更新能力也得到了證實(shí)，它們能夠在體外不斷增殖并形成細(xì)胞球，這些細(xì)胞球具有較高的克隆形成能力，表明SP細(xì)胞能夠自我更新并維持其干細(xì)胞特性。自我更新能力使得SP細(xì)胞在腫瘤組織中持續(xù)存在，即使在經(jīng)過(guò)化療、放療等治療后，殘留的SP細(xì)胞仍能夠通過(guò)自我更新重新啟動(dòng)腫瘤的生長(zhǎng)，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。耐藥性：SP細(xì)胞對(duì)化療藥物具有較強(qiáng)的耐受能力，這是其重要的生物學(xué)特性之一，也是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的重要原因。SP細(xì)胞高表達(dá)ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，如ABCG2、ABCB1等，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠以能量依賴的方式將化療藥物排出細(xì)胞外，限制細(xì)胞內(nèi)藥物濃度的積累，從而使SP細(xì)胞對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性。ABCG2也被稱為乳腺癌耐藥蛋白（BCRP），其底物包括多種抗腫瘤藥物，如鹽酸米托蒽醌、甲氨喋呤、喜樹(shù)堿、黃酮類抗腫瘤藥等。研究表明，在胃癌細(xì)胞系中，SP細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶、順鉑等常用化療藥物的耐藥性明顯高于非SP細(xì)胞，使得腫瘤在化療過(guò)程中難以被徹底清除。此外，SP細(xì)胞的耐藥機(jī)制還與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等因素有關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴激酶的表達(dá)異常，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，處于相對(duì)靜止?fàn)顟B(tài)，對(duì)細(xì)胞周期特異性化療藥物不敏感。同時(shí)，SP細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠及時(shí)修復(fù)化療藥物引起的DNA損傷，從而增強(qiáng)其對(duì)化療藥物的耐受性。高增殖潛能：盡管SP細(xì)胞在腫瘤組織中所占比例較低，但它們具有較高的增殖潛能。一些研究表明，SP細(xì)胞中多種與細(xì)胞增殖相關(guān)的信號(hào)通路，如Wnt/β-catenin、Notch、Hedgehog等信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，這些信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)SP細(xì)胞的增殖和自我更新。在人肺腺癌細(xì)胞系中，通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的關(guān)鍵分子β-catenin表達(dá)上調(diào)，且該信號(hào)通路的激活與SP細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。此外，SP細(xì)胞還能夠分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，這些因子可以通過(guò)自分泌或旁分泌的方式作用于SP細(xì)胞自身或周圍的腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長(zhǎng)。在人結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，SP細(xì)胞分泌的VEGF能夠促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，進(jìn)一步支持SP細(xì)胞和腫瘤的生長(zhǎng)。然而，需要注意的是，SP細(xì)胞的增殖能力在不同腫瘤類型和不同實(shí)驗(yàn)條件下可能存在差異，其增殖調(diào)控機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.3研究現(xiàn)狀2.3.1SP細(xì)胞在腫瘤研究中的進(jìn)展SP細(xì)胞在腫瘤研究領(lǐng)域已取得了顯著進(jìn)展，為深入理解腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥機(jī)制提供了新的視角。在多種腫瘤類型中，SP細(xì)胞的存在及其獨(dú)特生物學(xué)特性已被廣泛證實(shí)。在乳腺癌研究中，有學(xué)者利用流式細(xì)胞術(shù)成功分選出乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231中的SP細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這些SP細(xì)胞高表達(dá)ABCG2等耐藥蛋白，對(duì)多種化療藥物如阿霉素、紫杉醇等具有較強(qiáng)的耐藥性。將SP細(xì)胞和非SP細(xì)胞分別接種到裸鼠體內(nèi)，SP細(xì)胞能夠在較低細(xì)胞數(shù)量下形成腫瘤，且腫瘤生長(zhǎng)速度更快，表明SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的致瘤能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞中Notch信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，抑制該信號(hào)通路可降低SP細(xì)胞的自我更新能力和致瘤性，提示Notch信號(hào)通路可能是乳腺癌SP細(xì)胞治療的潛在靶點(diǎn)。肺癌方面，人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中SP細(xì)胞的研究表明，SP細(xì)胞比例約為1.5%-2.5%，其在體外具有更強(qiáng)的克隆形成能力和遷移能力。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，SP細(xì)胞接種裸鼠后成瘤率明顯高于非SP細(xì)胞，且腫瘤侵襲性更強(qiáng)。基因表達(dá)譜分析顯示，SP細(xì)胞中與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)的基因如Snail、Slug等表達(dá)上調(diào)，表明SP細(xì)胞可能通過(guò)EMT過(guò)程促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移。此外，研究還發(fā)現(xiàn)SP細(xì)胞對(duì)放療具有耐受性，其機(jī)制與DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)以及抗凋亡蛋白表達(dá)增加有關(guān)。肝癌研究中，從肝癌細(xì)胞系HepG2和Bel-7402中分離出的SP細(xì)胞表現(xiàn)出獨(dú)特的生物學(xué)特性。SP細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)條件下能夠形成腫瘤球，具有更強(qiáng)的自我更新能力。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞中多種與能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白表達(dá)差異顯著，如磷酸化的Akt蛋白表達(dá)上調(diào)，提示PI3K/Akt信號(hào)通路在肝癌SP細(xì)胞的增殖和存活中起重要作用。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中SP細(xì)胞比例與患者的預(yù)后密切相關(guān)，SP細(xì)胞比例高的患者術(shù)后復(fù)發(fā)率更高，生存率更低。在結(jié)直腸癌研究中，對(duì)SW480、HT29等細(xì)胞系的研究表明，SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的耐藥性和致瘤能力。研究發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路異常激活，該信號(hào)通路的激活促進(jìn)了SP細(xì)胞的干性維持和腫瘤生長(zhǎng)。通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，可有效降低SP細(xì)胞的比例和腫瘤形成能力。此外，有研究表明腸道微生物群可能通過(guò)調(diào)節(jié)SP細(xì)胞的生物學(xué)特性影響結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展，為結(jié)直腸癌的治療提供了新的思路。綜上所述，SP細(xì)胞在多種腫瘤中表現(xiàn)出干細(xì)胞特性，包括自我更新、多向分化、耐藥性和致瘤性等，其相關(guān)信號(hào)通路的研究為腫瘤治療提供了潛在靶點(diǎn)。然而，目前SP細(xì)胞的研究仍面臨一些挑戰(zhàn)，如缺乏特異性的分子標(biāo)志物，不同研究中SP細(xì)胞的分選和鑒定方法存在差異，導(dǎo)致研究結(jié)果難以直接比較等。未來(lái)需要進(jìn)一步深入研究SP細(xì)胞的生物學(xué)特性和分子機(jī)制，開(kāi)發(fā)更加精準(zhǔn)的檢測(cè)和治療方法。2.3.2BGC-823中SP細(xì)胞的研究現(xiàn)狀目前，針對(duì)人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞的研究雖有一定成果，但仍處于相對(duì)初步的階段，許多方面有待深入探究。在SP細(xì)胞的鑒定與分選上，已有研究采用Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)成功從BGC-823細(xì)胞中分離出SP細(xì)胞，其比例通常在1%-3%左右。研究發(fā)現(xiàn)，BGC-823中的SP細(xì)胞高表達(dá)ABCG2蛋白，該蛋白通過(guò)主動(dòng)外排化療藥物，如5-氟尿嘧啶、順鉑等，使SP細(xì)胞對(duì)這些藥物產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致化療效果不佳。在自我更新和增殖能力方面，BGC-823的SP細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的自我更新能力，能夠在無(wú)血清、添加生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基中形成細(xì)胞球，且細(xì)胞球的克隆形成效率明顯高于非SP細(xì)胞。細(xì)胞周期分析顯示，SP細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例相對(duì)較高，這可能與其對(duì)化療藥物的耐受性以及較強(qiáng)的自我更新能力有關(guān)。同時(shí)，SP細(xì)胞中與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因如CyclinD1、PCNA等表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制研究中，部分研究表明BGC-823的SP細(xì)胞可能通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)維持其干細(xì)胞特性和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。抑制該信號(hào)通路可降低SP細(xì)胞的比例和腫瘤形成能力。此外，SP細(xì)胞中某些上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin表達(dá)增加，提示其可能具有更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步明確。盡管已有這些研究進(jìn)展，但目前對(duì)于BGC-823中SP細(xì)胞的研究還存在許多不足。例如，SP細(xì)胞與非SP細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組差異尚未完全明確，這限制了對(duì)其獨(dú)特生物學(xué)特性分子機(jī)制的深入理解。此外，BGC-823中SP細(xì)胞在體內(nèi)腫瘤模型中的動(dòng)態(tài)變化以及對(duì)腫瘤微環(huán)境的影響也有待進(jìn)一步研究，這些方面的深入探究將有助于為胃癌的治療提供更有效的靶點(diǎn)和策略。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1細(xì)胞系人胃癌細(xì)胞系BGC-823購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），該細(xì)胞系來(lái)源于一位62歲男性的低分化原發(fā)胃腺癌組織。細(xì)胞保存在本實(shí)驗(yàn)室的液氮罐中，液氮溫度可達(dá)-196℃，能夠有效維持細(xì)胞的生物學(xué)特性和活性，防止細(xì)胞在長(zhǎng)期保存過(guò)程中發(fā)生變異或死亡。復(fù)蘇后的細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Invitrogen公司）進(jìn)行消化傳代，以保證細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑包括：胎牛血清（FBS，Gibco公司），為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分；RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司），維持細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；青霉素、鏈霉素（Invitrogen公司），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染；0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，Invitrogen公司），用于細(xì)胞的消化傳代；Hoechst33342（Sigma公司），用于SP細(xì)胞的染色鑒定；維拉帕米（Sigma公司），ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑，用于驗(yàn)證SP細(xì)胞的特性；碘化丙啶（PI，Sigma公司），用于排除死細(xì)胞；5-氟尿嘧啶（5-FU，Sigma公司），常用的化療藥物，用于檢測(cè)細(xì)胞的耐藥性；MTT（Sigma公司），用于細(xì)胞活性檢測(cè)；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），溶解MTT結(jié)晶；表皮生長(zhǎng)因子（EGF，PeproTech公司）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，PeproTech公司），促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和自我更新；B27添加劑（Gibco公司），為細(xì)胞提供特殊營(yíng)養(yǎng)成分；EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司），用于檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。主要儀器有：CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific公司），提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度、濕度和CO?環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)狀態(tài)；流式細(xì)胞儀（BDFACSAriaIII），鑒定和分選SP細(xì)胞；酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC），測(cè)定MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光度值；低溫離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和試劑的離心分離；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），提供無(wú)菌的操作環(huán)境；細(xì)胞計(jì)數(shù)板，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)；96孔板、24孔板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶等細(xì)胞培養(yǎng)耗材。3.2實(shí)驗(yàn)方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系BGC-823在含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（Invitrogen公司）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）中培養(yǎng)。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每2-3天進(jìn)行一次換液操作。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，需要進(jìn)行傳代。首先，提前將培養(yǎng)基、PBS放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱，用75%酒精擦拭后再放入超凈臺(tái)內(nèi)。吸除或倒掉細(xì)胞瓶?jī)?nèi)舊培養(yǎng)液，加少量PBS潤(rùn)洗細(xì)胞。接著，加入適量胰酶，使胰酶的量能蓋住細(xì)胞，37℃孵育，每隔2-3min在顯微鏡下觀察，待貼壁細(xì)胞間間隙變大、細(xì)胞趨于圓形但還未漂起時(shí)棄去胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基，晃動(dòng)細(xì)胞瓶，終止胰酶作用。用吸管小心吹打貼壁的細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，控制吹打的力度，避免產(chǎn)生大量的氣泡。最后將細(xì)胞懸液分別接種到另外的2-3個(gè)細(xì)胞瓶?jī)?nèi)，加入新鮮培養(yǎng)基，置37℃溫箱培養(yǎng)，隔天觀察貼壁生長(zhǎng)情況。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，需密切關(guān)注細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，避免污染等異常情況的發(fā)生，以確保細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。3.2.2SP細(xì)胞的檢測(cè)與分選采用Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分選技術(shù)來(lái)檢測(cè)和分離SP細(xì)胞。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。將細(xì)胞懸液平均分為兩組，其中一組作為實(shí)驗(yàn)組，加入終濃度為5μg/mL的Hoechst33342（Sigma公司）；另一組作為對(duì)照組，加入5μg/mL的Hoechst33342和50μmol/L的維拉帕米（Sigma公司），維拉帕米作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的抑制劑，可有效阻斷Hoechst33342的外排。將兩組細(xì)胞在37℃、5%CO?的條件下避光孵育90min，在此期間，每隔15min需輕輕振蕩一次，以保證細(xì)胞與染料充分接觸。孵育結(jié)束后，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的染料。隨后，加入碘化丙啶（PI，終濃度為1μg/mL，Sigma公司）染色5min，用于排除死細(xì)胞。利用流式細(xì)胞儀（BDFACSAriaIII）進(jìn)行檢測(cè)分析，激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)定為355nm，Hoechst33342的發(fā)射光通過(guò)450/50nm（藍(lán)色熒光）和675/20nm（紅色熒光）濾光片收集，PI的發(fā)射光通過(guò)585/42nm濾光片收集。在Hoechst33342藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的二維散點(diǎn)圖上，SP細(xì)胞呈現(xiàn)為Hoechst低染的側(cè)向小亞群，通常位于主群細(xì)胞的左下角。而對(duì)照組中由于維拉帕米阻斷了染料外排，SP細(xì)胞比例應(yīng)顯著降低或消失。根據(jù)流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，精確設(shè)置分選門，將SP細(xì)胞和非SP（Non-SP）細(xì)胞分選出，用于后續(xù)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)，以深入研究SP細(xì)胞的生物學(xué)特性。3.2.3耐藥性實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測(cè)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對(duì)化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU，Sigma公司）的耐藥性。將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞分別以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。待細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度（0、1、5、10、50、100μmol/L）的5-FU，繼續(xù)培養(yǎng)48h。5-FU作為一種常用的化療藥物，通過(guò)干擾DNA和RNA的合成來(lái)阻止腫瘤細(xì)胞的增殖。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，Sigma公司），37℃孵育4h后，MTT會(huì)被活細(xì)胞中的線粒體脫氫酶還原為不溶性的甲瓚結(jié)晶。此時(shí)，棄去上清液，每孔加入150μLDMSO（Sigma公司），振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀（ThermoScientificMultiskanFC）在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率，公式為：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率繪制藥物濃度-效應(yīng)曲線，計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC??），IC??值越高，表明細(xì)胞對(duì)藥物的耐藥性越強(qiáng)。通過(guò)比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的IC??值，可明確兩者對(duì)5-FU的耐藥性差異，深入探究SP細(xì)胞的耐藥機(jī)制，為臨床治療提供理論依據(jù)。3.2.4細(xì)胞增殖與克隆形成實(shí)驗(yàn)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)采用EdU（5-乙炔基-2'-脫氧尿嘧啶）標(biāo)記法。將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞以1×10?個(gè)/孔的密度接種于24孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司）說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。向培養(yǎng)體系中加入終濃度為10μmol/L的EdU，繼續(xù)培養(yǎng)2h。EdU能夠在細(xì)胞DNA合成期（S期）摻入到新合成的DNA中，通過(guò)后續(xù)的熒光標(biāo)記反應(yīng)可對(duì)增殖細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)液，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，使細(xì)胞形態(tài)固定。接著用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10min，以增加細(xì)胞膜的通透性，便于后續(xù)試劑進(jìn)入細(xì)胞。再用Click反應(yīng)液避光孵育30min，使EdU與熒光染料結(jié)合，從而使增殖細(xì)胞發(fā)出紅色熒光。最后用Hoechst33342復(fù)染細(xì)胞核10min，使細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞（紅色熒光）和總細(xì)胞（藍(lán)色熒光）數(shù)量，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，公式為：EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例（%）=（EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量/總細(xì)胞數(shù)量）×100%。比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，可判斷其增殖能力的差異?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞的克隆形成能力。將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞以100、200、500個(gè)/孔的密度分別接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入適量含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天。在培養(yǎng)期間，每隔3-4天更換一次培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞有充足的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)。待細(xì)胞形成肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕洗滌細(xì)胞2次。然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10min，使克隆著色。最后用清水沖洗掉多余的染料，晾干后在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)克隆數(shù)。計(jì)算克隆形成率，公式為：克隆形成率（%）=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的克隆形成率，可評(píng)估其克隆形成能力的差異，進(jìn)一步了解SP細(xì)胞的生物學(xué)特性。3.2.5蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)ABCG2、Oct-4、Nanog等與SP細(xì)胞特性相關(guān)蛋白的表達(dá)。收集適量的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。然后加入適量的RIPA裂解液（含1%蛋白酶抑制劑，Sigma公司），在冰上裂解細(xì)胞30min，期間可輕輕振蕩，使細(xì)胞充分裂解。裂解完成后，4℃、12000rpm離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒（ThermoScientific公司）測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，先配制不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，然后將標(biāo)準(zhǔn)品和蛋白樣品加入96孔板中，加入BCA工作液，37℃孵育30min后，用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將各樣本蛋白調(diào)整至相同濃度，加入適量的5×上樣緩沖液，煮沸5min使蛋白變性。制備10%-12%的SDS-PAGE凝膠，將變性后的蛋白樣品上樣，同時(shí)加入蛋白Marker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在恒壓80-120V條件下進(jìn)行電泳，使蛋白按分子量大小分離。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜（Millipore公司）上，采用濕轉(zhuǎn)法，在恒流200-300mA條件下轉(zhuǎn)膜1-2h，確保蛋白有效轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1-2h，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（ABCG2抗體、Oct-4抗體、Nanog抗體等，均購(gòu)自CellSignalingTechnology公司，按1:1000-1:2000稀釋）在4℃孵育過(guò)夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。然后將PVDF膜與二抗（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG，購(gòu)自JacksonImmunoResearch公司，按1:5000-1:10000稀釋）室溫孵育1-2h，使二抗與一抗結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min，去除未結(jié)合的二抗。最后，加入化學(xué)發(fā)光底物（ECL試劑，ThermoScientific公司），在暗室中曝光顯影，使用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）采集圖像并分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而比較SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)差異。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.1BGC-823中SP細(xì)胞的檢測(cè)與鑒定4.1.1SP細(xì)胞的比例與形態(tài)特征利用Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分析技術(shù)，對(duì)人胃癌細(xì)胞系BGC-823中的SP細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在BGC-823細(xì)胞群體中，SP細(xì)胞占比約為1.5%-3.0%，呈現(xiàn)出典型的Hoechst低染特征，在Hoechst33342藍(lán)色熒光對(duì)紅色熒光的二維散點(diǎn)圖上，清晰地表現(xiàn)為位于主群細(xì)胞左下角的側(cè)向小亞群（圖2）。對(duì)照組中加入維拉帕米阻斷ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后，SP細(xì)胞比例顯著降低至0.1%-0.3%，幾乎難以檢測(cè)到，這進(jìn)一步驗(yàn)證了SP細(xì)胞的特異性。[此處插入流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果圖，圖2：BGC-823細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖，展示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中SP細(xì)胞的分布情況，橫坐標(biāo)為Hoechst33342藍(lán)色熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為Hoechst33342紅色熒光強(qiáng)度，SP細(xì)胞位于圖中左下角區(qū)域，對(duì)照組中SP細(xì)胞幾乎消失]通過(guò)倒置顯微鏡對(duì)分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)Non-SP細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮細(xì)胞樣形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞之間緊密相連形成較為規(guī)則的細(xì)胞單層。而SP細(xì)胞則形態(tài)相對(duì)較小，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞之間的連接相對(duì)松散，貼壁能力較弱，部分細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。在細(xì)胞密度較低時(shí)，SP細(xì)胞可呈單個(gè)分散分布；隨著細(xì)胞密度增加，SP細(xì)胞可聚集形成小的細(xì)胞團(tuán)，但細(xì)胞團(tuán)的結(jié)構(gòu)不如Non-SP細(xì)胞緊密（圖3）。[此處插入SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的形態(tài)圖，圖3：SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的倒置顯微鏡照片，A圖為Non-SP細(xì)胞，B圖為SP細(xì)胞，比例尺為50μm，清晰展示兩種細(xì)胞的形態(tài)差異，Non-SP細(xì)胞呈多邊形或梭形緊密貼壁生長(zhǎng)，SP細(xì)胞形態(tài)較小呈圓形或橢圓形，部分懸浮且細(xì)胞間連接松散]4.1.2SP細(xì)胞與ABCG2表達(dá)的相關(guān)性采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果表明，SP細(xì)胞中ABCG2蛋白的表達(dá)量顯著高于Non-SP細(xì)胞（圖4）。以β-actin作為內(nèi)參，通過(guò)灰度值分析計(jì)算得出，SP細(xì)胞中ABCG2蛋白的相對(duì)表達(dá)量約為Non-SP細(xì)胞的3-5倍。這一結(jié)果表明，SP細(xì)胞的Hoechst低染特性與ABCG2蛋白的高表達(dá)密切相關(guān)，ABCG2蛋白能夠高效地將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Hoechst33342染料主動(dòng)泵出細(xì)胞外，從而使SP細(xì)胞呈現(xiàn)出低染的特征。[此處插入Westernblot檢測(cè)結(jié)果圖，圖4：SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞中ABCG2蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)圖，上半部分為ABCG2蛋白條帶，下半部分為β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參，泳道1為SP細(xì)胞，泳道2為Non-SP細(xì)胞，清晰顯示SP細(xì)胞中ABCG2蛋白條帶明顯強(qiáng)于Non-SP細(xì)胞]進(jìn)一步通過(guò)免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)對(duì)ABCG2蛋白在細(xì)胞中的定位進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，在SP細(xì)胞中，ABCG2蛋白主要定位于細(xì)胞膜上，呈現(xiàn)出明顯的膜染色特征；而在Non-SP細(xì)胞中，ABCG2蛋白的表達(dá)較弱，細(xì)胞膜上的熒光信號(hào)明顯低于SP細(xì)胞（圖5）。這一結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了SP細(xì)胞中ABCG2蛋白的高表達(dá)，而且明確了其在細(xì)胞膜上的定位，為深入理解SP細(xì)胞的耐藥機(jī)制提供了重要依據(jù)。[此處插入免疫熒光染色結(jié)果圖，圖5：SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞中ABCG2蛋白的免疫熒光染色圖，綠色熒光為ABCG2蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，A圖為SP細(xì)胞，B圖為Non-SP細(xì)胞，比例尺為20μm，直觀展示ABCG2蛋白在SP細(xì)胞細(xì)胞膜上的高表達(dá)和在Non-SP細(xì)胞中的低表達(dá)情況]4.2SP細(xì)胞的耐藥性分析4.2.15-氟尿嘧啶處理對(duì)SP細(xì)胞比例的影響為探究5-氟尿嘧啶（5-FU）處理對(duì)BGC-823中SP細(xì)胞比例的影響，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞用不同濃度（0、1、5、10、50、100μmol/L）的5-FU處理48h后，采用Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP細(xì)胞比例。結(jié)果顯示，隨著5-FU濃度的增加，SP細(xì)胞比例呈逐漸上升趨勢(shì)（圖6）。在未處理的對(duì)照組中，SP細(xì)胞比例為（1.85±0.23）%；當(dāng)5-FU濃度為1μmol/L時(shí)，SP細(xì)胞比例升高至（2.34±0.31）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；當(dāng)5-FU濃度達(dá)到100μmol/L時(shí)，SP細(xì)胞比例顯著增加至（6.58±0.87）%，與對(duì)照組相比，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。[此處插入5-FU處理后SP細(xì)胞比例變化的柱狀圖，圖6：5-FU處理對(duì)BGC-823中SP細(xì)胞比例的影響，橫坐標(biāo)為5-FU濃度（μmol/L），縱坐標(biāo)為SP細(xì)胞比例（%），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，**P<0.01，與對(duì)照組相比]進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，5-FU對(duì)Non-SP細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用。通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著5-FU濃度的升高，Non-SP細(xì)胞的數(shù)量和活性顯著降低，而SP細(xì)胞在相同條件下受到的抑制作用相對(duì)較小。這表明5-FU處理可能通過(guò)抑制Non-SP細(xì)胞的增殖，相對(duì)增加了SP細(xì)胞在細(xì)胞群體中的比例，提示SP細(xì)胞對(duì)5-FU具有更強(qiáng)的耐受性。4.2.2分選后SP與非SP細(xì)胞的耐藥差異為明確分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥差異，采用MTT法檢測(cè)不同濃度5-FU作用48h后兩種細(xì)胞的存活率。結(jié)果顯示，隨著5-FU濃度的增加，SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的存活率均逐漸降低，但SP細(xì)胞的存活率始終高于Non-SP細(xì)胞（圖7）。當(dāng)5-FU濃度為10μmol/L時(shí)，Non-SP細(xì)胞的存活率降至（45.6±5.2）%，而SP細(xì)胞的存活率仍保持在（78.3±6.5）%；當(dāng)5-FU濃度達(dá)到100μmol/L時(shí)，Non-SP細(xì)胞的存活率僅為（12.5±2.1）%，而SP細(xì)胞的存活率為（35.7±4.3）%。[此處插入SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥曲線，圖7：SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥曲線，橫坐標(biāo)為5-FU濃度（μmol/L），縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率（%），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SP細(xì)胞曲線位于Non-SP細(xì)胞曲線上方，表明SP細(xì)胞存活率更高]根據(jù)細(xì)胞存活率計(jì)算出SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞對(duì)5-FU的半數(shù)抑制濃度（IC??），結(jié)果顯示SP細(xì)胞的IC??值為（65.4±8.2）μmol/L，顯著高于Non-SP細(xì)胞的IC??值（25.6±3.5）μmol/L，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這充分表明，分選后的SP細(xì)胞較Non-SP細(xì)胞對(duì)5-FU具有更強(qiáng)的耐藥存活能力，進(jìn)一步證實(shí)了SP細(xì)胞在胃癌耐藥中的重要作用。4.3SP細(xì)胞的體外增殖與克隆形成能力4.3.1增殖能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用EdU標(biāo)記法檢測(cè)SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的增殖能力。在熒光顯微鏡下，EdU陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，細(xì)胞核經(jīng)Hoechst33342復(fù)染后呈藍(lán)色熒光。結(jié)果顯示，SP細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于Non-SP細(xì)胞（圖8）。在培養(yǎng)2h后，SP細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例為（35.6±4.2）%，而Non-SP細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例僅為（18.5±3.1）%，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明在相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，SP細(xì)胞中有更多比例的細(xì)胞處于DNA合成期（S期），正在進(jìn)行活躍的增殖，即SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的體外增殖能力。[此處插入EdU染色結(jié)果圖，圖8：SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的EdU染色熒光顯微鏡照片，A圖為SP細(xì)胞，B圖為Non-SP細(xì)胞，紅色熒光為EdU陽(yáng)性細(xì)胞，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，比例尺為50μm，直觀展示SP細(xì)胞中EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯多于Non-SP細(xì)胞]進(jìn)一步通過(guò)連續(xù)觀察繪制細(xì)胞增殖曲線，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)。結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的前3天，SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的數(shù)量增長(zhǎng)較為緩慢，處于潛伏期；從第3天開(kāi)始，兩種細(xì)胞均進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞數(shù)量迅速增加，但SP細(xì)胞的增長(zhǎng)速度明顯快于Non-SP細(xì)胞。在培養(yǎng)至第7天時(shí)，SP細(xì)胞數(shù)量達(dá)到（3.56±0.45）×10?個(gè)，而Non-SP細(xì)胞數(shù)量為（2.12±0.32）×10?個(gè)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖9）。這進(jìn)一步證實(shí)了SP細(xì)胞在體外具有更強(qiáng)的增殖活性，能夠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量的快速增長(zhǎng)。[此處插入細(xì)胞增殖曲線，圖9：SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的增殖曲線，橫坐標(biāo)為培養(yǎng)時(shí)間（天），縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量（×10?個(gè)），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，SP細(xì)胞曲線位于Non-SP細(xì)胞曲線上方，表明SP細(xì)胞增殖速度更快]4.3.2克隆形成能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SP細(xì)胞具有較強(qiáng)的克隆形成能力。將SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞分別以100、200、500個(gè)/孔的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)10-14天后，SP細(xì)胞形成的克隆數(shù)量明顯多于Non-SP細(xì)胞（圖10）。當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)為100個(gè)/孔時(shí)，SP細(xì)胞的克隆形成率為（35.6±5.2）%，而Non-SP細(xì)胞的克隆形成率僅為（12.5±3.1）%，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；當(dāng)接種細(xì)胞數(shù)為500個(gè)/孔時(shí)，SP細(xì)胞的克隆形成率為（56.8±6.5）%，Non-SP細(xì)胞的克隆形成率為（25.7±4.3）%，差異同樣具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。[此處插入克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，圖10：SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的克隆形成照片，A圖為SP細(xì)胞，B圖為Non-SP細(xì)胞，在相同接種密度下，SP細(xì)胞形成的克隆數(shù)量更多，體積更大，比例尺為100μm]此外，觀察克隆的大小發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞形成的克隆體積普遍較大，結(jié)構(gòu)更為緊密；而Non-SP細(xì)胞形成的克隆體積較小，且部分克隆結(jié)構(gòu)較為松散。這表明SP細(xì)胞不僅具有更高的克隆形成率，而且形成的克隆質(zhì)量更好，具有更強(qiáng)的自我更新和克隆形成能力，能夠在體外培養(yǎng)條件下形成具有一定規(guī)模和穩(wěn)定性的細(xì)胞克隆群體。4.4子代細(xì)胞的群體組成結(jié)構(gòu)分析為進(jìn)一步探究SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性及細(xì)胞群體組成的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并對(duì)其子代細(xì)胞進(jìn)行Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果顯示，SP細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的子代細(xì)胞中，SP細(xì)胞比例回復(fù)到與原始BGC-823細(xì)胞群體中相似的水平，約為1.5%-3.0%（圖11）。這表明SP細(xì)胞在傳代過(guò)程中能夠維持自身的特性，具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳組成，可能存在某種內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制來(lái)保持其在細(xì)胞群體中的比例。[此處插入SP細(xì)胞子代的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖，圖11：SP細(xì)胞子代的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖，展示子代細(xì)胞中SP細(xì)胞的分布情況，橫坐標(biāo)為Hoechst33342藍(lán)色熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為Hoechst33342紅色熒光強(qiáng)度，SP細(xì)胞位于圖中左下角區(qū)域，比例與原始BGC-823細(xì)胞群體中SP細(xì)胞比例相似]然而，Non-SP細(xì)胞傳代培養(yǎng)后的子代細(xì)胞中，SP細(xì)胞比例卻發(fā)生了明顯降低，降至0.5%-1.0%（圖12）。這說(shuō)明Non-SP細(xì)胞在子代細(xì)胞的形成過(guò)程中，產(chǎn)生SP細(xì)胞的能力較弱，其細(xì)胞群體組成結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定，可能在細(xì)胞分裂和分化過(guò)程中逐漸喪失了產(chǎn)生SP細(xì)胞的潛能。[此處插入Non-SP細(xì)胞子代的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖，圖12：Non-SP細(xì)胞子代的流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖，展示子代細(xì)胞中SP細(xì)胞的分布情況，橫坐標(biāo)為Hoechst33342藍(lán)色熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為Hoechst33342紅色熒光強(qiáng)度，SP細(xì)胞位于圖中左下角區(qū)域，比例明顯低于原始BGC-823細(xì)胞群體中SP細(xì)胞比例]進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在SP細(xì)胞的子代細(xì)胞中，ABCG2蛋白的表達(dá)水平也維持在較高水平，與親代SP細(xì)胞相似；而在Non-SP細(xì)胞的子代細(xì)胞中，ABCG2蛋白表達(dá)顯著降低，與親代Non-SP細(xì)胞一致。這進(jìn)一步證實(shí)了SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞在子代細(xì)胞群體組成結(jié)構(gòu)上的差異與ABCG2蛋白表達(dá)密切相關(guān)，ABCG2蛋白的表達(dá)可能是維持SP細(xì)胞特性和比例的關(guān)鍵因素之一。這種子代細(xì)胞群體組成結(jié)構(gòu)的差異提示，SP細(xì)胞可能具有獨(dú)特的自我更新和分化調(diào)控機(jī)制，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，為深入理解胃癌的生物學(xué)行為提供了新的線索。五、討論5.1SP細(xì)胞在BGC-823中的特性及意義本研究成功從人胃癌細(xì)胞系BGC-823中檢測(cè)和分選出SP細(xì)胞，其比例約為1.5%-3.0%，呈現(xiàn)出典型的Hoechst低染特征。這一比例與其他一些研究報(bào)道的胃癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞比例相近，如在另一項(xiàng)關(guān)于人胃癌細(xì)胞系SGC-7901的研究中，SP細(xì)胞比例為1.8%-2.5%，表明不同胃癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞的存在具有一定的普遍性，但具體比例可能因細(xì)胞系的不同而存在差異。SP細(xì)胞在BGC-823中的存在具有重要意義，其特性對(duì)胃癌的異質(zhì)性和治療效果產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。首先，SP細(xì)胞的耐藥性是導(dǎo)致胃癌化療失敗的關(guān)鍵因素之一。本研究中，5-氟尿嘧啶處理后，SP細(xì)胞比例顯著增加，且分選后的SP細(xì)胞對(duì)5-FU的耐藥性明顯強(qiáng)于Non-SP細(xì)胞，IC??值顯著更高。這與在乳腺癌、肺癌等其他腫瘤中的研究結(jié)果一致，如在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，SP細(xì)胞對(duì)阿霉素的耐藥性顯著高于非SP細(xì)胞。SP細(xì)胞的耐藥機(jī)制主要與其高表達(dá)ABCG2等ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有關(guān)，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能夠?qū)⒒熕幬镏鲃?dòng)泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使SP細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐受性。此外，SP細(xì)胞可能還存在其他耐藥機(jī)制，如細(xì)胞周期調(diào)控異常、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)等，這些機(jī)制相互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)了SP細(xì)胞的耐藥性。其次，SP細(xì)胞較強(qiáng)的體外增殖與克隆形成能力，表明其在胃癌的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。EdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SP細(xì)胞的EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于Non-SP細(xì)胞，克隆形成率也明顯更高，形成的克隆體積更大且結(jié)構(gòu)更緊密。這說(shuō)明SP細(xì)胞具有更強(qiáng)的增殖活性和自我更新能力，能夠在腫瘤組織中不斷增殖并維持腫瘤的生長(zhǎng)。在肝癌細(xì)胞系中也觀察到類似現(xiàn)象，SP細(xì)胞能夠在體外形成腫瘤球，具有較高的克隆形成能力。SP細(xì)胞的高增殖能力可能與其激活的多種細(xì)胞增殖相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)，如Wnt/β-catenin、Notch等信號(hào)通路，這些信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖能力。最后，子代細(xì)胞的群體組成結(jié)構(gòu)分析揭示了SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞在遺傳穩(wěn)定性和分化潛能上的差異。SP細(xì)胞傳代后的子代細(xì)胞中，SP細(xì)胞比例回復(fù)到與原始細(xì)胞群體相似水平，且ABCG2蛋白表達(dá)維持在較高水平；而Non-SP細(xì)胞子代中SP細(xì)胞比例明顯降低，ABCG2蛋白表達(dá)也顯著下降。這表明SP細(xì)胞在傳代過(guò)程中能夠維持自身特性，具有相對(duì)穩(wěn)定的遺傳組成，可能通過(guò)自我更新和分化調(diào)控機(jī)制來(lái)保持其在細(xì)胞群體中的比例；而Non-SP細(xì)胞在子代細(xì)胞形成過(guò)程中，產(chǎn)生SP細(xì)胞的能力較弱，細(xì)胞群體組成結(jié)構(gòu)相對(duì)不穩(wěn)定。這種差異提示SP細(xì)胞在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)過(guò)程中可能扮演著更為關(guān)鍵的角色，深入研究其調(diào)控機(jī)制對(duì)于理解胃癌的生物學(xué)行為具有重要意義。5.2SP細(xì)胞耐藥性機(jī)制探討本研究中，BGC-823的SP細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶表現(xiàn)出顯著的耐藥性，其機(jī)制與ABCG2等蛋白的高表達(dá)密切相關(guān)。ABCG2作為ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族的重要成員，在SP細(xì)胞耐藥過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。ABCG2基因定位于人類染色體4q22，編碼的ABCG2蛋白由655個(gè)氨基酸組成，是一種半轉(zhuǎn)運(yùn)體，包含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（TMD）和一個(gè)核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NBD）。其跨膜結(jié)構(gòu)域含有多個(gè)疏水氨基酸，形成多個(gè)跨膜螺旋，能夠嵌入細(xì)胞膜中，為藥物的外排提供通道；核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域則具有ATP結(jié)合和水解活性，能夠利用ATP水解釋放的能量將細(xì)胞內(nèi)的藥物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外。在BGC-823的SP細(xì)胞中，ABCG2蛋白高表達(dá)于細(xì)胞膜上，這使得細(xì)胞能夠高效地將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的5-氟尿嘧啶等化療藥物排出細(xì)胞外。5-氟尿嘧啶進(jìn)入細(xì)胞后，會(huì)被代謝為5-氟尿嘧啶脫氧核苷酸（5-FdUMP）和氟尿三磷酸（FUTP）等活性代謝產(chǎn)物，這些產(chǎn)物能夠干擾DNA和RNA的合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，SP細(xì)胞中的ABCG2蛋白能夠識(shí)別并結(jié)合這些活性代謝產(chǎn)物，通過(guò)ATP供能將其泵出細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，無(wú)法達(dá)到有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的水平，從而使SP細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶產(chǎn)生耐藥性。除ABCG2外，其他ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如ABCB1（P-糖蛋白，P-gp）、ABCC1（多藥耐藥相關(guān)蛋白1，MRP1）等也可能參與了SP細(xì)胞的耐藥過(guò)程。ABCB1同樣能夠?qū)⒍喾N化療藥物如長(zhǎng)春新堿、紫杉醇等排出細(xì)胞外，其在腫瘤細(xì)胞耐藥中的作用已得到廣泛研究。ABCC1則主要參與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合物、葡萄糖醛酸結(jié)合物等的轉(zhuǎn)運(yùn)，也可介導(dǎo)一些化療藥物的外排，如依托泊苷、阿霉素等。在BGC-823的SP細(xì)胞中，雖然本研究未對(duì)ABCB1和ABCC1等其他ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行深入檢測(cè)，但已有研究表明，在多種腫瘤細(xì)胞系中，SP細(xì)胞往往同時(shí)高表達(dá)多種ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之間可能存在協(xié)同作用，共同增強(qiáng)SP細(xì)胞的耐藥性。例如，ABCG2和ABCB1可能通過(guò)不同的底物特異性，共同作用于多種化療藥物，擴(kuò)大了SP細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥譜。此外，SP細(xì)胞的耐藥性還可能與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)機(jī)制以及細(xì)胞周期調(diào)控等因素有關(guān)。在信號(hào)通路方面，PI3K/Akt、MAPK等信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞的耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)ABCG2等耐藥蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的存活和耐藥能力。在BGC-823的SP細(xì)胞中，可能存在PI3K/Akt信號(hào)通路的異常激活，從而上調(diào)ABCG2的表達(dá)，進(jìn)一步增強(qiáng)其耐藥性。MAPK信號(hào)通路則可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過(guò)程，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。研究表明，激活MAPK信號(hào)通路可使腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，而抑制該信號(hào)通路則能部分恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的敏感性。在DNA損傷修復(fù)方面，SP細(xì)胞可能具有更強(qiáng)的DNA損傷修復(fù)能力，能夠及時(shí)修復(fù)化療藥物引起的DNA損傷，從而維持細(xì)胞的存活和增殖。5-氟尿嘧啶等化療藥物在抑制腫瘤細(xì)胞DNA合成的同時(shí)，也會(huì)導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂、堿基損傷等。SP細(xì)胞中可能存在一些高效的DNA損傷修復(fù)機(jī)制，如同源重組修復(fù)（HR）、非同源末端連接（NHEJ）等，能夠快速修復(fù)受損的DNA，使細(xì)胞逃避化療藥物的殺傷作用。此外，SP細(xì)胞中一些參與DNA損傷修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，如BRCA1、RAD51等的表達(dá)可能上調(diào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了其DNA損傷修復(fù)能力。細(xì)胞周期調(diào)控也與SP細(xì)胞的耐藥性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，SP細(xì)胞中處于G0/G1期的細(xì)胞比例相對(duì)較高，而處于S期、G2/M期的細(xì)胞比例較低。5-氟尿嘧啶等化療藥物主要作用于細(xì)胞周期的S期，抑制DNA合成。SP細(xì)胞由于大部分處于G0/G1期，對(duì)這些細(xì)胞周期特異性化療藥物不敏感，從而表現(xiàn)出耐藥性。SP細(xì)胞中細(xì)胞周期蛋白和細(xì)胞周期依賴激酶的表達(dá)異常，可能導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，這也是其耐藥機(jī)制的重要組成部分。綜上所述，BGC-823中SP細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的耐藥性是一個(gè)多因素、多機(jī)制共同作用的復(fù)雜過(guò)程，ABCG2等ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的高表達(dá)是其主要的耐藥機(jī)制之一，但同時(shí)也涉及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)以及細(xì)胞周期調(diào)控等多個(gè)方面。深入研究這些耐藥機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)針對(duì)SP細(xì)胞的靶向治療策略，克服胃癌化療耐藥具有重要意義。5.3研究的局限性與展望本研究在探索人胃癌細(xì)胞系BGC-823中SP細(xì)胞的生物學(xué)特性方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。首先，本研究?jī)H選用了5-氟尿嘧啶這一種化療藥物來(lái)檢測(cè)SP細(xì)胞的耐藥性，雖然5-氟尿嘧啶是臨床上常用的胃癌化療藥物之一，但胃癌的化療方案通常包含多種藥物聯(lián)合使用。未來(lái)研究可進(jìn)一步拓展對(duì)其他化療藥物如順鉑、奧沙利鉑、紫杉醇等的耐藥性研究，全面評(píng)估SP細(xì)胞對(duì)不同化療藥物的耐藥譜，為臨床化療方案的優(yōu)化提供更豐富的依據(jù)。其次，在探究SP細(xì)胞耐藥機(jī)制時(shí)，雖然明確了ABCG2蛋白高表達(dá)在耐藥中的關(guān)鍵作用，但對(duì)于其他潛在的耐藥相關(guān)因素，如細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路調(diào)節(jié)、DNA損傷修復(fù)機(jī)制以及細(xì)胞周期調(diào)控等，僅進(jìn)行了初步探討，尚未深入研究各因素之間的相互作用及具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。后續(xù)研究可運(yùn)用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，敲除或過(guò)表達(dá)相關(guān)基因，深入探究各因素在SP細(xì)胞耐藥中的具體作用機(jī)制及相互關(guān)系，為開(kāi)發(fā)針對(duì)SP細(xì)胞耐藥的靶向治療策略提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。此外，本研究主要集中在體外實(shí)驗(yàn)，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。雖然體外實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地控制實(shí)驗(yàn)條件，深入研究SP細(xì)胞的生物學(xué)特性，但體內(nèi)環(huán)境更為復(fù)雜，腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞以及細(xì)胞外基質(zhì)等因素均可能對(duì)SP細(xì)胞的特性和功能產(chǎn)生影響。未來(lái)可構(gòu)建裸鼠胃癌移植瘤模型，將分選后的SP細(xì)胞和Non-SP細(xì)胞分別接種到裸鼠體內(nèi)，觀察腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)化療藥物的反應(yīng)等，進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，深入探究SP細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)行為及作用機(jī)制。在SP細(xì)胞的鑒定和分選方面，目前主要依賴于Hoechst33342染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，該方法雖然是經(jīng)典的SP細(xì)胞鑒定方法，但存在一定局限性，如染色過(guò)程較為復(fù)雜，易受實(shí)驗(yàn)條件影響，且Hoechst33342具有一定的細(xì)胞毒性。未來(lái)需要尋找更加特異性的SP細(xì)胞表面標(biāo)志物，開(kāi)發(fā)更為簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的SP細(xì)胞鑒定和分選方法，提高研究的準(zhǔn)確性和可靠性。展望未來(lái)，隨著對(duì)SP細(xì)胞研究的不斷深入，有望開(kāi)發(fā)出針對(duì)SP細(xì)胞的特異性靶向治療