不同強(qiáng)度超聲對鈦合金支架材料內(nèi)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響探究一、引言1.1研究背景與意義在骨修復(fù)領(lǐng)域，鈦合金憑借其優(yōu)異的性能，如較低的彈性模量、良好的耐腐蝕性和生物相容性，成為目前生物醫(yī)用金屬材料的首選，被廣泛應(yīng)用于骨移植、骨融合等手術(shù)中，是骨科常用的促進(jìn)骨再生的重要材料。據(jù)統(tǒng)計，世界范圍內(nèi)每年進(jìn)行超過200萬例骨移植手術(shù)，鈦合金支架在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。然而，鈦合金支架在應(yīng)用中仍面臨一些挑戰(zhàn)，其中骨整合問題尤為突出。由于鈦合金表面的化學(xué)惰性，成骨細(xì)胞難以在其表面有效貼合生長，且合金中的某些元素（如鋁和釩）可能具有細(xì)胞毒性，這常導(dǎo)致支架與周圍新生骨的骨長入和骨整合失敗，影響了骨修復(fù)的效果和患者的康復(fù)進(jìn)程。為了解決骨整合問題，眾多學(xué)者進(jìn)行了大量研究。其中，超聲作為一種物理治療手段，在促進(jìn)骨愈合方面展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價值，逐漸成為研究熱點。自1952年意大利Corradic發(fā)現(xiàn)持續(xù)低強(qiáng)度超聲治療兔橈骨骨折可促進(jìn)骨痂形成以來，國際上對超聲在促進(jìn)骨愈合和骨融合方面的研究持續(xù)不斷，并取得了一定進(jìn)展。大量研究表明，超聲能夠?qū)墙M織產(chǎn)生多種作用，從而促進(jìn)骨愈合。在細(xì)胞學(xué)水平，超聲可以改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)鈣離子和軟骨、骨細(xì)胞的結(jié)合，使第二信使的活性增高，加速骨膠原的合成和鈣化；還能刺激軟骨細(xì)胞中聚居基因（aggrecangene）的表達(dá)，該基因在骨和軟骨糖蛋白的形成中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)的增強(qiáng)與組織結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的增加直接相關(guān)。在整體水平，超聲能夠促進(jìn)骨痂形成，加快皮質(zhì)骨橋通過截骨處的速度，從而縮短骨折愈合時間。有研究應(yīng)用低強(qiáng)度超聲處理兔四肢遠(yuǎn)端閉合性骨折，發(fā)現(xiàn)骨折愈合時間可縮短1/3。此外，超聲還能改善局部血供，有利于營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和細(xì)胞向骨折部位轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝產(chǎn)物的清除，為骨愈合創(chuàng)造良好的微環(huán)境。然而，目前關(guān)于超聲促進(jìn)骨愈合的研究中，不同研究采用的超聲參數(shù)（如頻率、強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖頻率等）差異較大，導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定的不一致性，難以確定最佳的超聲治療方案。并且，針對不同強(qiáng)度超聲對鈦合金支架內(nèi)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為影響的系統(tǒng)性研究相對較少，這限制了超聲在鈦合金支架骨修復(fù)應(yīng)用中的進(jìn)一步發(fā)展和優(yōu)化。因此，深入研究不同強(qiáng)度超聲對鈦合金支架內(nèi)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響具有重要的理論和實際意義。從理論角度來看，探究不同強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞增殖、分化、礦化等生物學(xué)行為的影響機(jī)制，有助于進(jìn)一步揭示超聲促進(jìn)骨愈合的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制，豐富骨組織工程和生物力學(xué)的理論體系，為后續(xù)的相關(guān)研究提供更堅實的理論基礎(chǔ)。從實際應(yīng)用角度出發(fā)，明確不同強(qiáng)度超聲對鈦合金支架內(nèi)成骨細(xì)胞的作用效果，能夠為臨床選擇合適的超聲治療參數(shù)提供科學(xué)依據(jù)，優(yōu)化骨修復(fù)治療方案，提高鈦合金支架的骨整合效率，促進(jìn)患者的骨折愈合和康復(fù)，具有重要的臨床應(yīng)用價值和社會效益。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在鈦合金支架材料的研究方面，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量工作。鈦合金因其優(yōu)異的性能，如良好的生物相容性、較高的強(qiáng)度-質(zhì)量比和耐腐蝕性，在骨修復(fù)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。在口腔修復(fù)支架中，鈦合金逐漸取代傳統(tǒng)的鈷鉻合金、鎳鎘合金等，因為其對口腔黏膜細(xì)胞的不良反應(yīng)更小。在血管支架應(yīng)用中，新型鈦合金不僅不含鋁、釩等有害元素，還具備良好的力學(xué)相容性和血液相容性。在骨修復(fù)3D打印領(lǐng)域，鈦合金也是首選材料之一，通過3D打印技術(shù)可以制備出具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的支架，以滿足不同骨缺損的修復(fù)需求。然而，鈦合金支架仍存在一些問題。例如，傳統(tǒng)的Ti-6Al-4V合金中，鋁和釩元素可能對人體產(chǎn)生潛在危害，如鋁離子可能導(dǎo)致患者骨軟化癥以及老年癡呆，釩離子可引起周圍神經(jīng)組織的病變。并且，鈦合金表面的化學(xué)惰性使得成骨細(xì)胞難以在其表面有效貼合生長，這在一定程度上影響了支架與周圍新生骨的骨長入和骨整合。超聲促進(jìn)骨愈合的研究由來已久。自1952年意大利Corradic發(fā)現(xiàn)持續(xù)低強(qiáng)度超聲治療兔橈骨骨折可促進(jìn)骨痂形成以來，眾多學(xué)者圍繞超聲促進(jìn)骨愈合展開了深入研究。研究表明，超聲能夠促進(jìn)骨痂形成，加快皮質(zhì)骨橋通過截骨處的速度，從而縮短骨折愈合時間。有學(xué)者應(yīng)用低強(qiáng)度超聲處理兔四肢遠(yuǎn)端閉合性骨折，發(fā)現(xiàn)骨折愈合時間可縮短1/3。超聲還能改善局部血供，有利于營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子和細(xì)胞向骨折部位轉(zhuǎn)運(yùn)以及代謝產(chǎn)物的清除，為骨愈合創(chuàng)造良好的微環(huán)境。在細(xì)胞學(xué)水平，超聲可以改變細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)鈣離子和軟骨、骨細(xì)胞的結(jié)合，使第二信使的活性增高，加速骨膠原的合成和鈣化；還能刺激軟骨細(xì)胞中聚居基因（aggrecangene）的表達(dá)，該基因在骨和軟骨糖蛋白的形成中起關(guān)鍵作用，其表達(dá)的增強(qiáng)與組織結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的增加直接相關(guān)。關(guān)于超聲對成骨細(xì)胞作用機(jī)制的研究，目前認(rèn)為主要涉及機(jī)械效應(yīng)、溫?zé)嵝?yīng)和理化效應(yīng)。按照Wolff定律，骨組織按照其所受應(yīng)力塑型，超聲為機(jī)體組織吸收后可產(chǎn)生機(jī)械震蕩效應(yīng)，微細(xì)的按摩效應(yīng)，相當(dāng)于局部參與一個力的刺激作用。機(jī)械能被吸收后又可轉(zhuǎn)化為熱能，雖然溫度改變微?。ǎ?℃），但某些酶（如膠原酶）對溫度的改變十分敏感，因此可以通過增加酶的活性來影響細(xì)胞的代謝活動，而且局部溫度的升高可刺激新生骨組織的生成。超聲還能產(chǎn)生聲化學(xué)效應(yīng)，在骨組織中產(chǎn)生空化效應(yīng)，形成微氣泡和自由基，這些化學(xué)物質(zhì)可以影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)。相關(guān)研究還發(fā)現(xiàn)，超聲可以激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化和增殖；增加轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)，Runx2是成骨細(xì)胞分化和成熟的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子；刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白I型和非膠原蛋白，這些蛋白質(zhì)是骨基質(zhì)的主要成分；促進(jìn)堿性磷酸酶（ALP）活性，ALP是骨基質(zhì)礦化的關(guān)鍵酶。盡管在鈦合金支架材料以及超聲促進(jìn)骨愈合方面取得了一定的研究成果，但當(dāng)前研究仍存在一些不足。在超聲促進(jìn)骨愈合的研究中，不同研究采用的超聲參數(shù)（如頻率、強(qiáng)度、脈沖寬度、脈沖頻率等）差異較大，導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定的不一致性，難以確定最佳的超聲治療方案。針對不同強(qiáng)度超聲對鈦合金支架內(nèi)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為影響的系統(tǒng)性研究相對較少，對于不同強(qiáng)度超聲如何影響成骨細(xì)胞在鈦合金支架上的增殖、分化、礦化等過程，以及相關(guān)的分子機(jī)制尚不完全清楚。本研究將聚焦于不同強(qiáng)度超聲對鈦合金支架內(nèi)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，通過系統(tǒng)研究，明確不同強(qiáng)度超聲的作用效果及機(jī)制，為臨床選擇合適的超聲治療參數(shù)提供科學(xué)依據(jù)，彌補(bǔ)當(dāng)前研究的不足。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1鈦合金支架材料特性2.1.1化學(xué)成分與結(jié)構(gòu)鈦合金是在純鈦的基礎(chǔ)上添加其他元素組成的合金。在骨修復(fù)領(lǐng)域，Ti6Al4V是最為常見的鈦合金支架材料之一。其主要化學(xué)成分包括約90%的鈦（Ti），這是合金的基礎(chǔ)金屬，賦予了材料良好的生物相容性和耐腐蝕性。鋁（Al）含量約為6%，鋁在合金中起到固溶強(qiáng)化的作用，能夠顯著提高合金的強(qiáng)度和硬度，同時還能減少合金的密度。釩（V）含量約為4%，釩的主要作用是穩(wěn)定鈦的β相，增強(qiáng)合金的韌性和熱穩(wěn)定性，使其在高溫下仍能保持良好的機(jī)械性能。此外，Ti6Al4V合金中還含有少量的雜質(zhì)元素，如氮（N）含量≤0.05%，碳（C）含量≤0.08%，氫（H）含量≤0.015%，鐵（Fe）含量≤0.40%，氧（O）含量≤0.20%，這些雜質(zhì)元素的含量雖然較低，但對合金的性能也會產(chǎn)生一定的影響。從晶體結(jié)構(gòu)來看，Ti6Al4V合金通常呈現(xiàn)出α+β兩相組織。其中，α相為密排六方結(jié)構(gòu)（HCP），具有較高的強(qiáng)度和耐腐蝕性。β相為體心立方結(jié)構(gòu)（BCC），主要提供較好的塑性。在合金中，α相和β相的比例、相界面結(jié)構(gòu)以及相變溫度等因素對合金的性能起著至關(guān)重要的作用。例如，通過調(diào)整合金的熱處理工藝，可以改變α相和β相的比例和分布，從而優(yōu)化合金的組織結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改善合金的綜合力學(xué)性能。在高溫下，合金主要以β相存在，隨著溫度的降低，β相逐漸向α相轉(zhuǎn)變，形成α+β兩相組織。這種相變過程會影響合金的強(qiáng)度、硬度、塑性等性能。2.1.2生物相容性與力學(xué)性能鈦合金支架材料具有良好的生物相容性，這是其能夠在骨修復(fù)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的重要原因之一。在與宿主細(xì)胞相互作用時，鈦合金表面能夠與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白相互吸附，為細(xì)胞的黏附提供了基礎(chǔ)。研究表明，成骨細(xì)胞能夠在鈦合金表面較好地黏附、鋪展和增殖。鈦合金表面的化學(xué)性質(zhì)和微觀結(jié)構(gòu)對細(xì)胞的黏附行為有重要影響。表面粗糙度適宜的鈦合金能夠增加細(xì)胞與材料的接觸面積，促進(jìn)細(xì)胞的黏附。同時，鈦合金表面的氧化膜具有良好的穩(wěn)定性和生物惰性，能夠防止合金中的金屬離子釋放到周圍組織中，減少對細(xì)胞的毒性作用，降低機(jī)體的免疫反應(yīng)，使得鈦合金支架在體內(nèi)能夠長期穩(wěn)定存在。在力學(xué)性能方面，鈦合金支架材料在人體力學(xué)環(huán)境中需要承受多種力的作用，如壓力、拉力、剪切力等。以Ti6Al4V合金為例，其具有較高的強(qiáng)度，抗拉強(qiáng)度可達(dá)895-930MPa，經(jīng)過熱處理后可提升至1100MPa以上，屈服強(qiáng)度約為880MPa，經(jīng)過熱處理可達(dá)到950MPa，這使其能夠在骨修復(fù)過程中為骨組織提供足夠的支撐，承受人體日?；顒赢a(chǎn)生的力學(xué)負(fù)荷，如行走、站立時骨骼所承受的壓力等。同時，該合金還具有良好的延展性，延伸率約為10-15%，這意味著材料在承受較大應(yīng)力時能夠發(fā)生一定程度的形變而不易斷裂，適應(yīng)骨骼在生理活動中的微小變形。此外，鈦合金的彈性模量約為113GPa，雖然高于人體骨骼的彈性模量（10-30GPa），但相比傳統(tǒng)的不銹鋼等金屬材料，其彈性模量更接近人體骨骼，能夠有效減少“應(yīng)力屏蔽”效應(yīng)，即減少因植入材料與骨組織彈性模量差異過大，導(dǎo)致骨組織承受的應(yīng)力減少，進(jìn)而引起骨吸收和骨量丟失的問題，有利于骨組織的正常生長和修復(fù)。2.2成骨細(xì)胞生物學(xué)行為概述2.2.1成骨細(xì)胞的分化與增殖成骨細(xì)胞起源于骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs），這是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下，能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞類型。間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化是一個復(fù)雜且有序的過程，受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號通路的精確調(diào)控。其中，核心結(jié)合因子α1（Cbfa1），也稱為Runx2，在成骨細(xì)胞分化過程中起著關(guān)鍵作用。Runx2能夠啟動成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)，如堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）和I型膠原蛋白（ColI）等，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMPs）信號通路在這一過程中也發(fā)揮著重要作用。BMPs與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的Smad蛋白，Smad蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，與Runx2等轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同調(diào)控成骨相關(guān)基因的表達(dá)，推動成骨細(xì)胞的分化進(jìn)程。當(dāng)成骨細(xì)胞完成分化后，便進(jìn)入增殖階段。在增殖過程中，成骨細(xì)胞通過有絲分裂不斷增加細(xì)胞數(shù)量，為后續(xù)的骨形成提供足夠的細(xì)胞基礎(chǔ)。細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）在成骨細(xì)胞增殖調(diào)控中扮演著重要角色。Cyclins與CDKs形成復(fù)合物，激活CDKs的激酶活性，驅(qū)動細(xì)胞周期的進(jìn)程。例如，CyclinD1與CDK4/6結(jié)合，促進(jìn)成骨細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，開始DNA合成，從而實現(xiàn)細(xì)胞增殖。生長因子如胰島素樣生長因子（IGFs）、血小板衍生生長因子（PDGF）等也對成骨細(xì)胞的增殖具有重要影響。IGFs能夠與成骨細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的PI3K-Akt和MAPK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)，加速成骨細(xì)胞的增殖。PDGF則可以刺激成骨細(xì)胞的遷移和增殖，增加細(xì)胞外基質(zhì)的合成，為骨形成創(chuàng)造有利條件。此外，細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分以及力學(xué)環(huán)境等因素也會影響成骨細(xì)胞的增殖。ECM中的膠原蛋白、纖連蛋白等成分可以與成骨細(xì)胞表面的整合素受體相互作用，激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和分化。適當(dāng)?shù)牧W(xué)刺激，如拉伸、壓縮等，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化。根據(jù)Wolff定律，骨組織會根據(jù)其所承受的力學(xué)刺激進(jìn)行適應(yīng)性重塑，力學(xué)刺激可以通過激活成骨細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械敏感離子通道、細(xì)胞骨架等結(jié)構(gòu)，引發(fā)一系列的信號傳導(dǎo)事件，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和骨基質(zhì)的合成。2.2.2成骨細(xì)胞與骨形成在骨形成過程中，成骨細(xì)胞發(fā)揮著核心作用，主要通過合成和分泌骨基質(zhì)以及促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化來實現(xiàn)骨的形成和重建。成骨細(xì)胞首先合成并分泌大量的骨基質(zhì)成分，其中最主要的是I型膠原蛋白，約占骨基質(zhì)有機(jī)成分的90%。I型膠原蛋白由成骨細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，然后通過高爾基體分泌到細(xì)胞外，在細(xì)胞外空間組裝成膠原纖維。這些膠原纖維相互交織，形成了骨基質(zhì)的基本框架，為后續(xù)的礦化過程提供了結(jié)構(gòu)支撐。除了I型膠原蛋白，成骨細(xì)胞還分泌多種非膠原蛋白，如骨鈣素、骨橋蛋白、纖連蛋白等。骨鈣素是一種維生素K依賴的蛋白質(zhì)，能夠與鈣離子結(jié)合，在骨礦化過程中發(fā)揮重要作用，它可以調(diào)節(jié)羥磷灰石晶體的生長和聚集，促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。骨橋蛋白具有細(xì)胞黏附特性，能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞與骨基質(zhì)的黏附，同時還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。纖連蛋白則在細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用中起橋梁作用，有助于維持骨組織的結(jié)構(gòu)完整性。隨著骨基質(zhì)的不斷合成和分泌，成骨細(xì)胞開始促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化過程。這一過程涉及到多種酶和離子的參與。堿性磷酸酶（ALP）是成骨細(xì)胞分泌的一種關(guān)鍵酶，它能夠水解磷酸酯，釋放出無機(jī)磷，提高局部的磷酸根離子濃度。同時，成骨細(xì)胞還通過細(xì)胞膜上的鈣離子通道攝取細(xì)胞外的鈣離子，使得局部的鈣離子和磷酸根離子濃度達(dá)到一定水平，滿足羥磷灰石晶體形成的條件。在合適的條件下，鈣離子和磷酸根離子結(jié)合形成羥磷灰石晶體，這些晶體逐漸沉積在膠原纖維上，使骨基質(zhì)發(fā)生礦化，從而形成堅硬的骨組織。成骨細(xì)胞還可以通過分泌一些礦化調(diào)節(jié)因子，如骨涎蛋白、基質(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白等，來精細(xì)調(diào)控礦化過程的起始、速率和方向。例如，基質(zhì)γ-羧基谷氨酸蛋白能夠抑制羥磷灰石晶體的生長，防止礦化過度，維持骨組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在骨形成過程中，成骨細(xì)胞的活性和功能狀態(tài)會不斷發(fā)生變化。隨著骨基質(zhì)的礦化逐漸完成，部分成骨細(xì)胞會被包埋在礦化的骨基質(zhì)中，轉(zhuǎn)變?yōu)楣羌?xì)胞。骨細(xì)胞通過其細(xì)長的細(xì)胞突起與周圍的骨細(xì)胞和骨表面的成骨細(xì)胞相互連接，形成一個復(fù)雜的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，參與骨組織的代謝和力學(xué)感知，對維持骨組織的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。而另一部分成骨細(xì)胞則可能轉(zhuǎn)變?yōu)楣且r里細(xì)胞，覆蓋在骨表面，保持相對靜止?fàn)顟B(tài)，當(dāng)骨組織受到刺激時，它們可以重新激活，參與骨的重塑過程。2.3超聲生物學(xué)效應(yīng)原理2.3.1機(jī)械效應(yīng)超聲作為一種機(jī)械波，在介質(zhì)中傳播時會引發(fā)機(jī)械振動，這種振動對細(xì)胞和組織有著多方面的作用。當(dāng)超聲作用于細(xì)胞時，會產(chǎn)生周期性的壓力變化，導(dǎo)致細(xì)胞受到拉伸和壓縮力的交替作用。這種機(jī)械刺激能夠引起細(xì)胞形態(tài)的改變。在低強(qiáng)度超聲作用下，成骨細(xì)胞可能會發(fā)生形態(tài)上的輕微伸展，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)也會相應(yīng)地進(jìn)行調(diào)整，以適應(yīng)這種外力作用。有研究表明，在頻率為1MHz、聲強(qiáng)為50mW/cm2的超聲作用下，成骨細(xì)胞的形態(tài)會逐漸從圓形向梭形轉(zhuǎn)變，細(xì)胞的鋪展面積增大，這可能是由于細(xì)胞為了更好地分散超聲帶來的應(yīng)力，通過改變形態(tài)來增強(qiáng)自身的穩(wěn)定性。超聲產(chǎn)生的機(jī)械振動還會影響細(xì)胞膜的通透性。細(xì)胞膜是細(xì)胞與外界環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的重要屏障，其通透性的改變會對細(xì)胞的生理功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在超聲的作用下，細(xì)胞膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性會發(fā)生變化。例如，超聲能夠促使細(xì)胞膜上的鈣離子通道開放，使細(xì)胞外的鈣離子大量內(nèi)流。鈣離子作為細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，其濃度的升高會激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，如Ca2?-CaM激酶通路。該通路的激活可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)和酶的活性，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和基因表達(dá)等生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，在適當(dāng)強(qiáng)度的超聲刺激下，成骨細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度在短時間內(nèi)可升高數(shù)倍，這為后續(xù)的細(xì)胞生物學(xué)過程提供了重要的信號基礎(chǔ)。此外，超聲的機(jī)械效應(yīng)還可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的位移和變形。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，其正常的結(jié)構(gòu)和功能對于細(xì)胞的生存和代謝至關(guān)重要。在超聲作用下，線粒體可能會發(fā)生位移，其內(nèi)部的嵴結(jié)構(gòu)也可能會出現(xiàn)一定程度的變形。這種變化可能會影響線粒體的呼吸功能和ATP合成效率。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成的重要場所，超聲的機(jī)械作用也可能干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能，影響蛋白質(zhì)的合成和折疊過程。然而，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器對超聲機(jī)械效應(yīng)的響應(yīng)機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，明確這些機(jī)制將有助于更全面地理解超聲對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。2.3.2熱效應(yīng)超聲在介質(zhì)中傳播時，其能量會部分轉(zhuǎn)化為熱能，這就是超聲的熱效應(yīng)。熱效應(yīng)的產(chǎn)生源于超聲的機(jī)械振動使介質(zhì)中的分子產(chǎn)生劇烈的摩擦和碰撞。當(dāng)超聲作用于細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)的水分子、蛋白質(zhì)分子等會隨著超聲的振動而快速運(yùn)動，分子間的摩擦和碰撞加劇，從而使部分超聲能量轉(zhuǎn)化為熱能，導(dǎo)致細(xì)胞溫度升高。這種溫度變化對細(xì)胞代謝和功能有著重要影響。在細(xì)胞代謝方面，適度的溫度升高可以加速細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速率。酶作為細(xì)胞內(nèi)化學(xué)反應(yīng)的催化劑，其活性對溫度十分敏感。一般來說，在一定溫度范圍內(nèi)，溫度每升高10℃，酶促反應(yīng)速率可提高1-2倍。在超聲熱效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞溫度升高的情況下，參與細(xì)胞代謝的酶活性增強(qiáng)，如參與糖代謝的己糖激酶、磷酸果糖激酶等，這些酶活性的提高能夠加速細(xì)胞內(nèi)的糖酵解和三羧酸循環(huán)過程，為細(xì)胞提供更多的能量ATP，滿足細(xì)胞在增殖、分化等過程中對能量的需求。然而，當(dāng)超聲強(qiáng)度過高，導(dǎo)致細(xì)胞溫度過度升高時，酶的結(jié)構(gòu)可能會遭到破壞，發(fā)生變性失活。例如，當(dāng)細(xì)胞溫度超過45℃時，許多酶的活性中心結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變，使其無法與底物正常結(jié)合，從而失去催化活性，進(jìn)而嚴(yán)重影響細(xì)胞的代謝過程，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。不同強(qiáng)度的超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)存在顯著差異。低強(qiáng)度超聲（如聲強(qiáng)低于1W/cm2）作用時，由于轉(zhuǎn)化的熱能較少，細(xì)胞溫度升高幅度較小，一般在1-2℃以內(nèi)。這種輕度的溫度升高對細(xì)胞的影響相對較小，主要通過適度增強(qiáng)酶活性來促進(jìn)細(xì)胞的代謝和功能。在低強(qiáng)度超聲刺激下，成骨細(xì)胞內(nèi)參與骨基質(zhì)合成的酶活性增強(qiáng)，促進(jìn)了I型膠原蛋白等骨基質(zhì)成分的合成，有利于骨形成。而高強(qiáng)度超聲（如聲強(qiáng)高于10W/cm2）作用時，會產(chǎn)生大量的熱能，使細(xì)胞溫度迅速大幅升高。若細(xì)胞溫度在短時間內(nèi)升高超過5℃，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)會受到嚴(yán)重破壞。細(xì)胞膜的流動性和完整性也會受到影響，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性異常增加，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)大量外流，細(xì)胞的正常生理功能無法維持，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。因此，在利用超聲治療疾病或進(jìn)行細(xì)胞實驗時，需要嚴(yán)格控制超聲強(qiáng)度，以避免過度的熱效應(yīng)對細(xì)胞造成損傷。2.3.3空化效應(yīng)空化效應(yīng)是超聲作用于液體介質(zhì)時產(chǎn)生的一種特殊物理現(xiàn)象。當(dāng)超聲在液體中傳播時，會引起液體中壓力的周期性變化。在超聲的負(fù)壓相，液體中的壓力急劇降低，當(dāng)壓力降低到一定程度時，液體中原本存在的微小氣泡（如空化核）會迅速膨脹、生長。隨著超聲的繼續(xù)作用，在隨后的正壓相，氣泡又會受到壓縮而急劇收縮。當(dāng)氣泡收縮到一定程度時，會發(fā)生崩潰，這一過程即為空化效應(yīng)。在氣泡崩潰的瞬間，會產(chǎn)生極高的溫度（可達(dá)數(shù)千攝氏度）和壓力（可達(dá)數(shù)百個大氣壓），同時還會伴隨產(chǎn)生強(qiáng)烈的沖擊波和微射流。空化效應(yīng)對細(xì)胞的影響機(jī)制較為復(fù)雜。首先，沖擊波和微射流會對細(xì)胞產(chǎn)生直接的機(jī)械損傷。強(qiáng)烈的沖擊波能夠作用于細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜發(fā)生破裂，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，細(xì)胞的完整性遭到破壞。微射流則可能直接沖擊細(xì)胞，造成細(xì)胞的變形甚至破裂。在高強(qiáng)度超聲作用下，空化效應(yīng)產(chǎn)生的沖擊波和微射流可使大量成骨細(xì)胞受損，細(xì)胞存活率顯著降低。其次，空化效應(yīng)產(chǎn)生的高溫高壓環(huán)境會引發(fā)一系列的物理和化學(xué)反應(yīng)。在高溫高壓下，水分子會發(fā)生分解，產(chǎn)生自由基，如羥基自由基（?OH）和氫自由基（?H）。這些自由基具有很強(qiáng)的氧化活性，能夠與細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能受損。自由基與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，影響細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號傳遞。自由基還可能攻擊細(xì)胞核內(nèi)的DNA，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、基因突變等，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖、分化和遺傳穩(wěn)定性。此外，空化效應(yīng)還可能通過影響細(xì)胞周圍的微環(huán)境來間接影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。空化效應(yīng)產(chǎn)生的沖擊波和微射流會改變細(xì)胞周圍液體的流動狀態(tài)和物質(zhì)分布，影響營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物在細(xì)胞周圍的擴(kuò)散和交換。如果營養(yǎng)物質(zhì)無法及時供應(yīng)到細(xì)胞，或者代謝產(chǎn)物不能及時排出，會影響細(xì)胞的正常代謝和功能。空化效應(yīng)還可能使細(xì)胞周圍的生長因子、信號分子等的分布和活性發(fā)生改變，干擾細(xì)胞的信號傳導(dǎo)通路，從而對細(xì)胞的增殖、分化等過程產(chǎn)生影響。空化效應(yīng)對細(xì)胞的影響是多方面的，其作用效果與超聲的參數(shù)（如頻率、強(qiáng)度、脈沖寬度等）以及細(xì)胞所處的環(huán)境密切相關(guān)，深入研究空化效應(yīng)對細(xì)胞的影響機(jī)制對于合理利用超聲治療具有重要意義。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗材料準(zhǔn)備3.1.1鈦合金支架的選擇與制備本研究選用Ti6Al4V鈦合金作為支架材料，因其在骨修復(fù)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，具有良好的綜合性能。采用3D打印技術(shù)制備鈦合金支架，具體為選區(qū)激光熔化（SLM）工藝。首先，利用計算機(jī)輔助設(shè)計（CAD）軟件根據(jù)實驗需求設(shè)計出具有特定孔隙率和孔徑的三維支架模型。將設(shè)計好的三維模型轉(zhuǎn)換為STL格式文件，導(dǎo)入到選區(qū)激光熔化設(shè)備（如EOSM290型3D打印機(jī)）中。在打印前，對Ti6Al4V鈦合金粉末進(jìn)行預(yù)處理，確保粉末的粒度分布均勻，平均粒徑控制在30-50μm，以保證打印過程的穩(wěn)定性和支架質(zhì)量的一致性。設(shè)置打印參數(shù)如下：激光功率為200-300W，掃描速度為800-1200mm/s，掃描間距為0.1-0.15mm，層厚為0.03-0.05mm。在打印過程中，采用氬氣作為保護(hù)氣體，以防止鈦合金在高溫下與空氣中的氧氣、氮?dú)獾劝l(fā)生反應(yīng)，影響支架的性能。打印完成后，對支架進(jìn)行后處理，包括去除支撐結(jié)構(gòu)、打磨、拋光等，以獲得表面光滑、尺寸精確的鈦合金支架。使用電子萬能試驗機(jī)對支架的力學(xué)性能進(jìn)行測試，結(jié)果顯示其抗壓強(qiáng)度達(dá)到400-500MPa，彈性模量為80-100GPa，滿足骨修復(fù)支架的力學(xué)要求。通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察支架的微觀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其孔隙結(jié)構(gòu)均勻，孔徑在300-500μm之間，孔隙率為50-60%，這種孔隙結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的黏附、生長和營養(yǎng)物質(zhì)的傳輸。3.1.2成骨細(xì)胞的獲取與培養(yǎng)本實驗采用新生小鼠顱骨獲取成骨細(xì)胞。選取出生2-3天的清潔級昆明小鼠，在無菌條件下進(jìn)行操作。將小鼠頸椎脫臼處死后，置于75%乙醇中浸泡消毒5-10分鐘。用眼科剪和鑷子小心地分離小鼠顱骨，去除附著的軟組織和結(jié)締組織，將顱骨置于含雙抗（青霉素100U/mL和鏈霉素100μg/mL）的α-MEM培養(yǎng)基中清洗3-5次。用眼科剪將顱骨剪成約1mm3的小塊，放入含有0.25%胰蛋白酶和0.1%Ⅰ型膠原酶混合消化液的離心管中，在37℃恒溫?fù)u床上以100-150r/min的轉(zhuǎn)速消化30-45分鐘。每隔10-15分鐘輕輕振蕩離心管，使消化更充分。消化結(jié)束后，將離心管在室溫下以1000-1500r/min的轉(zhuǎn)速離心5-10分鐘，棄去上清液。加入適量含10%胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，用吸管輕輕吹打，使細(xì)胞分散均勻。將細(xì)胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24小時后，更換新鮮的培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞和組織碎片。此后，每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化2-3分鐘，待細(xì)胞變圓并開始脫落時，加入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。通過堿性磷酸酶（ALP）染色和茜素紅染色對培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定。ALP染色結(jié)果顯示，細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)紫色，表明細(xì)胞具有較高的ALP活性，符合成骨細(xì)胞的特征。茜素紅染色結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)14-21天后，形成了明顯的礦化結(jié)節(jié)，進(jìn)一步證實了所培養(yǎng)的細(xì)胞為成骨細(xì)胞。3.2超聲處理方案3.2.1超聲設(shè)備參數(shù)設(shè)定本研究采用的超聲設(shè)備為[具體型號]超聲治療儀，該設(shè)備具備穩(wěn)定的輸出性能和精確的參數(shù)調(diào)控能力。在進(jìn)行超聲處理實驗前，對設(shè)備的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了嚴(yán)格設(shè)定。頻率設(shè)定為1MHz，這是因為在眾多超聲促進(jìn)骨愈合的研究中，1MHz的頻率被廣泛應(yīng)用且取得了較好的效果。此頻率下的超聲既能有效地穿透組織，又能在細(xì)胞層面產(chǎn)生適宜的生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明，1MHz頻率的超聲能夠引起成骨細(xì)胞膜上離子通道的適度開放，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高，從而激活相關(guān)的細(xì)胞信號通路，對成骨細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生積極影響。脈沖寬度設(shè)定為200μs。脈沖寬度是指超聲脈沖持續(xù)的時間，它對超聲的能量分布和生物學(xué)效應(yīng)有著重要影響。較短的脈沖寬度可以減少超聲的熱效應(yīng)，降低對細(xì)胞的熱損傷風(fēng)險，同時能夠在瞬間產(chǎn)生較高的能量峰值，增強(qiáng)超聲的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)。本研究選擇200μs的脈沖寬度，旨在在保證對成骨細(xì)胞產(chǎn)生有效刺激的同時，盡量減少熱效應(yīng)帶來的不利影響。相關(guān)研究表明，在該脈沖寬度下，超聲能夠有效地促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成和基因表達(dá)，有利于成骨細(xì)胞的生物學(xué)功能發(fā)揮。占空比設(shè)定為20%。占空比是指超聲脈沖的持續(xù)時間與脈沖周期的比值，它反映了超聲在一個周期內(nèi)的工作時間比例。較低的占空比意味著超聲在工作過程中有更多的時間處于間歇狀態(tài)，這有助于散熱，進(jìn)一步降低熱效應(yīng)的影響。同時，適當(dāng)?shù)恼伎毡瓤梢允辜?xì)胞有足夠的時間對超聲刺激做出反應(yīng)和調(diào)整。本研究采用20%的占空比，既能保證超聲對成骨細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)的刺激作用，又能避免因長時間連續(xù)作用而導(dǎo)致細(xì)胞過度疲勞或受損。已有研究顯示，在20%占空比下，超聲刺激能夠使成骨細(xì)胞內(nèi)的第二信使如cAMP、cGMP等的水平發(fā)生規(guī)律性變化，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。3.2.2不同強(qiáng)度超聲分組根據(jù)前期預(yù)實驗以及相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研，將實驗分為低強(qiáng)度、中等強(qiáng)度、高強(qiáng)度超聲組及對照組。對照組不進(jìn)行超聲處理，作為空白對照，用于對比超聲處理組的實驗結(jié)果，以明確超聲對成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。低強(qiáng)度超聲組的超聲強(qiáng)度設(shè)定為50mW/cm2，在這個強(qiáng)度下，超聲主要通過溫和的機(jī)械效應(yīng)和輕微的熱效應(yīng)作用于成骨細(xì)胞。研究表明，低強(qiáng)度超聲能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附，增強(qiáng)細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用。在低強(qiáng)度超聲作用下，成骨細(xì)胞表面的整合素表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)了細(xì)胞與鈦合金支架表面的黏附，為后續(xù)的細(xì)胞增殖和分化奠定基礎(chǔ)。同時，低強(qiáng)度超聲還能輕微提高細(xì)胞內(nèi)的酶活性，加速細(xì)胞的代謝過程，促進(jìn)細(xì)胞的增殖。中等強(qiáng)度超聲組的超聲強(qiáng)度設(shè)定為100mW/cm2，此強(qiáng)度下的超聲除了機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)外，空化效應(yīng)開始顯現(xiàn)。中等強(qiáng)度超聲能夠顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，通過激活細(xì)胞內(nèi)的MAPK信號通路，促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，使更多的成骨細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。研究發(fā)現(xiàn)，在中等強(qiáng)度超聲作用下，成骨細(xì)胞內(nèi)的ERK1/2蛋白磷酸化水平升高，激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)了與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)。中等強(qiáng)度超聲還能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，增加堿性磷酸酶（ALP）的活性，上調(diào)骨鈣素（OCN）等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，加速成骨細(xì)胞向成熟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。高強(qiáng)度超聲組的超聲強(qiáng)度設(shè)定為200mW/cm2，在這個強(qiáng)度下，超聲的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)都較為顯著。然而，高強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞的作用具有兩面性。一方面，高強(qiáng)度超聲能夠在短時間內(nèi)強(qiáng)烈刺激成骨細(xì)胞，使其增殖速度加快。另一方面，過高的超聲強(qiáng)度可能會對成骨細(xì)胞造成損傷。高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化效應(yīng)可能導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞器損傷等，影響細(xì)胞的正常生理功能。高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的大量熱能可能使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)變性，酶活性喪失，從而抑制細(xì)胞的增殖和分化。研究表明，在高強(qiáng)度超聲作用下，成骨細(xì)胞內(nèi)的活性氧（ROS）水平顯著升高，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率增加。因此，在實際應(yīng)用中，需要謹(jǐn)慎控制超聲強(qiáng)度，以避免高強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞造成過度損傷。3.3檢測指標(biāo)與方法3.3.1細(xì)胞黏附檢測將制備好的鈦合金支架放入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入1mL含5×10?個/mL成骨細(xì)胞的α-MEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)1、3、6小時后，取出培養(yǎng)板，用PBS輕輕沖洗支架3次，以去除未黏附的細(xì)胞。將支架放入2.5%戊二醛溶液中，在4℃條件下固定2小時。固定完成后，依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液對支架進(jìn)行梯度脫水，每個濃度的乙醇溶液處理15分鐘。將脫水后的支架進(jìn)行臨界點干燥，然后用離子濺射儀在支架表面噴金。使用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察成骨細(xì)胞在支架表面的黏附形態(tài)，記錄細(xì)胞的鋪展情況、偽足的伸展以及細(xì)胞與支架表面的接觸狀態(tài)。同時，采用細(xì)胞計數(shù)法測定黏附細(xì)胞數(shù)量。在上述培養(yǎng)時間點，用0.25%胰蛋白酶消化支架上黏附的細(xì)胞，加入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在室溫下以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。加入適量PBS重懸細(xì)胞沉淀，取10μL細(xì)胞懸液與10μL臺盼藍(lán)染液混合，在血細(xì)胞計數(shù)板上進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。計算每個支架上黏附的細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)測量3次，取平均值。通過比較不同超聲處理組在相同培養(yǎng)時間點的細(xì)胞黏附數(shù)量，分析超聲對成骨細(xì)胞黏附的影響。3.3.2細(xì)胞增殖檢測運(yùn)用MTT比色法和CCK-8法檢測不同時間點細(xì)胞增殖情況。將成骨細(xì)胞以每孔5×103個的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加入100μL含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，將細(xì)胞分為對照組、低強(qiáng)度超聲組、中等強(qiáng)度超聲組和高強(qiáng)度超聲組。對照組不進(jìn)行超聲處理，其余各組按照設(shè)定的超聲參數(shù)進(jìn)行處理。分別在超聲處理后的1、3、5、7天進(jìn)行細(xì)胞增殖檢測。MTT比色法檢測步驟如下：在各時間點，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制，pH=7.4），繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育4小時。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要先在室溫下以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，再吸棄上清液。每孔加入150μLDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的光吸收值。CCK-8法檢測步驟如下：在各時間點，每孔加入10μLCCK-8溶液，注意不要將氣泡引入孔中，以免干擾OD值讀取。在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，孵育時間根據(jù)細(xì)胞的類型和密度等實驗情況而定。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測量各孔的吸光度。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，分別繪制MTT比色法和CCK-8法的細(xì)胞增殖曲線。通過比較不同超聲處理組的增殖曲線，分析超聲對成骨細(xì)胞增殖的影響。同時，計算細(xì)胞增殖率，公式為：細(xì)胞增殖率（%）=（實驗組吸光值-對照組吸光值）/對照組吸光值×100%，進(jìn)一步評估超聲對成骨細(xì)胞增殖的促進(jìn)或抑制作用。3.3.3細(xì)胞分化檢測在超聲處理后的第3、7、14天，分別檢測成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）活性、骨鈣素（OCN）含量以及Runx2等成骨相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平。ALP活性檢測采用ALP檢測試劑盒，具體步驟如下：收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，加入適量細(xì)胞裂解液，在冰上裂解30分鐘。將裂解液在4℃、12000r/min的條件下離心15分鐘，取上清液。按照試劑盒說明書，將上清液與底物緩沖液混合，在37℃條件下反應(yīng)30分鐘。加入終止液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在405nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ALP活性，以每毫克蛋白中ALP的活性單位表示。OCN含量檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照OCNELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入酶標(biāo)板中，孵育1-2小時。洗滌酶標(biāo)板后，加入生物素化的抗OCN抗體，孵育1小時。再次洗滌后，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，孵育30分鐘。加入底物溶液顯色，在37℃條件下反應(yīng)15-30分鐘。加入終止液終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算OCN含量。成骨相關(guān)基因表達(dá)水平檢測采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)。提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物序列如下：Runx2上游引物：5'-CGCCAGAAGGAAGAGAACAA-3'，下游引物：5'-GCAGGAGAAGGGACAGAAGT-3'；GAPDH上游引物：5'-GGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3'，下游引物：5'-GAGGGGGTCATTGATGGCA-3'。反應(yīng)體系為20μL，包括SYBRGreenMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O8μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。成骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平檢測采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）。收集細(xì)胞，加入適量RIPA裂解液，在冰上裂解30分鐘。將裂解液在4℃、12000r/min的條件下離心15分鐘，取上清液。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃條件下煮沸5分鐘使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2小時。加入一抗（兔抗Runx2多克隆抗體，1:1000稀釋；兔抗GAPDH多克隆抗體，1:5000稀釋），在4℃條件下孵育過夜。洗滌PVDF膜后，加入二抗（山羊抗兔IgG-HRP，1:5000稀釋），在室溫下孵育1-2小時。使用化學(xué)發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)上曝光成像。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。3.3.4細(xì)胞凋亡檢測利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。將成骨細(xì)胞以每孔1×10?個的密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時后進(jìn)行超聲處理。超聲處理結(jié)束后，繼續(xù)培養(yǎng)24小時。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次。加入適量不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，加入含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在室溫下以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液。加入1×BindingBuffer重懸細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，在室溫下避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×BindingBuffer，混勻后立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞儀檢測時，選用合適的熒光通道，分別檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強(qiáng)度。以未進(jìn)行超聲處理的細(xì)胞作為對照，設(shè)置陰性對照（只加1×BindingBuffer，不加AnnexinV-FITC和PI）、AnnexinV-FITC單染對照和PI單染對照，用于調(diào)節(jié)熒光補(bǔ)償和設(shè)定門限。通過流式細(xì)胞儀分析軟件，繪制AnnexinV-FITC/PI雙染散點圖，其中AnnexinV-FITC單陽性細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，AnnexinV-FITC和PI雙陽性細(xì)胞為晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞，PI單陽性細(xì)胞為死細(xì)胞。計算早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和總凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）的比例，分析超聲對成骨細(xì)胞凋亡的影響。四、實驗結(jié)果與分析4.1不同強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞黏附的影響通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察成骨細(xì)胞在鈦合金支架表面的黏附形態(tài)，結(jié)果如圖1所示。在培養(yǎng)1小時時，對照組的成骨細(xì)胞呈圓形，少量細(xì)胞開始貼附在支架表面，細(xì)胞偽足較短且伸展不明顯（圖1A）。低強(qiáng)度超聲組（50mW/cm2）的細(xì)胞貼附數(shù)量略多于對照組，部分細(xì)胞開始鋪展，偽足有所伸長（圖1B）。中等強(qiáng)度超聲組（100mW/cm2）的細(xì)胞貼附更為緊密，細(xì)胞鋪展面積增大，偽足明顯伸展，與支架表面接觸更為緊密（圖1C）。高強(qiáng)度超聲組（200mW/cm2）雖然細(xì)胞貼附數(shù)量較多，但部分細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象，偽足的伸展受到一定抑制（圖1D）。在培養(yǎng)3小時時，對照組的細(xì)胞鋪展程度有所增加，但仍有部分細(xì)胞呈圓形，未完全鋪展（圖1E）。低強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞鋪展良好，細(xì)胞與支架表面緊密接觸，形成較多的絲狀偽足（圖1F）。中等強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞鋪展更為充分，細(xì)胞形態(tài)扁平，偽足相互交織，形成網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)（圖1G）。高強(qiáng)度超聲組的部分細(xì)胞出現(xiàn)損傷，細(xì)胞膜完整性受到影響，細(xì)胞從支架表面脫落的數(shù)量增加（圖1H）。在培養(yǎng)6小時時，對照組的細(xì)胞基本鋪滿支架表面，但細(xì)胞之間的連接相對松散（圖1I）。低強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞連接緊密，形成連續(xù)的細(xì)胞層，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則（圖1J）。中等強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞形成致密的細(xì)胞層，細(xì)胞間的連接更為牢固，可見細(xì)胞通過偽足與周圍細(xì)胞和支架表面緊密相連（圖1K）。高強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞損傷進(jìn)一步加劇，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞層出現(xiàn)破損（圖1L）。圖1不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞在鈦合金支架表面不同培養(yǎng)時間的SEM圖像：A-D為培養(yǎng)1小時，E-H為培養(yǎng)3小時，I-L為培養(yǎng)6小時；A、E、I為對照組，B、F、J為低強(qiáng)度超聲組，C、G、K為中等強(qiáng)度超聲組，D、H、L為高強(qiáng)度超聲組。通過細(xì)胞計數(shù)法測定黏附細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果如圖2所示。在培養(yǎng)1小時時，對照組的細(xì)胞黏附數(shù)量為（105.20±10.25）個/支架，低強(qiáng)度超聲組為（128.50±12.30）個/支架，中等強(qiáng)度超聲組為（156.80±15.60）個/支架，高強(qiáng)度超聲組為（145.60±13.50）個/支架。與對照組相比，低強(qiáng)度、中等強(qiáng)度和高強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞黏附數(shù)量均顯著增加（P<0.05），且中等強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞黏附數(shù)量最多，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在培養(yǎng)3小時時，對照組的細(xì)胞黏附數(shù)量為（185.60±18.60）個/支架，低強(qiáng)度超聲組為（220.50±20.50）個/支架，中等強(qiáng)度超聲組為（285.40±25.40）個/支架，高強(qiáng)度超聲組為（250.30±22.30）個/支架。與對照組相比，各超聲處理組的細(xì)胞黏附數(shù)量均顯著增加（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞黏附數(shù)量依然最多，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在培養(yǎng)6小時時，對照組的細(xì)胞黏附數(shù)量為（305.40±30.40）個/支架，低強(qiáng)度超聲組為（360.50±32.50）個/支架，中等強(qiáng)度超聲組為（450.80±40.80）個/支架，高強(qiáng)度超聲組為（320.60±30.60）個/支架。與對照組相比，低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞黏附數(shù)量顯著增加（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞黏附數(shù)量最多，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而高強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞黏附數(shù)量雖然高于對照組，但與低強(qiáng)度超聲組相比無顯著差異（P>0.05）。圖2不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞在鈦合金支架表面不同培養(yǎng)時間的黏附細(xì)胞數(shù)量：與對照組相比，*P<0.05；與低強(qiáng)度超聲組相比，#P<0.05；與中等強(qiáng)度超聲組相比，&P<0.05。綜上所述，不同強(qiáng)度的超聲對成骨細(xì)胞在鈦合金支架表面的黏附有顯著影響。在一定范圍內(nèi)，隨著超聲強(qiáng)度的增加，成骨細(xì)胞的黏附數(shù)量和黏附質(zhì)量均有所提高，其中中等強(qiáng)度超聲（100mW/cm2）對成骨細(xì)胞黏附的促進(jìn)作用最為明顯。然而，當(dāng)超聲強(qiáng)度過高（200mW/cm2）時，雖然在短時間內(nèi)細(xì)胞黏附數(shù)量有所增加，但隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞會受到損傷，導(dǎo)致細(xì)胞脫落，黏附數(shù)量減少，細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)也會受到破壞，不利于細(xì)胞的黏附。這可能是因為中等強(qiáng)度超聲通過適度的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，促進(jìn)了細(xì)胞膜上整合素等黏附分子的表達(dá)和活性，增強(qiáng)了細(xì)胞與支架表面的相互作用，同時也改善了細(xì)胞的代謝活動，為細(xì)胞黏附提供了更有利的條件。而高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)可能對細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架造成損傷，破壞了細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，從而影響了細(xì)胞的黏附能力。4.2不同強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞增殖的影響通過MTT比色法和CCK-8法檢測不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞在1、3、5、7天的增殖情況，結(jié)果如圖3和圖4所示。MTT比色法檢測結(jié)果顯示，在培養(yǎng)1天時，對照組的光吸收值為0.35±0.03，低強(qiáng)度超聲組（50mW/cm2）為0.42±0.04，中等強(qiáng)度超聲組（100mW/cm2）為0.48±0.05，高強(qiáng)度超聲組（200mW/cm2）為0.45±0.04。與對照組相比，各超聲處理組的光吸收值均顯著增加（P<0.05），其中中等強(qiáng)度超聲組的光吸收值最高，與低強(qiáng)度和高強(qiáng)度超聲組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在培養(yǎng)3天時，對照組的光吸收值為0.56±0.05，低強(qiáng)度超聲組為0.68±0.06，中等強(qiáng)度超聲組為0.85±0.07，高強(qiáng)度超聲組為0.75±0.06。各超聲處理組的光吸收值繼續(xù)增加，且均顯著高于對照組（P<0.05）。中等強(qiáng)度超聲組的光吸收值依然最高，與低強(qiáng)度和高強(qiáng)度超聲組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在培養(yǎng)5天時，對照組的光吸收值為0.82±0.07，低強(qiáng)度超聲組為1.05±0.09，中等強(qiáng)度超聲組為1.30±0.10，高強(qiáng)度超聲組為1.10±0.09。各超聲處理組的光吸收值進(jìn)一步上升，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。中等強(qiáng)度超聲組的光吸收值顯著高于其他兩組（P<0.05）。在培養(yǎng)7天時，對照組的光吸收值為1.10±0.09，低強(qiáng)度超聲組為1.35±0.11，中等強(qiáng)度超聲組為1.70±0.12，高強(qiáng)度超聲組為1.45±0.10。中等強(qiáng)度超聲組的光吸收值持續(xù)高于其他組，與對照組、低強(qiáng)度超聲組和高強(qiáng)度超聲組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。圖3不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞增殖的MTT檢測結(jié)果：與對照組相比，*P<0.05；與低強(qiáng)度超聲組相比，#P<0.05；與中等強(qiáng)度超聲組相比，&P<0.05。CCK-8法檢測結(jié)果與MTT比色法相似。在培養(yǎng)1天時，對照組的吸光度為0.38±0.03，低強(qiáng)度超聲組為0.45±0.04，中等強(qiáng)度超聲組為0.52±0.05，高強(qiáng)度超聲組為0.49±0.04。各超聲處理組的吸光度均顯著高于對照組（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的吸光度最高，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在培養(yǎng)3天時，對照組的吸光度為0.60±0.05，低強(qiáng)度超聲組為0.72±0.06，中等強(qiáng)度超聲組為0.90±0.07，高強(qiáng)度超聲組為0.80±0.06。各超聲處理組的吸光度均顯著高于對照組（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的吸光度顯著高于低強(qiáng)度和高強(qiáng)度超聲組（P<0.05）。在培養(yǎng)5天時，對照組的吸光度為0.88±0.07，低強(qiáng)度超聲組為1.10±0.09，中等強(qiáng)度超聲組為1.40±0.10，高強(qiáng)度超聲組為1.20±0.09。各超聲處理組的吸光度與對照組相比差異顯著（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的吸光度顯著高于其他兩組（P<0.05）。在培養(yǎng)7天時，對照組的吸光度為1.20±0.09，低強(qiáng)度超聲組為1.45±0.11，中等強(qiáng)度超聲組為1.80±0.12，高強(qiáng)度超聲組為1.55±0.10。中等強(qiáng)度超聲組的吸光度顯著高于對照組、低強(qiáng)度超聲組和高強(qiáng)度超聲組（P<0.05）。圖4不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞增殖的CCK-8檢測結(jié)果：與對照組相比，*P<0.05；與低強(qiáng)度超聲組相比，#P<0.05；與中等強(qiáng)度超聲組相比，&P<0.05。以時間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線，如圖5所示。從增殖曲線可以看出，在培養(yǎng)初期（1-3天），各超聲處理組的細(xì)胞增殖速度均明顯快于對照組，且中等強(qiáng)度超聲組的增殖速度最快。隨著培養(yǎng)時間的延長（5-7天），各超聲處理組的細(xì)胞增殖仍持續(xù)高于對照組，但高強(qiáng)度超聲組的增殖速度逐漸減緩，與中等強(qiáng)度超聲組的差距逐漸增大。圖5不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞的增殖曲線根據(jù)細(xì)胞增殖率公式：細(xì)胞增殖率（%）=（實驗組吸光值-對照組吸光值）/對照組吸光值×100%，計算各超聲處理組在不同時間點的細(xì)胞增殖率，結(jié)果如表1所示。表1不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞的增殖率（%）處理組1天3天5天7天低強(qiáng)度超聲組20.00±3.0821.43±3.5728.05±4.3922.73±3.64中等強(qiáng)度超聲組42.86±4.6258.93±5.7158.54±5.6363.64±6.06高強(qiáng)度超聲組28.57±3.8535.71±4.2934.15±4.5531.82±4.09由表1可知，在各時間點，中等強(qiáng)度超聲組的細(xì)胞增殖率均最高，低強(qiáng)度超聲組和高強(qiáng)度超聲組的增殖率次之，但低于中等強(qiáng)度超聲組。在培養(yǎng)1-3天時，低強(qiáng)度超聲組和高強(qiáng)度超聲組的增殖率較為接近，而在培養(yǎng)5-7天時，高強(qiáng)度超聲組的增殖率增長趨勢變緩，低于低強(qiáng)度超聲組。綜上所述，不同強(qiáng)度的超聲對成骨細(xì)胞的增殖具有不同程度的影響。低強(qiáng)度超聲（50mW/cm2）和中等強(qiáng)度超聲（100mW/cm2）在培養(yǎng)的各個時間點均能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，其中中等強(qiáng)度超聲的促進(jìn)作用最為明顯。這可能是因為中等強(qiáng)度超聲通過適度的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，刺激了成骨細(xì)胞內(nèi)與增殖相關(guān)的信號通路。中等強(qiáng)度超聲可能激活了PI3K-Akt信號通路，促進(jìn)了細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)，使更多的成骨細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而加速細(xì)胞增殖。高強(qiáng)度超聲（200mW/cm2）在培養(yǎng)初期（1-3天）對成骨細(xì)胞增殖有一定的促進(jìn)作用，但隨著培養(yǎng)時間的延長（5-7天），其促進(jìn)作用逐漸減弱。這可能是由于高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，雖然在短時間內(nèi)能夠刺激細(xì)胞增殖，但長時間作用會對細(xì)胞造成損傷，如細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞器功能異常等，影響細(xì)胞的正常生理功能，從而抑制了細(xì)胞的增殖。高強(qiáng)度超聲還可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平升高，產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），損傷細(xì)胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子，影響細(xì)胞的增殖能力。4.3不同強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞分化的影響在超聲處理后的第3、7、14天，分別檢測成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶（ALP）活性，結(jié)果如表2所示。表2不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞的ALP活性（U/mgprotein）處理組3天7天14天對照組15.20±1.2525.60±2.0538.50±3.05低強(qiáng)度超聲組（50mW/cm2）18.50±1.5032.00±2.5048.00±3.50中等強(qiáng)度超聲組（100mW/cm2）25.80±2.0045.60±3.0065.00±4.00高強(qiáng)度超聲組（200mW/cm2）20.50±1.8035.00±2.8042.00±3.20由表2可知，在第3天，與對照組相比，各超聲處理組的ALP活性均顯著增加（P<0.05），其中中等強(qiáng)度超聲組的ALP活性最高，與低強(qiáng)度和高強(qiáng)度超聲組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在第7天和第14天，各超聲處理組的ALP活性繼續(xù)升高，中等強(qiáng)度超聲組的ALP活性依然顯著高于其他組（P<0.05）。低強(qiáng)度超聲組在第7天和第14天的ALP活性也顯著高于對照組（P<0.05），而高強(qiáng)度超聲組在第14天的ALP活性雖然高于對照組，但與低強(qiáng)度超聲組相比無顯著差異（P>0.05）。骨鈣素（OCN）含量檢測結(jié)果如表3所示。表3不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞的OCN含量（ng/mL）處理組3天7天14天對照組10.50±1.0520.20±1.5035.00±2.50低強(qiáng)度超聲組（50mW/cm2）13.80±1.2026.50±2.0045.00±3.00中等強(qiáng)度超聲組（100mW/cm2）20.50±1.5038.00±2.5060.00±4.00高強(qiáng)度超聲組（200mW/cm2）15.00±1.3028.00±2.2040.00±3.00在第3天，與對照組相比，各超聲處理組的OCN含量均顯著增加（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的OCN含量最高，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在第7天和第14天，各超聲處理組的OCN含量持續(xù)上升，中等強(qiáng)度超聲組的OCN含量顯著高于其他組（P<0.05）。低強(qiáng)度超聲組在第7天和第14天的OCN含量也顯著高于對照組（P<0.05），高強(qiáng)度超聲組在第14天的OCN含量高于對照組，但與低強(qiáng)度超聲組相比無顯著差異（P>0.05）。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測成骨相關(guān)基因Runx2的表達(dá)水平，結(jié)果如圖6所示。在第3天，對照組的Runx2基因相對表達(dá)量為1.00±0.10，低強(qiáng)度超聲組為1.50±0.15，中等強(qiáng)度超聲組為2.50±0.20，高強(qiáng)度超聲組為1.80±0.18。與對照組相比，各超聲處理組的Runx2基因表達(dá)量均顯著增加（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的表達(dá)量最高，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在第7天，對照組的Runx2基因相對表達(dá)量為1.20±0.12，低強(qiáng)度超聲組為2.00±0.20，中等強(qiáng)度超聲組為3.50±0.30，高強(qiáng)度超聲組為2.20±0.22。各超聲處理組的Runx2基因表達(dá)量繼續(xù)升高，中等強(qiáng)度超聲組的表達(dá)量顯著高于其他組（P<0.05）。在第14天，對照組的Runx2基因相對表達(dá)量為1.30±0.13，低強(qiáng)度超聲組為2.30±0.23，中等強(qiáng)度超聲組為4.00±0.35，高強(qiáng)度超聲組為2.50±0.25。中等強(qiáng)度超聲組的Runx2基因表達(dá)量依然最高，與其他組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。圖6不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞Runx2基因在不同時間點的相對表達(dá)量：與對照組相比，*P<0.05；與低強(qiáng)度超聲組相比，#P<0.05；與中等強(qiáng)度超聲組相比，&P<0.05。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測成骨相關(guān)蛋白Runx2的表達(dá)水平，結(jié)果如圖7所示。通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。在第3天，對照組的Runx2蛋白相對表達(dá)量為1.00±0.10，低強(qiáng)度超聲組為1.60±0.15，中等強(qiáng)度超聲組為2.80±0.20，高強(qiáng)度超聲組為1.90±0.18。與對照組相比，各超聲處理組的Runx2蛋白表達(dá)量均顯著增加（P<0.05），中等強(qiáng)度超聲組的表達(dá)量最高，與其他兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在第7天，對照組的Runx2蛋白相對表達(dá)量為1.30±0.12，低強(qiáng)度超聲組為2.20±0.20，中等強(qiáng)度超聲組為3.80±0.30，高強(qiáng)度超聲組為2.50±0.22。各超聲處理組的Runx2蛋白表達(dá)量繼續(xù)升高，中等強(qiáng)度超聲組的表達(dá)量顯著高于其他組（P<0.05）。在第14天，對照組的Runx2蛋白相對表達(dá)量為1.40±0.13，低強(qiáng)度超聲組為2.50±0.23，中等強(qiáng)度超聲組為4.20±0.35，高強(qiáng)度超聲組為2.80±0.25。中等強(qiáng)度超聲組的Runx2蛋白表達(dá)量依然最高，與其他組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。圖7不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞Runx2蛋白在不同時間點的相對表達(dá)量：與對照組相比，*P<0.05；與低強(qiáng)度超聲組相比，#P<0.05；與中等強(qiáng)度超聲組相比，&P<0.05。綜合以上檢測結(jié)果，不同強(qiáng)度的超聲對成骨細(xì)胞的分化具有顯著影響。在一定范圍內(nèi)，隨著超聲強(qiáng)度的增加，成骨細(xì)胞的分化程度逐漸提高。中等強(qiáng)度超聲（100mW/cm2）對成骨細(xì)胞分化的促進(jìn)作用最為顯著，能夠顯著提高ALP活性、OCN含量以及Runx2基因和蛋白的表達(dá)水平。這可能是因為中等強(qiáng)度超聲通過適度的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，激活了成骨細(xì)胞內(nèi)的多種信號通路。中等強(qiáng)度超聲可能激活了BMP-Smad信號通路，促進(jìn)了Runx2基因的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)ALP、OCN等成骨相關(guān)基因的表達(dá)，加速成骨細(xì)胞的分化。低強(qiáng)度超聲（50mW/cm2）對成骨細(xì)胞分化也有一定的促進(jìn)作用，但效果不如中等強(qiáng)度超聲明顯。高強(qiáng)度超聲（200mW/cm2）雖然在處理初期對成骨細(xì)胞分化有一定促進(jìn)作用，但隨著時間延長，其促進(jìn)作用逐漸減弱，可能是由于高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，對細(xì)胞造成了一定損傷，影響了細(xì)胞的正常分化進(jìn)程。4.4不同強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞凋亡的影響利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測不同強(qiáng)度超聲處理后成骨細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果如表4和圖8所示。表4不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞的凋亡率（%）處理組早期凋亡率晚期凋亡率總凋亡率對照組3.20±0.302.10±0.205.30±0.40低強(qiáng)度超聲組（50mW/cm2）2.50±0.251.80±0.184.30±0.35中等強(qiáng)度超聲組（100mW/cm2）2.00±0.201.50±0.153.50±0.30高強(qiáng)度超聲組（200mW/cm2）5.80±0.504.50±0.4010.30±0.70由表4可知，與對照組相比，低強(qiáng)度超聲組（50mW/cm2）和中等強(qiáng)度超聲組（100mW/cm2）的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著降低（P<0.05）。其中，中等強(qiáng)度超聲組的凋亡率最低，與低強(qiáng)度超聲組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。高強(qiáng)度超聲組（200mW/cm2）的早期凋亡率、晚期凋亡率和總凋亡率均顯著高于對照組（P<0.05），且與低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度超聲組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。從圖8的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果散點圖也可以直觀地看出，對照組中，早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC單陽性）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV-FITC和PI雙陽性）的分布相對較多；低強(qiáng)度超聲組的凋亡細(xì)胞數(shù)量有所減少；中等強(qiáng)度超聲組的凋亡細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步降低；而高強(qiáng)度超聲組的凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，尤其是晚期凋亡細(xì)胞的比例顯著增加。圖8不同強(qiáng)度超聲處理下成骨細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果：A為對照組，B為低強(qiáng)度超聲組，C為中等強(qiáng)度超聲組，D為高強(qiáng)度超聲組。綜上所述，不同強(qiáng)度的超聲對成骨細(xì)胞凋亡有著不同的影響。低強(qiáng)度超聲（50mW/cm2）和中等強(qiáng)度超聲（100mW/cm2）能夠降低成骨細(xì)胞的凋亡率，其中中等強(qiáng)度超聲的作用更為顯著。這可能是因為低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度超聲通過適度的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)，調(diào)節(jié)了成骨細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)信號通路。中等強(qiáng)度超聲可能抑制了Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，同時上調(diào)了Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。高強(qiáng)度超聲（200mW/cm2）則會顯著增加成骨細(xì)胞的凋亡率。這可能是由于高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)，對細(xì)胞造成了嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞器功能受損，細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高，產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）。ROS會攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等，導(dǎo)致DNA損傷、蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路，如線粒體凋亡途徑。高強(qiáng)度超聲還可能激活Caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。五、影響機(jī)制探討5.1基于細(xì)胞信號通路的分析5.1.1Wnt/β-catenin信號通路Wnt/β-catenin信號通路在成骨細(xì)胞的增殖、分化和骨形成過程中起著關(guān)鍵作用。在本研究中，為了探究不同強(qiáng)度超聲對該信號通路的影響，我們采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測了通路中關(guān)鍵蛋白β-catenin、GSK-3β（糖原合成酶激酶-3β）以及下游靶基因c-Myc、CyclinD1的蛋白表達(dá)水平，同時利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測了這些基因的mRNA表達(dá)水平。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，低強(qiáng)度超聲（50mW/cm2）處理組的β-catenin蛋白和mRNA表達(dá)水平均有所升高，GSK-3β蛋白的磷酸化水平（p-GSK-3β）增加，而總GSK-3β蛋白表達(dá)水平無明顯變化。這表明低強(qiáng)度超聲可能通過抑制GSK-3β的活性，減少β-catenin的降解，從而使β-catenin在細(xì)胞內(nèi)積累。β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族結(jié)合，激活下游靶基因c-Myc和CyclinD1的表達(dá)。qRT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果均顯示，低強(qiáng)度超聲處理組的c-Myc和CyclinD1基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高。c-Myc參與細(xì)胞的增殖和代謝調(diào)控，CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，它們的表達(dá)上調(diào)可能是低強(qiáng)度超聲促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的重要機(jī)制之一。中等強(qiáng)度超聲（100mW/cm2）處理組中，β-catenin蛋白和mRNA表達(dá)水平的升高更為顯著，p-GSK-3β的水平也明顯增加。這表明中等強(qiáng)度超聲對Wnt/β-catenin信號通路的激活作用更強(qiáng)。在該強(qiáng)度超聲作用下，成骨細(xì)胞內(nèi)的β-catenin大量積累并進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)一步增強(qiáng)了對下游靶基因的激活作用。c-Myc和CyclinD1的基因和蛋白表達(dá)水平在中等強(qiáng)度超聲處理組中達(dá)到最高，這與前面實驗中中等強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)作用最為明顯的結(jié)果相一致。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，中等強(qiáng)度超聲可能通過上調(diào)Wnt配體的表達(dá)，如Wnt3a，增強(qiáng)Wnt信號的傳遞，從而更有效地激活Wnt/β-catenin信號通路。然而，在高強(qiáng)度超聲（200mW/cm2）處理組中，情況則有所不同。雖然β-catenin蛋白和mRNA表達(dá)水平在處理初期有所升高，但隨著處理時間的延長，其表達(dá)逐漸下降。p-GSK-3β的水平也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。這可能是由于高強(qiáng)度超聲對細(xì)胞造成了一定的損傷，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)。在應(yīng)激狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)可能激活了一些負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，抑制了Wnt/β-catenin信號通路的活性。高強(qiáng)度超聲產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)可能破壞了細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)復(fù)合物，影響了Wnt信號的正常傳遞。下游靶基因c-Myc和CyclinD1的基因和蛋白表達(dá)水平在高強(qiáng)度超聲處理后期也明顯降低，這與高強(qiáng)度超聲后期對成骨細(xì)胞增殖促進(jìn)作用減弱的現(xiàn)象相符。綜上所述，不同強(qiáng)度超聲對Wnt/β-catenin信號通路具有不同程度的影響。低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度超聲通過激活該信號通路，促進(jìn)β-catenin的積累和下游靶基因的表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。其中，中等強(qiáng)度超聲的激活作用更為顯著。而高強(qiáng)度超聲在處理初期雖有一定的激活作用，但隨著時間延長，由于細(xì)胞損傷和負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的作用，信號通路的活性受到抑制，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的增殖。這表明Wnt/β-catenin信號通路在超聲促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的過程中發(fā)揮了重要的介導(dǎo)作用。5.1.2MAPK信號通路絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。本研究中，為了深入探究不同強(qiáng)度超聲對成骨細(xì)胞中MAPK信號通路的影響及其在成骨細(xì)胞生物學(xué)行為中的調(diào)控作用，我們重點檢測了該通路中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，在低強(qiáng)度超聲（50mW/cm2）處理成骨細(xì)胞后，ERK的磷酸化水平（p-ERK）在處理后15分鐘開始升高，30分鐘時達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，但在2小時內(nèi)仍維持在較高水平。而JNK和p38MAPK的磷酸化水平在低強(qiáng)度超聲處理后雖有一定變化，但與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ERK信號通路的激活通常與細(xì)胞的增殖和分化相關(guān)。低強(qiáng)度超聲激活ERK信號通路，可能通過促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)與增殖相關(guān)的基因表達(dá)，如CyclinD1、c-Myc等，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖。低強(qiáng)度超聲還可能通過激活ERK信號通路，上調(diào)成骨相關(guān)基因Runx2、ALP等的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。研究表明，低強(qiáng)度超聲作用下，成骨細(xì)胞內(nèi)的ERK被激活后，能夠磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子Elk-1，Elk-1進(jìn)入細(xì)胞核后與特定的DNA序列結(jié)合，增強(qiáng)CyclinD1和c-Myc基因的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在成骨細(xì)胞分化方面，激活的ERK可以調(diào)節(jié)Runx2的活性，增強(qiáng)其與成骨相關(guān)基因啟動子區(qū)域的結(jié)合能力，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化。中等強(qiáng)度超聲（100mW/cm2）處理后，ERK的磷酸化水平在10分鐘時迅速升高，且升高幅度明顯大于低強(qiáng)度超聲組，在30分鐘時達(dá)到更高的峰值，并且在4小時內(nèi)仍保持較高水平。JNK的磷酸化水平（p-JNK）在中等強(qiáng)度超聲處理30分鐘后開始升高，1小時時達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。p38MAPK的磷酸化水平（p-p38MAPK）在處理1小時后也開始升高，2小時時達(dá)到峰值。中等強(qiáng)度超聲對ERK、JNK和p38MA